CHAPITRE 1 : Introduction générale

Table des matières

Les bactéries lactiques sont utilisées dans de nombreux produits laitiers dont les laits fermentés, les fromages et les yogourts. Elles contribuent à la texture, à la saveur des aliments ainsi qu’à la production de composés aromatiques. Les bactéries lactiques inhibent la prolifération de micro-organismes par la production de composés inhibiteurs telles les bactériocines (Piard et Desmazeaud, 1991, 1992) et en abaissant le pH par la production d’acide lactique (Gilliland, 1985b).

Les ferments lactiques sont traditionnellement produits par fermentation discontinue appelée également fermentation «batch» (Gilliland, 1985b). L’accumulation de produits toxiques, principalement l’acide lactique non dissocié et le lactate, est un facteur important limitant la production de levains lactiques par cette technologie. Les cultures en continu permettent d’éviter ce problème par l’emploi de taux de dilution adéquats mais présentent des risques importants de contamination et de perte d’activité enzymatique. D’autre part, en culture mixte, les interactions entre les souches peuvent conduire à l’élimination d’une ou plusieurs souches dans le bioréacteur (Hugenholtz et Veldkamp, 1985).

La fabrication en continu de ferments lactiques par des cellules immobilisées est prometteuse. En effet, cette technologie permet d’augmenter la productivité grâce aux opérations en continu, à la haute densité cellulaire maintenue dans les réacteurs et à la réutilisation des biocatalyseurs (Groboillot et al., 1994). En outre, l’importante concentration de biomasse dans les billes augmente les vitesses de réaction et limite les risques de contamination (Champagne et al., 1994). De plus, l’immobilisation cellulaire augmente la stabilité plasmidique (D’Angio et al., 1994; Huang et al., 1996) et, dans l’immobilisation de différentes bactéries lactiques, permet d’obtenir un équilibre stable entre les populations relarguées (Sodini-Gallot et al., 1995; Lamboley, 1998).

Les bifidobactéries sont des bactéries probiotiques qui, une fois ingérées en quantité suffisante dans l’organisme, exercent des effets bénéfiques pour la santé allant au-delà des vertues nutritives de base (Schaafsma, 1996). L’incorporation de telles bactéries dans les produits laitiers fermentés intéresse par conséquent grandement les industriels mais leur faible compétitivité en culture mixte est un frein au développement de nouveaux produits. L’immobilisation cellulaire dans des billes de gel de polysaccharide pourrait être une solution pour l’incorporation de souches de bifidobactéries dans les ferments traditionnels. Cette technique permet, par la forte croissance bactérienne dans les billes et les tensions intrinsèques qu’elle provoque, les forces de cisaillement dans le réacteur agité et les nombreuses collisions entre billes, la fuite des bactéries immobilisées à la surface des billes dans le milieu liquide. Afin d’évaluer le potentiel d’un tel système pour produire des cultures lactiques contenant des bifidobactéries, le suivi spécifique d’une souche de bifidobactérie en culture mixte avec une souche de lactocoque utilisée couramment dans les ferments traditionnels doit être effectué dans le cadre d’une production avec cellules immobilisées d’un ferment probiotique modèle composé de deux souches.

Par ailleurs, si les conditions de fermentation (pH, température, nature de la base, composition du milieu) sur la production de ferments en culture discontinue ont été étudiées (Gilliland, 1985b), l’influence de ces paramètres sur le comportement des cellules immobilisées en culture mixte en fermentation continue a très peu été rapportée (Lamboley, 1998). Ce procédé s’est révélé approprié pour la production de ferments de composition et activité contrôlées et a montré une haute stabilité biologique (Lamboley, 1998). Cependant, un phénomène de contamination croisée dans les billes immobilisant à l’origine des cultures pures et résultant de la dynamique microbienne complexe du système a été mis en évidence lors de cette étude. Ce phénomène avait été observé dans le même temps lors de la pré-acidification en continu du lait (Sodini et al., 1997).

Par conséquent, un des objectifs de ce travail a été de démontrer et d’étudier, lors de la production de ferments en continu avec une culture mixte immobilisée, la contamination croisée des billes dans un système modèle composé d’une souche compétitive ( Lactococcus lactis ssp. lactis biovar. diacetylactis ) et d’une souche non compétitive ( Bifidobacterium longum ) immobilisées séparément dans des billes de gel de κ-carraghénane/gomme de caroube. En effet, la compréhension des phénomènes de relargage cellulaire des bactéries de la périphérie des billes de gel dans le milieu externe et de contamination croisée est fondamentale dans l’optique d’une application industrielle des cultures mixtes immobilisées afin de produire en continu des ferments de composition voulue. La dynamique de redistribution des souches qui se produit dans les billes doit être comprise et contrôlée car les bactéries immobilisées constituent le réservoir de biomasse qui sert à la production de ferment.

L’immobilisation cellulaire résulte en des modifications physiologiques et morphologiques par rapport aux cellules en suspension. Certaines études très récentes se sont concentrées sur l’impact de l’immobilisation cellulaire sur des caractéristiques aussi diverses que la tolérance aux produits du métabolisme bactérien et aux produits de nettoyage (Krishnan et al., 2001; Trauth et al., 2001). Des modifications morphologiques ont par ailleurs été également observées avec différents micro-organismes (Kiy et Tiedtke, 1993; Krishnan et al., 2001; Bergmaier, 2002). Cependant, aucune étude n’a, à ce jour, été rapportée sur les conséquences de l’immobilisation cellulaire sur des caractéristiques technologiques de souches importantes pour la production de ferments lactiques, ainsi que sur les caractéristiques probiotiques des bifidobactéries.

Ainsi, le dernier objectif de ce travail a visé à étudier certaines caractéristiques physiologiques des cellules immobilisées dans des billes de gel de polysaccharide lorsqu’elles sont cultivées sur de longues périodes pour la production de ferments lactiques modèles. Des cellules de B. longum et de L. diacetylactis produites lors de fermentations ‘batch’ conventionnelles avec cellules libres et lors de fermentation continue avec cellules immobilisées ont été comparées pour leur tolérance à différents stress. Dans ce but d’importantes propriétés technologiques des souches telles que la résistance à la lyophilisation, au peroxyde d’hydrogène et à la nisine mais également des caractéristiques probiotiques telles que la survie au tractus gastro-intestinal simulé et la tolérance aux antibiotiques ont été étudiées.

Les bactéries lactiques sont des cellules procaryotes, hétérotrophes et chimio-organotrophes. Elles sont Gram +, généralement immobiles, asporulées et ont des exigences nutritionnelles complexes pour les acides aminés, les peptides, les vitamines, les sels, les acides gras et les glucides fermentescibles (Dellaglio et al., 1994).

Il est possible de les classer suivant la nature des produits du métabolisme bactérien obtenus à partir des glucides. En effet les bactéries homolactiques strictes produisent uniquement de l’acide lactique, alors que les bactéries hétérolactiques peuvent produire de l’acide acétique, de l’éthanol et du CO2 en plus de l’acide lactique.

Onze genres bactériens figurent dans la catégorie des bactéries lactiques : Aerococcus , Alloicoccus , Carnobacterium , Enterococcus , Lactobacillus , Lactococcus , Leuconostoc , Pediococcus , Streptococcus , Tetragenococcus et Vagococcus . Les bactéries du genre Bifidobacterium ne sont pas considérées comme des bactéries lactiques typiques, mais leur usage se répand en industrie laitière.

Les bactéries lactiques sont utilisées pour la fermentation d’un grand nombre de produits d’origine animale ou végétale. Seuls les cinq genres Bifidobacterium , Lactobacillus , Lactococcus, Leuconostoc et Streptococcus sont communément propagés dans les salles à ferments des industries laitières ou employés dans la fermentation lactique des produits laitiers en Amérique du Nord (Champagne, 1998). Le rôle principal des bactéries lactiques est la production d’acide lactique qui influence la texture, le goût et la qualité microbiologique du fromage. En effet, la production d’acide facilite la coagulation des protéines par la présure ainsi que la synérèse. L’abaissement du pH limite aussi la croissance des bactéries indésirables (Gilliland, 1985a). Enfin, la production d’acide lactique intervient également sur le goût des produits fermentés, soit directement dans les produits frais, soit indirectement en agissant sur les activités enzymatiques pendant l’affinage.

Les bactéries lactiques tolèrent de petites quantités d’oxygène, mais de trop grandes teneurs peuvent leur être néfastes. Ceci peut probablement être relié au peroxyde d’hydrogène (H2O2) qui est produit dans les cellules en présence d’air. Le H2O2 doit être éliminé sinon son accumulation devient toxique. Le système le plus efficace d’élimination du H2O2 est une enzyme nommée catalase dont les bactéries lactiques sont déficientes. Les bactéries lactiques possèdent plutôt une peroxydase, moins efficace que la catalase. Ainsi, comme les bactéries lactiques n’éliminent pas facilement le peroxyde, elles sont considérées comme micro-aérophiles.

Les bactéries lactiques aromatisantes comme Lactococcus lactis ssp. lactis biovar. diacetylactis produisent des composés aromatisants qui contribuent au goût des produits frais et à la production de CO2 responsable d’ouvertures dans le fromage. Enfin, certaines bactéries lactiques produisent des exopolysaccharides qui influencent l’aspect et la texture des produits fermentés, ainsi que du peroxyde d’hydrogène et des bactériocines inhibant la croissance de bactéries indésirables.

La découverte des bifidobactéries remonte au début du siècle lorsque Henri Tissier les a isolées de selles d'enfants nourris au lait maternel (Tissier, 1900). Les bifidobactéries sont des bâtonnets à Gram positif aux formes variées, non motiles, non sporulants et en général anaérobes strictes qui composent la presque totalité (85 à 99%) de la flore intestinale d’un enfant. Ces bactéries jouent un rôle majeur dans l’équilibre et la stabilité de la flore intestinale, d’où l’appellation de culture probiotique (Hekmat et McMahon, 1992). Une diminution des bifidobactéries au profit des clostridies, des lactobacilles, des streptocoques et des entérobactéries est cependant observée tout au long de la vie. De plus, les espèces et les biovariétés typiques de l’adulte remplacent celles de l’enfant. Ces modifications seraient en partie imputables à l’évolution du régime alimentaire (Gournier-Chateau et al., 1994).

Parmi les 32 espèces de bifidobactéries répertoriées, 10 sont considérées comme étant d’origine humaine, alors que les autres sont isolées dans les matières fécales d’animaux divers (Curk et al., 1994). B. longum , B. bifidum , B. infantis et B. breve ont été les plus étudiées à cause de leur aptitude à fermenter le lait ou à être incorporées dans les aliments (Modler et al., 1990; Hekmat et McMahon, 1992; Blanchette et al., 1996; Shah, 1997; Gobetti et al., 1998; Rosenthal et Bernstein, 1998; Stanton et al., 1998). Les conditions optimales de croissance des bifidobactéries se situent à des températures comprises entre 37°C et 41°C, et à des valeurs de pH comprises entre 6.5 et 7. Aucune croissance n’est observée à des températures inférieures à 25°C et supérieures à 45°C et à des valeurs de pH inférieures à 4.5 ou supérieures à 8.5. Les bifidobactéries produisent de l’acide acétique et de l’acide lactique dans un ratio molaire théorique de 3 : 2 en métabolisant une grande variété d’hexoses par le cycle du fructose-6-phosphate (Scardovi, 1986).

Depuis une dizaine d’années, un intérêt considérable s’est développé autour de l’utilisation de cultures lactiques à effets bénéfiques pour la santé ou "probiotiques" ( Bifidobacterium, Lactobacillus ) pour des applications alimentaires, pharmaceutiques ou encore en alimentation animale. Dans la majorité des cas, les produits laitiers tels les yoghourts, laits fermentés, fromages, laits en poudre et crèmes glacées ont été choisis comme véhicules privilégiés des cultures probiotiques. La propagation des bifidobactéries est cependant problématique du fait de leur grande sensibilité à l’oxygène, de leur faible tolérance aux acides issus de leur métabolisme et de leurs exigences nutritionnelles (Modler et al., 1990). L’utilisation du terme probiotique remonte à 1965 et fait référence à toute substance ou organisme qui contribue à l’équilibre dans l’intestin (Lilly et Stillwell, 1965), principalement chez les animaux d’élevage. Plus récemment, les probiotiques ont été définis comme des organismes vivants qui, après ingestion en certaines quantités, exercent des effets bénéfiques pour la santé allant au-delà des vertus nutritives inhérentes de base (Schaafsma, 1996). Cette révision souligne la nécessité d’une population suffisante de micro-organismes vivants et indique précisément que les bienfaits peuvent être une amélioration de l’équilibre microbien aussi bien que d’autres effets sur l’organisme, immunomodulateurs par exemple.

Les bifidobactéries, hôtes naturels des intestins de l’homme et des animaux à sang chaud, ont des propriétés nutritionnelles et thérapeutiques aujourd’hui reconnues. En effet, parmi ces effets, on note le contrôle de la flore intestinale et l’inhibition de la croissance de nombreux pathogènes et bactéries putréfiantes, la régulation du transit intestinal, l’amélioration de l’intolérance au lactose et des allergies alimentaires aux caséines laitières, certaines propriétés anticancérigènes, anticholestérolémiques et antidiarrhéiques ainsi qu’une stimulation du système immunitaire (Modler et al., 1990; Gournier-Chateau et al., 1994; Salminen et Saxelin, 1996; Tannock, 1997).

Cependant, pour exercer une influence positive sur l’organisme, les bactéries lactiques probiotiques doivent survivre en quantité suffisante au passage à travers le tractus digestif supérieur pour pouvoir coloniser l’intestin. Des travaux in vitro effectués lors d’une étude portant sur l’incorporation de bifidobactéries dans des yogourts glacés ont montré que les cellules pouvaient résister pendant deux heures à une concentration en sels biliaires de 0.45%, mais pas à de l’acide chlorhydrique 0.1 N (Holcomb et al., 1991). Il semblerait toutefois que la résistance à l’environnement stomacal dépende de la souche de bifidobactéries utilisée, certaines souches pouvant résister jusqu’à 90 minutes à pH 3 (Berrada et al., 1991). Des différences marquées de tolérance aux conditions présentes lors de la digestion ont par ailleurs été observées parmi six souches de Lactobacillus acidophilus et neuf souches de bifidobactéries (Lankaputhra et Shah, 1995). Les résistances aux sels biliaires et à l’acidité des sucs gastriques constituent par conséquent deux caractéristiques importantes à prendre en compte lors de la sélection des cultures probiotiques pour une utilisation dans les produits laitiers fermentés.

D’autre part, une propriété importante des bactéries probiotiques réside dans leur capacité à adhérer aux parois intestinales. En effet, ceci leur confère une compétitivité avantageuse dans le but de résider à long terme dans le gros intestin. Lactobacillus casei GG a ainsi exprimé in vitro des facteurs d’adhérence qui permettent à cette souche de multiples interactions avec les cellules épithéliales humaines (Elo et al., 1991).

Depuis une époque immémoriale, l’Homme a mis à profit les principes de la fermentation afin de conserver ses aliments, qu’ils soient à base de lait, de viande, de fruits ou de légumes. En fait, bien avant que l’on soupçonne leur présence, les micro-organismes étaient employés pour la fabrication de produits fermentés, tels la choucroute, le yogourt et les fromages.

En fromagerie par exemple, l’acidification s’effectuait à partir du lait cru qu’on laissait fermenter spontanément par des bactéries qui avaient contaminé le lait à la ferme ou à la fromagerie. Vers la fin du XIXème siècle, certains chercheurs démontrèrent qu’il était possible de fabriquer des produits de qualité constante en utilisant des cultures pures de micro-organismes. Actuellement, on définit les levains ou ferments lactiques comme étant des cultures pures ou des mélanges de bactéries lactiques sélectionnées et utilisées pour la fabrication de produits fermentés. Parmi ces cultures, on distingue les ferments naturels, souvent des mélanges de nombreuses souches de bactéries dont la composition exacte est indéterminée des ferments mixtes, composés de cinq ou six souches soigneusement sélectionnées et cultivées séparément jusqu’au stade de culture mère ou de ferment. Au cours de la fermentation, les bactéries se multiplient et produisent des composés conférant à l’aliment ses propriétés organoleptiques comme l’acidité, la saveur, l’arôme et la texture.

Les bactéries lactiques sont traditionnellement propagées en cuve fermée, par fermentation discontinue ou «batch» (Gilliland, 1985b). Dans ce cas, le milieu de culture est initialement ensemencé et n’est pas renouvelé jusqu’à la fin de la fermentation. Le principal facteur limitant la production de ferments lactiques par cette technique réside dans l’accumulation de produits toxiques du métabolisme bactérien, principalement l’acide lactique non dissocié et le lactate. En effet, même avec un milieu de culture encore suffisamment riche et des conditions de température et de pH favorables, la présence de ces composés à une certaine concentration inhibe la croissance des bactéries lactiques. Cette technique peut être utilisée pour propager des cultures pures ou mixtes. Dans ce dernier cas, le contrôle de la population de chacune des souches est plus délicat mais il permet une réduction des besoins d’équipement par rapport au mode de propagation en cultures pures suivi d’un mélange pour obtenir la culture mixte désirée.

Les fermentations continues utilisent des systèmes dans lesquels la cuve est continuellement alimentée en milieu de culture frais alors que le milieu fermenté est retiré avec le même débit. Cette technologie est encore peu utilisée en milieu industriel mais offre de nombreux avantages comparativement aux cultures discontinues. Elle permet en effet d’éviter le problème d’accumulation de produits inhibiteurs par l’emploi de taux de dilution adéquats et d’augmenter la productivité de l’installation. Cependant, les risques de contamination sont plus importants et, en culture mixte, les interactions entre les souches et leur différente compétitivité peuvent conduire rapidement à l’élimination d’une ou plusieurs souches dans le bioréacteur. Par ailleurs, les cultures continues nécessitent des équipements plus complexes ainsi qu’un travail en aval adapté.

Bien que le premier lait fermenté par des bifidobactéries ait été mis sur le marché il y a près de 50 ans, le domaine des aliments probiotiques ne s’est développé que dans les années 1970 (Tamime et al., 1995). En 1997, plus de 70 produits laitiers industriels tels que des laits fermentés, du fromage blanc, du babeurre et des desserts surgelés contenaient des bactéries probiotiques, dont plus de la moitié au Japon (Shah, 1997). Aujourd’hui, les marques LC1 (Nestlé), Vifit (Campina Melkunie), Actimel (Danone) et Yakult ont émergé comme des chefs de fil dans les yogourts et laits fermentés probiotiques (Stanton et al., 2001). Par ailleurs, les laits fermentés ‘AB milk’ et ‘Cultura’ contenant L. acidophilus et B. bifidum sont très populaires au Danemark (Tamime et al., 1995). D’autres produits comme les yogourts acidophilus-bifidus (contenant L. acidophilus et B. bifidum , ou B. longum et les ferments du yogourt), les laits ‘Bifidus’ ( B. bifidum ou B. longum ), ‘Biogarde’ ( L. acidophilus , B. bifidum et S. thermophilus ), ‘Biomild’ ( L. acidophilus et Bifidobacterium spp.) en Allemagne et les laits ‘Diphilus’ ( L. acidophilus et B. bifidum ) et ‘Ophilus’ ( L. acidophilus , B. bifidum , et S. thermophilus , ou L. acidophilus , B. bifidum , et L. cremoris ) en France ne sont que quelques exemples de l’utilisation variée des bifidobactéries comme bactéries probiotiques dans des ferments mixtes en combinaison avec L. acidophilus ou les ferments du yogourt ( L. bulgaricus et S. thermophilus ) (Tamime et al., 1995). Les bifidobactéries peuvent être utilisées seules mais sont souvent associées à des bactéries lactiques pour des raisons organoleptiques et technologiques (Saloff-Coste, 1997). De plus, la présence de bactéries protéolytiques, en particulier L. bulgaricus , favorise la croissance des bifidobactéries.

Cependant, pour la production du ferment mixte probiotique, les bifidobactéries ne peuvent pas être propagées conjointement aux bactéries lactiques en raison de leur faible compétitivité en culture mixte. Ainsi, pour assurer une quantité de bactéries probiotiques suffisante dans les produits fermentés, les ferments probiotiques commerciaux consistent en des cultures pures de bifidobactéries mélangées aux cultures lactiques au moment de la fabrication du produit ou encore directement ajoutées au produit fermenté à la concentration finale recherchée. Cette limite économique et matérielle justifie le développement d’une nouvelle technologie de production de culture mixte contenant des souches plus ou moins compétitives.

Alors que les bactéries lactiques sont principalement sélectionnées pour leurs activités acidifiantes et protéolytiques dans les ferments classiques, d’autres propriétés doivent être étudiées dans le cas des probiotiques. Pour exercer leur effet bénéfique sur la santé, les probiotiques doivent, comme pour les ferments classiques, survivre en grand nombre au procédé de fabrication, à la lyophilisation éventuelle et à l’entreposage qui s’en suit. Il est en effet généralement admis qu’un nombre minimal de 107 cellules viables par gramme de produit est nécessaire pour exercer un effet probiotique (Ishibashi et Shimamura, 1993). Cependant, la stabilité physique et génétique des cellules ainsi que toutes les propriétés nécessaires pour exercer leurs bienfaits sur la santé doivent également être assurées. De plus, ces souches devraient être viables sans se multiplier pour ne pas provoquer d’effet indésirable sur le goût ou l’arôme du produit ni augmenter l’acidité (Mattila-Sandholm et al., 2002). Par ailleurs, plusieurs études ont démontré que des cellules en phase stationnaire de croissance, plus tolérantes aux stress environnementaux que des cellules en phase exponentielle, devraient être privilégiées pour la confection de produits contenant des probiotiques en grand nombre (Kolter, 1993; Hartke et al., 1994; Rallu et al., 1996; Heller, 2001). Les interactions possibles entre bactéries lactiques et probiotiques devraient également être prises en compte pour sélectionner la meilleure combinaison de souches afin d’optimiser le procédé et la survie cellulaire dans le produit entreposé (Vinderola et al., 2002).

Enfin, ces bactéries probiotiques devraient être capable de survivre en grand nombre aux conditions acides de l’estomac et aux sels biliaires de l’intestin lors de la consommation du produit, puis d’adhérer aux cellules épithéliales de l’intestin afin de produire les effets bénéfiques désirés le plus longtemps possible (Tamime et al, 1995).

Certaines études ont cependant montré que le consommation de probiotiques non-viables peut aussi engendrer des effets bénéfiques sur le système immunitaire (Ouwehand et Salminen, 1998; Salminen et al., 1999). Dans de tels cas, il suffit alors d’obtenir de grandes concentrations de probiotiques dans le produit durant la période initiale de production sans nécessairement conserver une bonne viabilité durant l’entreposage.

L’immobilisation cellulaire consiste à retenir et localiser des cellules microbiennes dans un espace précis du système de fermentation afin d’obtenir de hautes densités de biomasse active (Karel et al., 1985). Bien que cette technologie semble nouvelle dans l’industrie laitière, la production traditionnelle de kéfir repose sur ce principe (Champagne et al., 1994). En effet les grains de kéfir sont composés d’un mélange insoluble de levures et de bactéries lactiques servant à inoculer le lait et initier sa fermentation. Par la suite, les grains sont récupérés afin d’initier d’autres réactions. De nouveaux procédés utilisant la technologie des cellules immobilisées ont été étudiés pour les fermentations laitières comme par exemple l’inoculation-préfermentation continue du lait pour la production de fromage frais (Sodini et al., 1997) ou de yogourt (Prévost et al., 1985), et pour la production de ferments lactiques mésophiles (Lamboley, 1998).

Cette technologie, comparativement aux systèmes à cellules libres, permet d’augmenter la productivité grâce aux opérations en continu, à la haute densité cellulaire maintenue dans les réacteurs et à la réutilisation des biocatalyseurs (Groboillot et al., 1994). De plus, l’immobilisation cellulaire limite les risques de contamination (Champagne et al., 1994), augmente la stabilité plasmidique (D’Angio et al., 1994; Huang et al., 1996) et, dans l’immobilisation de différentes bactéries lactiques, permet d’obtenir un équilibre stable entre les populations relarguées (Sodini-Gallot et al., 1995).

Les différents moyens d’immobiliser des cellules bactériennes comprennent l’attachement à des surfaces, l’inclusion dans des matrices poreuses, la rétention derrière des barrières (membranes), la floculation et l’encapsulation. L’inclusion dans une matrice de polymère et l’utilisation de membranes sont actuellement les techniques les plus étudiées pour la production de ferments lactiques.

Le procédé d’immobilisation cellulaire le plus répandu consiste à inclure une culture bactérienne dans une matrice poreuse par la gélification d’une solution de polymère (κ-carraghénane, gomme de gellan, agarose, gélatine, alginate, chitosane). Ces polymères sont facilement disponibles et largement acceptés comme additifs alimentaires dans l’industrie. Comme les matrices d’immobilisation résultent en des limitations de transfert de masse, les billes de gel sont en général préférées aux films grâce à leur géométrie sphérique augmentant la surface (Groboillot et al., 1994). Les billes de gel sont produites en utilisant des méthodes d’extrusion ou d’émulsification suivies d’une étape de durcissement par abaissement de température ou l’ajout d’un agent gélifiant. Dans le cas de la méthode par extrusion, la solution liquide de polymère/culture bactérienne est extrudée par une seringue engendrant des gouttes sphériques qui tombent dans une solution de durcissement. La technique par émulsion fait par contre intervenir la dispersion de cette phase aqueuse de cellules/polymère dans une phase organique, résultant en un émulsion eau dans huile. Les gouttes aqueuses dispersées sont par la suite durcies par abaissement de température ou par l’ajout d’un agent gélifiant. La technique d’émulsion permet d’obtenir des billes de diamètre plus petits que par extrusion et est plus adaptée à la production industrielle à grande échelle (Groboillot et al., 1994).

Une technique d’immobilisation utilisant un biopolymère non toxique pour les bactéries lactiques et assurant un degré de viabilité et une productivité cellulaire élevés est essentielle pour la production de ferments en continu en utilisant des bactéries immobilisées. Les applications avec les bactéries lactiques font appel, en général, aux gels d’alginate ou de κ-carraghénane (Champagne et al., 1994). Le gel d’alginate est stabilisé par les ions Ca2+. Cependant ces ions peuvent être chélatés par les ions phosphates, lactates et citrates au cours de fermentations lactiques (Groboillot et al., 1994). Les gels de κ-carraghénane sont alors recommandés dans ces situations (Audet et al., 1988).

La technique d’immobilisation des cellules bactériennes par macroémulsion dans des billes de κ-carraghénane/gomme de caroube se fait dans des conditions douces et évite ainsi la destruction de l’activité des enzymes bactériennes (Audet et al., 1988; Audet et Lacroix, 1989; Lacroix et al., 1990; Artignan et al., 1997). Utilisé seul, le κ-carraghénane produit un gel fragile incapable de résister aux stress causés par la croissance bactérienne interne et le cisaillement dans le réacteur en agitation. Un effet synergique est observé avec la gomme de caroube (Lacroix et al., 1990). Une supplémentation en ions K+ donne des gels plus élastiques et rhéologiquement plus stables du fait d’une interaction spécifique entre le κ-carraghénane et les chaînes de galactomananes de la gomme de caroube (Arnaud et al., 1989). En assurant un relargage et donc une inoculation cellulaire en continu dans le milieu externe du fait de la nature poreuse du gel, l’immobilisation cellulaire dans des billes de κ-carraghénane / gomme de caroube permet l’obtention de hautes concentrations cellulaires dans le bioréacteur ainsi qu’un meilleur contrôle des fermentations en continu (Lamboley, 1998).

La performance de la biomasse immobilisée dans une matrice de gel dépend des cinétiques de réaction cellulaires, des transferts de masse interne et externe des substrats et des produits, ainsi que du relargage cellulaire de la surface des billes dans le milieu externe. Dans le cas des bactéries lactiques qui sont sensibles aux produits d’inhibition, les substrats, la concentration des produits et le profil de pH jouent un rôle prépondérant sur la productivité et sur la croissance des cellules immobilisées dans des billes de gel (Sayles et Ollis, 1990).

Le phénomène compétitif de diffusion-réaction explique la croissance cellulaire non uniforme dans les billes de gel colonisées (Montbouquette et al., 1990; Wijffels et al., 1991; Yabannavar et Wang, 1991). Une région de haute densité bactérienne est ainsi formée à la périphérie des billes où les conditions de croissance sont plus favorables (Arnaud et Lacroix, 1991). L’épaisseur et la concentration bactérienne de cette couche dépendent de la bactérie, de l’effet d’obstruction et des vitesses de diffusion dans la couche cellulaire ainsi que d’autres paramètres de fermentation tels que le pH, la concentration en substrats et en produits et la température. Par exemple, l’accumulation d’acide lactique fut responsable de la distribution hétérogène de la biomasse dans des billes d’alginate immobilisant Lactococcus lactis ssp. lactis biovar. diacetylactis lors de l’étude du co-métabolisme du lactose et du citrate (Cachon et Diviès, 1993). Par dissolution progressive de couches périphériques des billes de gel dans un tampon citrate, les auteurs déterminèrent qu’à l’état stationnaire, 95% de la biomasse se situait dans une couche de 125 μm d’épaisseur à la périphérie des billes dont la concentration (350 g/l) était 20 à 30 fois plus élevée qu’au centre des billes.

D’autres recherches ont démontré la formation progressive d’une couche cellulaire dense à la périphérie des billes durant des fermentations continues ou non avec des bactéries lactiques immobilisées dans des billes de gel. L’épaisseur de cette couche lors de l’immobilisation de Lactobacillus casei , estimée en microscopie optique, fut proche de 0.4 mm, ce qui représentait approximativement 84% du volume total des billes de 1.75 mm de diamètre (Arnaud et Lacroix, 1991). Lors de l’immobilisation de Streptococcus salivarius ssp. thermophilus dans des billes d’alginate, la dissolution progressive de couches périphériques des billes permit d’observer que 43 et 90% des cellules immobilisées se situaient dans une couche périphérique de 0.13 et 0.41 mm, correspondant à 28 et 70% respectivement du volume total des billes (Prévost et Diviès, 1988).

Lors de fermentations en continu avec des cellules de Lactobacillus casei ssp. casei immobilisées dans des billes de gel, des observations au microscope ont montré qu’il y a abrasion et rupture de la surface du gel. Ces tensions dans le gel, résultant de la croissance bactérienne ainsi que des effets du cisaillement et des collisions dans les réacteurs agités mécaniquement, provoquent la fuite des bactéries des cavités ouvertes vers le milieu de culture (Arnaud et al., 1992). Le relargage cellulaire est à la base du procédé à cellules immobilisées de fabrication de biomasse libre (Lamboley et al., 1997), de préfermentation du lait dans la fabrication de yogourt (Prévost et al., 1985; Prévost et Diviès, 1988) ou de fromage frais (Prévost et Diviès, 1987; Sodini-Gallot et al., 1995).

Le relargage cellulaire dépend de la taille des billes ainsi que de l’agitation du milieu (Sodini-Gallot et al., 1995). En effet, l’agitation favorise les phénomènes de diffusion vers la bille mais, par son effet mécanique, favorise également l’ouverture des cavités vers l’extérieur par l’augmentation des forces de cisaillement (Arnaud et al., 1993). Par contre, le relargage cellulaire est peu influencé par la densité cellulaire initiale dans les billes (Champagne et al., 1992). Le pH a un effet sur la croissance des bactéries lactiques dans les billes (Morin et al., 1992; Champagne et al., 1993; Norton et al., 1994) ainsi que sur le relargage cellulaire (Champagne et al., 1993). La composition du milieu de culture influence également la croissance des bactéries dans les billes et le relargage (Champagne et al., 1993). Influençant la composition du milieu externe en acide lactique et en nutriments, le taux de dilution appliqué lors de fermentations en continu avec cellules immobilisées affecte également la croissance des bactéries immobilisées (Gobbetti et Rossi, 1993; Audet et al., 1991; Champagne et al., 1994).

L’immobilisation peut modifier les interactions entre les différentes souches d’une culture mixte. En effet, deux souches de lactocoques compétitives en cellules libres se sont révélées coopérantes lorsqu’elles étaient immobilisées (Audet et al., 1995). Cependant, lorsque les cultures du yogourt ont été immobilisées et cultivées en mélange pour la préfermentation du lait, le ratio streptocoques/lactobacilles est resté stable (Prévost et al., 1985; Prévost et Diviès, 1988). Par contre, la modification du pH et du milieu de culture pouvait affecter ce même ratio (Champagne et al., 1993). De même, lors de l’utilisation d’une culture mixte de trois souches de lactocoques immobilisées pour la production de ferments en continu, les proportions des différentes populations sont restées stables sur une longue période malgré l’apparition du phénomène de contamination croisée (Lamboley et al., 1997). De plus, comme les différentes souches de lactocoques étaient affectées différemment par les conditions de fermentation (pH, température et taux de dilution), il était possible d’obtenir un ferment de composition déterminée en sélectionnant judicieusement ces conditions (Lamboley et al., 1997).

L’incorporation de bifidobactéries dans les produits laitiers fermentés se développe de plus en plus. En effet, des fromages probiotiques contenant des bifidobactéries ont par exemple déjà été rapportés (Daigle et al., 1999). Ainsi, de nouveaux ferments pour la fabrication de fromages, incluant des bactéries lactiques et des souches probiotiques, doivent être développés industriellement. Cependant, dans le but de produire des ferments de composition complexe contenant des souches de différentes compétitivités, l’influence des paramètres opérationnels sur les proportions des souches dans un procédé de fermentation en continu avec des cellules immobilisées n’a pas été rapportée. La résistance d’une souche non dominante immobilisée dans des billes à l’origine en culture pure dans une culture mixte compétitive et le phénomène de contamination croisée n’ont ainsi pas été étudiés.

Dans la présente étude, l’hypothèse est émise que la technologie des cellules immobilisées peut être utilisée avantageusement pour la production efficace de ferments lactiques mixtes contenant des bifidobactéries qui sont peu compétitives lorsqu’elles sont produites avec des bactéries lactiques par fermentation avec cellules libres (Baron et al., 2000; Smart et al., 1993). Le choix des souches dans cette étude ( B. longum et L. diacetylactis ) a ainsi été effectué dans le but d’étudier un système modèle comportant une souche compétitive utilisée communément dans les produits laitiers fermentés ( L. diacetylactis ) et une souche probiotique non compétitive ( B. longum ), de démontrer le phénomène de contamination croisée et d’en identifier les paramètres principaux. Le contrôle de la composition de la culture produite dans l’effluent et la stabilité du procédé sont également recherchés. Ainsi la composition de souches choisie n’a pas nécessairement une application directe en fermentation laitière.

L’immunofluorescence est une technique de détection de plus en plus utilisée, combinant l’immunologie et la fluorescence (Hansen et al., 1997; Ishiko et al., 1998; Veena et van Vuurde, 2002). Ainsi, des anticorps monoclonaux (Mutharia et Hancock, 1983; Para et Plouffe, 1983) ou polyclonaux (Hugenholtz et al., 1987) sont rendus fluorescents par ajout de molécules fluorescentes à leur structure sans altérer leur affinité et leur spécificité pour l’antigène. La fluorescence peut être directe, par marquage de l’anticorps spécifique développé, ou indirecte par l’utilisation d’un deuxième anticorps fluorescent reconnaissant un premier anticorps non fluorescent (Laan et al., 1988; Hunik et al., 1993). La méthode indirecte génère un signal fluorescent plus intense que la méthode directe puisque plusieurs anticorps peuvent se fixer sur le même anticorps primaire non fluorescent (Brock et Madigan, 1991).

L’utilisation de l’immunofluorescence pour détecter spécifiquement différentes souches d’une culture lactique mixte a déjà été rapportée (Hugenholtz et al., 1987). Dans cette étude, des anticorps ont été développés contre quatre souches de L. cremoris et marqués à la fluorescéine. La détection simultanée de deux souches en culture mixte faisait appel à l’immunofluorescence directe et indirecte. En effet, une des deux souches était détectée directement avec un anticorps marqué à la fluorescéine alors que la deuxième était détectée par l’ajout successif d’un premier anticorps spécifique non fluorescent et d’un deuxième anticorps fluorescent. Les deux souches étaient détectées simultanément après excitation à la même longueur d’onde (488 nm) puisque le même fluorochrome (la fluorescéine) était utilisée pour les deux souches. La différence d’intensité de fluorescence émise par les deux souches servait alors de moyen de discernement.

L’immunofluorescence indirecte a également été utilisée pour détecter spécifiquement Nitrobacter agilis et Nitrosomonas europaea co-immobilisés dans des billes de κ–carraghénane en utilisant un microscope à fluorescence classique (Hunik et al., 1993). Des anticorps spécifiques aux deux souches ont été utilisés en présence d’un deuxième anticorps marqué à la fluorescéine pour la visualisation en microscopie. Le deuxième anticorps utilisé étant identique pour les deux souches, la différenciation des deux souches dans une même bille était impossible. La détection spécifique a donc été réalisée sur des coupes minces de billes différentes. Cette méthode permet la détection spécifique de plusieurs souches en culture mixte mais ne permet pas de les visualiser sur le même échantillon, ce qui limite son application et augmente le nombre d’échantillons à analyser.

Afin d’éviter ces inconvénients, une méthode de détection spécifique par immunofluorescence de B. longum ATCC 15707 et de L. diacetylactis MD dans des billes de gel de κ-carraghénane/gomme de caroube a récemment été développée (Prioult et al., 2000). Lors de cette étude, des anticorps polyclonaux spécifiques aux deux souches, marqués chacun de fluorochromes différents, ont été obtenus. Cette technique, utilisant les fluorochromes ALEXA 488 et ALEXA 568, a par la suite permis de distinguer et localiser les deux souches à l’intérieur d’une même bille en microscopie confocale (Prioult et al., 2000). En effet, par l’excitation des deux fluorochromes à des longueurs d’onde différentes (488 nm pour B. longum (ALEXA 488) et 543 nm pour L. diacetylactis (ALEXA 568)), les souches ne sont visibles au microscope confocal que lorsque l’excitation des billes de gel se fait à la longueur d’onde correspondant au maximum d’intensité de chacun des deux fluorochromes.

Le marqueur fluorescent ALEXA 488 possède un spectre presque identique à celui de la fluorescéine mais les conjugués formés ALEXA 488-anticorps sont plus lumineux et plus stables que ceux formés avec la fluorescéine (ALEXA 488 labelling kit, Molecular Probes). Ses longueurs d’onde d’excitation et d’émission maximales sont respectivement à 491 et 515 nm (Figure 1.2). De plus, sa stabilité à la lumière et aux pH compris entre 4 et 10 permet une observation et une capture d’image facilitée. Sa structure chimique comprend trois noyaux aromatiques, un hétérocycle responsable de la fluorescence et un groupement ester succinimidyl responsable du couplage du fluorochrome avec l’anticorps (Figure 1.4).

Le marqueur fluorescent ALEXA 568 bénéficie des mêmes avantages que le fluorochrome ALEXA 488 mais possède des longueurs d’onde d’excitation et d’émission maximales à 573 et 596 nm (Figure 1.3). Sa structure chimique contient trois noyaux aromatiques, trois hétérocycles et un groupement ester succinimidyl (Figure 1.5).

Ainsi, le très faible chevauchement de spectres de ces deux fluorochromes a déjà permis de distinguer et localiser spécifiquement par un double marquage deux différentes souches à l’intérieur d’une même bille en microscopie confocale (Prioult et al., 2000).

Figure 1. 2 : Spectres d’excitation et d’émission du marqueur fluorescent ALEXA 488 (ALEXA 488 labelling kit, Molecular Probes)

Figure 1. 3 : Spectres d’excitation et d’émission du marqueur fluorescent ALEXA 568 (ALEXA 568 labelling kit, Molecular Probes)

Figure 1. 4 : Structure chimique du marqueur fluorescent ALEXA 488 (ALEXA 488 labelling kit, Molecular Probes)

Figure 1. 5 : Structure chimique du marqueur fluorescent ALEXA 568 (ALEXA 568 labelling kit, Molecular Probes)

La microscopie confocale (laser scanning confocal microscopy ou LSCM en anglais) est une forme particulière de microscopie dans laquelle un laser à une longueur d’onde précise excite seulement un certain plan focal d’un échantillon fluorescent. La source lumineuse est focalisée à une profondeur définie dans l’échantillon analysé et l’information de chaque point focal projetée contre le ″trou d’épingle″ (littéralement «pinhole») d’un détecteur. La source lumineuse et le ″trou d’épingle″ du détecteur sont les deux situés dans le plan focal de la lentille, d’où le terme de confocalité (Figure 1.6).

Figure 1. 6 : Arrangement optique du microscope confocal. La lentille objective fait le focus sur l’échantillon alors que la lentille de collecte transmet l’image d’un seul point focal à la fois au détecteur (detector) à travers le ″trou d’épingle″ (pinhole) (Blonk et van Aalst, 1993).

Par ce principe le bruit de fond dû à l’environnement tridimensionnel du point focal est minimisé (Figure 1.7). Comparé à un microscope conventionnel, le microscope confocal augmente la résolution latérale d’un facteur 1,4 (Blonk et van Aalst, 1993).

Figure 1. 7 : Faisceaux incidents et réfléchis de la lumière fluorescente dans un microscope confocal. Les lignes pleines indiquent le faisceau dans le plan focal alors que les traits représentent une onde hors focus non collectée (Blonk et van Aalst, 1993).

En scannant point par point tout le plan focal par synchronisation de la source lumineuse et du ″trou d’épingle″ du détecteur, une image est construite grâce à un logiciel informatique. Le ″sectionnement optique″ ou ″épaisseur de l’image″ dépend de la taille du ″trou d’épingle″ du détecteur ainsi que des caractéristiques de la lentille. En général pour les microscopes commerciaux, l’épaisseur du plan focal est d’environ 1 μm. Un agrandissement du ″trou d’épingle″ du détecteur augmente l’épaisseur de l’image avec comme extrême l’obtention d’un microscope conventionnel à ″trou d’épingle″ complètement ouvert.

Le principal avantage de la microscopie confocale réside donc dans la résolution en profondeur. En effet, avec les microscopes conventionnels, la lumière réfléchie des plans hors focus rend l’image obtenue plus floue. Le sectionnement optique répété d’un échantillon volumineux conjointement au focus fin effectué par le microscope confocal permettent d’obtenir une série de sections optiques à des distances choisies bien définies (limite d’environ 1 μm) les unes des autres dans un échantillon, et ceci sans découpes physiques qui pourraient endommager l’échantillon. Couplée à plusieurs lasers, la microscopie confocale permet ainsi la détection simultanée de plusieurs composés fluorescents dans des échantillons tridimensionnels. Enfin, les différentes vitesses de balayage offrent la possibilité d’obtenir des images de haute définition (Vodovotz et al., 1996).

L’immunofluorescence, combinée à la microscopie confocale, représente donc un outil performant pour suivre la dynamique microbienne et le phénomène de contamination croisée dans les billes de gel lors de la production de ferments mixtes à l’aide de cellules immobilisées.

La mise en évidence du phénomène de contamination croisée nécessite également le développement d’une méthode de quantification spécifique des différentes souches de la culture mixte à l’étude dans des billes de gel de polysaccharide.

La distribution spatiale de Nitrosomonas europaea et Nitrobacter agilis coimmobilisées dans des billes de κ-carraghénane à l’aide d’anticorps spécifiques fluorescents a déjà été observée (Hunik et al., 1993). À l’aide de cercles concentriques passant par la périphérie des billes, la fraction d’espace occupée par les bactéries a été déterminée en fonction de la profondeur dans les billes (exprimée en pourcentage d’occupation d’espace). Les inconvénients de cette méthode résident d’une part dans l’utilisation d’un même anticorps fluorescent greffé sur les anticorps spécifiques aux deux souches non fluorescents (et donc l’utilisation de deux coupes physiques pour détecter spécifiquement les deux souches) et, d’autre part, dans l’absence d’une corrélation entre la concentration bactérienne et la proportion de l’espace des billes de gel occupée par de la biomasse.

Récemment, une méthode de détection de Bifidobacterium longum et Lactococcus lactis ssp. lactis biovar. diacetylactis coimmobilisées dans des billes de gel a été développée (Prioult et al., 2000). Utilisant des anticorps polyclonaux spécifiques aux deux souches marqués chacun d’un fluorochrome différent, cette méthode permet de distinguer les deux souches dans le même échantillon. À cette étude s’est également ajoutée la quantification d’échantillons de plusieurs billes par ELISA (Enzyme Linked Immunosorbant Assay). À la différence des dénombrements sur milieux gélosés qui ne déterminent que la biomasse active, le test immunologique ELISA permet de quantifier la biomasse totale dans des billes et donc de servir de corrélation avec les images obtenues par immunofluorescence en microscopie confocale.

La relation entre les profils d’occupation de biomasse en fonction de la profondeur (pourcentage d’occupation) dans les billes déterminés par la méthode de Hunik et al. (1993) et la biomasse totale dans les billes de gel déterminée par ELISA (Prioult et al., 2000) permettra ainsi de déterminer, lors de fermentations avec des cellules immobilisées de Bifidobacterium longum et de Lactococcus lactis ssp. lactis biovar. diacetylactis , les concentrations bactériennes des deux souches en fonction de la profondeur dans les billes de gel. Le phénomène de contamination croisée dans les billes de gel sera ainsi localisé et quantifé.

L’immobilisation dans une matrice poreuse et les concentrations bactériennes potentiellement très élevées limitent la diffusion des nutriments ainsi que l’élimination des produits du métabolisme bactérien, tels les acides lactique et acétique dans le cas des lactocoques et des bifidobactéries. Les conditions environnantes des cellules libres et immobilisées sont donc très différentes et peuvent résulter en des comportements physiologiques et des morphologies cellulaires distinctes.

Plusieurs études récentes ont ainsi montré que la production de biomasse à l’aide de la technologie des cellules immobilisées peut induire des changements morphologiques et physiologiques. Une modification de la voie métabolique d’homofermentaire à hétérofermentaire a été observé lors d’une culture continue avec cellules immobilisées de Lactobacillus plantarum (Krishnan et al., 2001). Des changements physiologiques et morphologiques furent également observés lors de la production en continu d’exopolysaccharides (EPS) à l’aide de cellules immobilisées de L. rhamnosus RW-9595M (Bergmaier, 2002). Une diminution de la production d’EPS soluble fut observée dans le temps parallèlement à la formation d’aggrégats macroscopiques (1-2 mm), composés principalement de cellules viables et d’EPS non solubles. Cependant la faible production d’EPS dans l’effluent de la culture continue fut réversible et l’importante production d’EPS préalablement démontrée en cellules libres (1742 mg/l) fut recouvrée après quatre fermentations batch successives dont la première avait été inoculée par un échantillon de l’effluent de la fermentation continue avec cellules immobilisées (Bergmaier, 2002). Enfin, plusieurs auteurs ont observé une augmentation de la tolérance des cellules immobilisées aux produits d’inhibition (Fortin et Vuillemard, 1989; Texeira de Mattos et al., 1994; Krisch et Szajani, 1997), alcools (Holcberg and Margalith, 1981; Curtain, 1986), phénols (Keweloh et al., 1989; Heipieper et al., 1991, Diefenbach et al., 1992), antibiotiques (Jouenne et al., 1994) et aux produits de nettoyage (Trauth et al., 2001). Dans ces deux dernières études, l’immobilisation mais également la culture prolongée sur plusieurs jours permit d’améliorer la survie cellulaire au stress imposé (Jouenne et al., 1994; Trauth et al., 2001).