Table des matières

Pour produire des ferments lactiques contenant des bifidobactéries par des cellules immobilisées, des fermentations ont été réalisées avec une culture pure de bifidobactéries ou en culture mixte avec une souche de lactocoques. Une méthode a été développée pour localiser et quantifier par immunofluorescence les deux souches dans des billes de gel. L’utilisation de cette méthode a permis d’observer une croissance bactérienne préférentielle à la périphérie des billes. La production continue de culture mixte a été étudiée avec un système composé d’un premier réacteur (R1) contenant les deux souches immobilisées séparément dans des billes de gel et d’un second réacteur (R2) opéré avec les cellules libres relarguées de R1. Une culture mixte concentrée de composition stable a été produite à 35°C dans l’effluent de R2. La redistribution des souches dans les billes fut observée en microscopie confocale. La résistance à différents stress des cellules libres produites dans l’effluent des deux réacteurs a augmenté avec le temps de fermentation.

Yann Doleyres Christophe Lacroix

Professeur

Pour étudier la production de ferments lactiques contenant des bifidobactéries à l’aide de cellules immobilisées, des fermentations batch et continues ont été réalisées avec une culture pure de Bifidobacterium longum ATCC 15707 ou en culture mixte avec Lactococcus lactis ssp. lactis biovar. diacetylactis MD. Lors de la production continue de B. longum à l’aide de cellules immobilisées à pH (5,5) et température (37°C) constants, les concentrations cellulaires maximales dans l’effluent ont été obtenues pour un taux de dilution de 0.5 h-1. Cependant, la productivité volumique maximale a été obtenue pour le taux de dilution le plus élevé (D=2.0 h-1) et fut approximativement 9,5 fois plus élevée que par fermentation batch avec cellules libres. Une nouvelle méthode utilisant des anticorps polyclonaux spécifiques et la microscopie confocale a été développée pour détecter et quantifier spécifiquement les deux souches dans des billes de gel. Avec cette méthode, la croissance bactérienne lors de fermentations batch successives fut observée préfèrentiellement dans des couches périphériques des billes de 200 et 300 μm pour L. diacetylactis and B. longum . La production de cette culture mixte fut ensuite étudiée avec un système de fermentation continue composé d’un premier réacteur (R1) contenant des cellules des deux souches immobilisées séparément dans des billes de gel et d’un second réacteur (R2) opéré avec les cellules libres relarguées de R1. Une culture mixte concentrée a été produite avec un rapport de souches stable (22:1 L. diacetylactis / B. longum ) à 35°C dans l’effluent de R2, mais la composition de la culture a été rapidement débalancée en faveur de B. longum à 37°C ou de L. diacetylactis à 32°C. La redistribution des souches dans les billes immobilisant à l’origine une culture pure fut observée dans une couche périphérique des billes de 100 μm. À la fin de la fermentation, le rapport cellulaire (7:1 L. diacetylactis / B. longum ) dans l’effluent de R1 était identique à celui de billes individuelles. La résistance à différents stress des cellules libres produites dans l’effluent des deux réacteurs a augmenté avec le temps de fermentation et était généralement plus élevée après 6 jours que celle de cellules produites lors de fermentations batch avec cellules libres.

Yann Doleyres Christophe Lacroix

Professeur

Cette thèse représente quatre années de travail durant lesquelles l'appui et l'aide de plusieurs personnes ont facilité ma tâche.

J'adresse ma reconnaissance à mon directeur, Christophe Lacroix, pour ses conseils scientifiques judicieux, sa disponibilité exceptionnelle et la liberté d'action qu'il m'a laissé tout au long de ce projet. Je tiens également à remercier mon codirecteur, Ismail Fliss, pour son intérêt porté à mon projet, son aide en immunologie et la mise à disposition de ses infrastructures.

Mes remerciements vont également au personnel et à mes collègues du Centre STELA ainsi qu'à ceux des laboratoires du département ALN et de microscopie confocale qui, par leur appui technique et leurs conseils, ont contribué à la réalisation de ce travail.

Je désire remercier le Conseil de Recherches en Sciences Naturelles et en Génie du Canada, Agriculture et Agroalimentaire Canada, Novalait, les Producteurs laitiers du Canada et l'Institut Rosell–Lallemand pour leur soutien financier à travers le Réseau de recherche sur les Bactéries Lactiques.

Enfin, ce travail est l'aboutissement de longues années d'étude ici et ailleurs, auxquelles l'amour et le soutien inconditionnel de ma famille en Suisse ainsi qu'à Québec ont largement contribué.

Cette thèse est présentée sous forme d’articles scientifiques. Pour satisfaire aux normes de la Faculté des études supérieures, les chapitres en anglais sont précédés d’un résumé en français.

Le chapitre 1, intitulé "Introduction générale", précise la problématique de la recherche et résume les connaissances actuelles sur les ferments lactiques et les bactéries qui les composent, ainsi que les défis à relever pour produire et exploiter les bactéries probiotiques. L'immobilisation cellulaire, avec une vue d'ensemble des techniques envisageables, est introduite comme méthode prometteuse de production de ferments lactiques probiotiques. Une synthèse des notions actuelles sur la dynamique microbienne des cellules immobilisées introduit le besoin de développer une méthode de détection des bactéries immobilisées dans des billes de gel de polysaccharide. Les effets de l'immobilisation cellulaire sur la physiologie et la morphologie des cellules sont finalement discutés. Suite à cette revue de littérature, les hypothèse, but et objectifs de recherche sont posés.

Le chapitre 2, intitulé " Bifidobacterium longum ATCC 15707 cell production during free- and immobilized-cell cultures in MRS-whey permeate medium", étudie la capacité de la technologie des cellules immobilisées à produire une culture pure de bifidobactéries. Ce chapitre constitue la première étape dans le but de produire une culture mixte de bactéries lactiques et probiotiques avec des cellules immobilisées et a été publié dans le journal "Applied Microbiology and Biotechnology", 60  : 168-173, 2002. Céline Paquin et Murielle Leroy ont contribué activement à l’obtention de ces résultats. En plus d’effectuer certaines expériences, j’ai interprété les résultats et rédigé l’article scientifique en question.

Le chapitre 3, intitulé "Quantitative determination of the spatial distribution of pure and mixed-strain immobilized cells in gel beads by immunofluorescence", traite du développement et de l’application d’une méthode de localisation et de quantification de bactéries immobilisées dans des billes de gel dans le but de suivre la dynamique microbienne complexe dans les billes de gel lors de la production de ferments lactiques mixtes à l’aide de cellules immobilisées. Cet article a été publié dans le journal "Applied Microbiology and Biotechnology", 59  : 297-302, 2002.

Le chapitre 4, intitulé "Continuous production of mixed lactic starters containing probiotics using immobilized cell technology" démontre la possibilité de produire en continu un ferment mixte modèle contenant une souche compétitive de bactéries lactiques et une souche non compétitive de bifidobactéries à l’aide d’un système de fermentation à deux étages avec cellules immobilisées. Le phénomène de contamination croisée est également observé grâce aux outils immunologiques développés dans le chapitre 3. Cet article a été soumis dans le journal "Biotechnology Progress".

Le chapitre 5, intitulé "Changes of lactic and probiotic culture characteristics during continuous immobilized-cell fermentation with mixed strains" traite des modifications physiologiques observées lors de la culture continue sur de longues périodes des cellules produites par la technologie d’immobilisation, en les comparant à des cellules produites de façon conventionelle en fermentation batch avec cellules libres. Kathy Barbeau a effectué certaines manipulations en laboratoire lors d’un stage d’été. Ces résultats, conjointement aux travaux de mon collègue Dirk Bergmaier, ont conduit au dépôt d'un brevet provisoire intitulé "Control and modulation of probiotic culture characteristics with immobilized cell technology".

Finalement, une conclusion générale sous forme de 6ème chapitre présente les conclusions les plus importantes de cette étude, leur impact et les perspectives pour des travaux futurs.