CHAPITRE 6 : Conclusion générale

L’hypothèse de ce travail était que l’utilisation de la technologie des cellules immobilisées permet de produire une culture lactique mixte modèle contenant une souche de bifidobactérie peu compétitive, qui soit équilibrée, stable et aux caractéristiques technologiques et probiotiques avantageuses.

Le but de cette étude était de caractériser d’un point de vue biologique les performances et la stabilité d’un procédé de fermentation continue utilisant des cellules immobilisées dans des billes de gel pour produire une culture mixte composée d’une souche compétitive de bactéries lactiques ( L. diacetylactis ) et d’une souche probiotique non compétitive ( B. longum ).

Pour cela, des fermentations batch et continues ont tout d’abord été réalisées avec une culture pure de Bifidobacterium longum ATCC 15707 libre ou immobilisée dans des billes de gel. Lors de la production continue de B. longum à l’aide de cellules immobilisées à pH (5,5) et température (37°C) constants, les concentrations cellulaires maximales dans l’effluent ont été obtenues pour un taux de dilution de 0.5 h-1. Cependant, la productivité volumique maximale a été obtenue pour le taux de dilution le plus élevé (D=2.0 h-1) et fut approximativement 9,5 fois plus élevée que par fermentation batch avec cellules libres. Ainsi, cette première étape a démontré que la technologie des cellules immobilisées peut être utilisée pour produire en continu une culture pure de bifidobactéries avec une productivité volumique élevée ainsi que de hautes concentrations cellulaires dans l’effluent de la fermentation continue même à des taux de dilution supérieurs au taux de croissance spécifique des bactéries.

Afin d’étudier les phénomènes microbiens complexes qui se déroulent dans les billes de gel lors de la production de cultures mixtes à l’aide de cellules immobilisées, une méthode utilisant des anticorps polyclonaux spécifiques et la microscopie confocale a été développée par la suite pour détecter et quantifier spécifiquement les deux souches de la culture mixte modèle étudiée ( L. diacetylactis MD et B. longum ATCC 15707) dans des billes de gel. La croissance bactérienne lors de fermentations batch successives avec des cultures pures et mixtes des deux souches a ainsi été observée préfèrentiellement dans des couches périphériques des billes de 200 et 300 μm pour L. diacetylactis and B. longum , là où les conditions de croissance sont les plus favorables. De plus, ces fermentations batch successives ont permis, par le choix de conditions de fermentations (température, milieu de culture) favorables pour la croissance des bifidobactéries, la production d’une culture lactique mixte contenant une souche peu compétitive ( B. longum ).

La production de cette culture mixte sur une période de 17 jours a été ensuite étudiée avec un système de fermentation continue composé d’un premier réacteur (R1) contenant des cellules des deux souches immobilisées séparément dans des billes de gel et d’un second réacteur (R2) opéré avec les cellules libres relarguées de R1. Une culture mixte concentrée a été produite avec un rapport de souches stable (22:1 L. diacetylactis / B. longum ) à 35°C dans l’effluent de R2, mais cette culture est rapidement débalancée en faveur de B. longum à 37°C ou de L. diacetylactis à 32°C.

Lors de cette même expérience, une redistribution des souches dans les billes immobilisant à l’origine une culture pure, appelée phénomène de contamination croisée et observée dans des travaux précédents par dénombrement sur géloses sélectives, a été observée en microscopie confocale. Cette contamination des billes par les cellules libres du milieu de culture environnant a été limitée à une couche périphérique des billes d’approximativement 100 μm d’épaisseur. À la fin de la fermentation, le rapport cellulaire (7:1 L. diacetylactis / B. longum ) dans l’effluent de R1 était identique à celui de billes individuelles, indépendemment de la souche immobilisée à l’origine dans les billes testées. Le fait que ce rapport cellulaire ait été identique dans les deux types de billes indique que presque toutes les cellules viables se situaient dans la couche périphérique des billes et que le centre des billes contenait principalement des cellules mortes à la fin de la fermentation.

Enfin, nous avons voulu étudier l’effet de la technologie de production de biomasse sur la tolérance des deux souches à différents stress technologiques et probiotiques que celles-ci peuvent subir durant la production, l’entreposage et leur consommation. Ainsi des cellules produites lors de fermentation en batch conventionnelles en cellules libres et lors d’une fermentation continue avec cellules immobilisées ont été comparées sur la base de leur tolérance à la lyophilisation, au peroxyde d’hydrogène, aux conditions gastro-intestinales simulées, aux antibiotiques et à la nisine. En général, la survie des cellules produites dans l’effluent de la fermentation continue avec cellules immobilisées aux différents tests a augmenté avec le temps de fermentation et était plus élevée après 3-6 jours de culture que celle de cellules libres conventionnelles. Cependant, lors de fermentations ‘batch’ successives inoculées avec des cellules prélevées dans l’effluent de la fermentation continue avec cellules immobilisées, la tolérance de B. longum acquise à plusieurs antibiotiques fut réversible, à l’inverse de L. diacetylactis .

Ces résultats, couplés aux productivités élevées, démontrent le potentiel de la technologie des cellules immobilisées pour élaborer des produits industriels contenant des probiotiques et des bactéries lactiques avec des caractéristiques améliorées et potentiellement bénéfiques pour la santé humaine. Néanmoins, une attention particulière devrait être portée sur la possible réversibilité de ces caractéristiques lors de l’incorporation ou de la croissance de ces cellules dans les produits laitiers. Ainsi, même si ce travail a mis en évidence des changements physiologiques majeurs des bactéries lactiques lors de fermentations en continu avec cellules immobilisées, l’utilisation de ces phénomènes pour des applications précises passera par une meilleure compréhension des causes ayant mené à ces observations et par une caractérisation plus poussée des cellules ainsi produites. Les conditions opérationnelles de fermentation (température, pH, temps de fermentation), la composition du milieu de culture, les souches cultivées, leur concentration et leurs interactions en culture mixte constituent autant de paramètres dont l’influence sur les modifications physiologiques des cellules immobilisées devra être comprise. Dans l’optique d’une utilisation industrielle, ll faudra alors effectuer les modifications adéquates en aval de la fermentation et principalement lors de la fabrication de produits laitiers fermentés contenant ces cellules aux caractéristiques physiologiques différentes de cellules libres produites de manière traditionnelle.

Ainsi il serait important d’étudier la production à l’aide de cellules immobilisées d’une culture mixte plus complexe que la culture modèle utilisée lors de ce travail, avec un intérêt industriel. Un milieu de culture plus économique et potentiellement moins favorable pour la croissance autant de bactéries lactiques que de bifidobactéries, comme par exemple les milieux à base de perméat de lactosérum, devrait remplacer le milieu à base de MRS. Enfin, une application industrielle de la technologie des cellules immobilisées pour la production de biomasse passe par une méthode de fabrication de billes de gel à grande échelle ou par l’utilisation de supports solides acceptés dans le domaine alimentaire.