Chapitre 2 Matériel et Méthodes

Table des matières

Chaque individu participant à nos recherches devait fournir un consentement éclairé par la signature d'un formulaire de consentement explicitant les implications et limites de leur participation à l'étude. Le recrutement s'effectuait par l'entremise d'un réseau de plus d'une centaine d'ophtalmologistes répartis dans tout le Québec. Trois groupes principaux étaient ainsi inclus dans l'étude: Les familles ségréguant du glaucome (incluant les individus non-affectés de la famille ainsi que les conjoints), les individus non reliés atteints de glaucome ou d'HTO et, les individus contrôles cliniquement normaux (Figure 14). Ces individus contrôles étaient tous recrutés à la Clinique d’Ophtalmologie de la Cité, à Québec.

Les différentes étapes suivies à partir du prélèvement du patient dans le cadre du projet de séquençage à large échelle de TIGR/MYOC chez la population québécoise.

L'évaluation clinique des patients comprenait un examen ophtalmologique complet. Les critères diagnostiques du GPAO étaient: 1) dommages caractéristiques de la papille et/ou atteinte des champs visuels; 2) gonioscopies de grade III ou IV (angles ouverts) et; 3) PIOs ≥ 22 mmHg dans au moins un œil. Lorsqu'il n'y avait pas d'anomalie de la papille et d'altération des champs visuels, les sujets avec des PIOs ≥ 22 mmHg dans les deux yeux et une gonioscopie de III ou IV étaient diagnostiqués d'HTO. Une personne était considérée normale lorsqu'elle présentait des papilles normales avec des PIOs ayant toujours été mesurées < 22 mmHg. Les individus étaient diagnostiqués de glaucome à tension normale (GTN) lorsqu'ils présentaient des dommages caractéristiques à la papille, des champs visuels réduits avec des angles ouverts et des PIOs < 22 mmHg. Les sujets présentant des synéchies périphériques dans la chambre antérieure, une gonioscopie très étroite (grade 0-I), des PIOs ≥ 22 mmHg et des dommages caractéristiques de la papille (et/ou champs visuels) étaient diagnostiqués de glaucome à angle fermé (GAF). Les sujets diagnostiqués de glaucome à mécanisme mixte présentaient ces mêmes caractéristiques sans toutefois avoir de synéchies. Les individus présentant un glaucome secondaire au dépôt de protéines fibreuses dans toute la chambre antérieure de l'œil étaient diagnostiqués de glaucome exfoliatif. Les individus présentant un glaucome secondaire à la libération d'une quantité anormale de pigments de l'iris déposés dans la chambre antérieure de l'œil étaient diagnostiqués de glaucome pigmentaire. Les patients diagnostiqués d'une toute autre forme de glaucome secondaire ainsi que les personnes diabétiques étaient exclus de l'étude.

Pour une description plus détaillée, lire la section «  Materials and Methods  » de l’article intégré au chapitre 3, sous-section « Clinical investigation and phenotypic classification » (page 90).

Le séquençage du gène TIGR/MYOC chez un grand nombre d'individus a nécessité l'utilisation de techniques automatisées pour traiter et analyser dans des délais raisonnables la quantité importante d'information qui devait être générée.

La technique PCR permet l'amplification exponentielle d'un fragment d'ADN à l'aide d'amorces spécifiques à la séquence d'ADN à amplifier. L'utilisation d'une enzyme polymérase thermophile rend possible la dénaturation et renaturation cyclique des fragments amplifiés et la production de quantités importantes d'ADN en peu de temps. Les cycles d'amplification sont parfois précédés d'une dénaturation de 5 min à 95°C après laquelle on ajoute la polymérase. Cette procédure est communément appelée hot start .

L'ADN génomique des fragments du gène destinés au séquençage chez chaque individu était amplifié par PCR ( polymerase chain reaction ) (Figure 15 et Figure 16) sur microplaques à 96 puits. Les fragments amplifiés étaient ensuite purifiés par transfert sur une membrane en fibres de verre suivi d'un lavage à l'éthanol et d'une élution aqueuse (H2O). Les purifiats récupérés étaient dosés et ainsi des quantités uniformes des fragments d'ADN à séquencer étaient soumises à une seconde réaction PCR visant l'incorporation des molécules marquées aux fluorochromes spécifiques à chaque acide nucléique (A, C, G, et T). Les échantillons étaient ensuite purifiés une seconde fois par une précipitation à l'éthanol-EDTA où l'ADN était récupéré par centrifugation. On procédait par la suite à la dilution de ces échantillons dans une solution de formamide à 50%. Les échantillons étaient ensuite traités de façon automatisée pour une migration par électrophorèse à capillaires. Les données recueillies lors de la résolution de la migration étaient transférées sur un serveur informatique à partir duquel les séquences pouvaient être lues et analysées à partir d'un terminal.

Pour une description plus détaillée des protocoles utilisés, lire la section «  Materials and Methods  » de l’article inséré au chapitre 3, sous-section «  PCR and DNA sequencing  » (page 91).

La détermination de signatures dans une région chromosomique donnée a pu être réalisée par la caractérisation de marqueurs polymorphiques de types microsatellites ou polymorphisme de simple nucléotide (SNP). Les signatures de plusieurs individus possédant une mutation du gène TIGR/MYOC ainsi que celles d'un groupe contrôle ont été vérifiées par le génotypage de 12 marqueurs au locus GLC1A (Chr. 1q24-25). Celles-ci ont été établies par la migration sur gel de polyacrylamide des fragments amplifiés par PCR contenant les répétitions polymorphiques ou par le séquençage de fragments amplifiés contenant un ou plusieurs SNP(s). Lorsque plusieurs individus d'une même famille pouvaient être génotypés, l'attribution des haplotypes parentaux était possible (Figure 17). La signature de ces individus était alors qualifiée de "signature haplotypique" ou "signature d'haplotype", puisque les allèles de ces individus étaient phasés.

Pour une description détaillée, lire la section «  Materials and Methods  » de l’article inséré au chapitre 3, sous-section «  Radioactive and fluorescent genotyping for haplotype signatures in the GLC1A locus  » (page 92).

L'utilisation d'amorces spécifiques à une région du génome contenant une séquence microsatellite polymorphique permet l'amplification par PCR d'un fragment variant entre 90 et 300 nucléotides. Lorsque le marqueur utilisé est informatif, les fragments d'ADN des individus génotypés peuvent être discriminés selon leur longueur grâce à une migration des échantillons sur gel polyacrylamide. Ainsi, la transmission des allèles parentaux à l'intérieur d'un pedigree peut être caractérisée.

Lorsque possible, les signatures des individus non reliés étaient inférées à partir des haplotypes d'individus familiaux partageant la même mutation du gène TIGR/MYOC . De plus, des personnes investiguées normales ont été génotypées pour estimer la distribution des allèles retrouvés pour chacun des marqueurs au sein de la population québécoise. La possibilité pour un individu de partager de façon coïncidente une signature commune à d'autres porteurs de mutation a été évaluée. Un haplotype constitué de quatre marqueurs entourant le gène TIGR/MYOC a été simulé chez tous les génotypes contrôles par un logiciel effectuant une reconstitution informatique des haplotypes en fonction de probabilités statistiques (79).

Nous avons établi une formule pour évaluer la probabilité que les petites signatures retrouvées chez certains porteurs de mutations de TIGR/MYOC proviennent d'évènements de recombinaison ayant eu lieu après la colonisation de la Nouvelle-France. La formule était: P(probabilité) ≤ [1-(1-θ)gn], où θ équivaut à la fréquence de recombinaison, g au nombre de générations et n au nombre d'haplotypes caractérisés. Le nombre moyen de générations depuis la colonisation a été estimé à 10, considérant une moyenne de 30 ans/génération (80). Les principes entourant la fréquence de recombinaison sont définis dans ce chapitre, à la section 2.2.2 (page 50).

Pour une description plus détaillée concernant les reconstructions haplotypiques et le calcul des probabilités de recombinaison, lire la section «  Materials and Methods  » de l’article inséré au chapitre 3, sous-section «  Data processing and haplotype studies  » (page 93).

Trois techniques de génotypage différentes ont été utilisées pour la caractérisation des marqueurs génétiques chez les familles. Les techniques à l’isotope 35S et aux fluorochromes sont décrites dans la section «  Materials and Methods  » de l’article inséré au chapitre 3, sous-section «  Radioactive and fluorescent genotyping for hapotype signatures in the GLC1A locus  » (page 92).

Un autre technique utilisant la digoxygénine, molécule non radioactive, a précédemment été décrite dans une étude dirigée dans le laboratoire concerné par ces recherches (81). Cette technique, qui n’est pas décrite dans le chapitre 3, a été utilisée pour le génotypage de plusieurs des familles décrites dans le chapitre 4. Une amplification PCR était réalisée dans un volume de 50 µl contenant 100 ng d’ADN génomique, 31,3 µM de chaque dNTP, 10-50 pmol de chaque amorce, une concentration de tampon à PCR (1X) comprenant 50 mM de KCl, 10 mM de Tris (pH 9,0), 1,5 mM de MgCl2, 0,01% de gélatine et 0,1% de Triton X-100, et 1 U de la polymérase Taq (Perkin-Elmer Cetus), celle-ci ajoutée durant une procédure de départ de la réaction à chaud (« hot-start  ») de 5 min. Les échantillons étaient ensuite soumis à 35 cycles consécutifs de dénaturation (30 s à 95°C), d’hybridation (30 s à 55-57°C) et d’élongation (30 s à 72°C). Les produits obtenus étaient par la suite dilués avec du formamide 95%, du xylène cyanol 0,1% et du NaOH 10 mM pour ensuite être séparés par électrophorèse à 55W sur des gels de polyacrylamide 6%. Les échantillons ainsi séparés étaient par la suite transférés sur des membranes de Nylon à charge positive N+ (Amersham), hybridées par un oligomère (CA)20 marqué en 3’ par une molécule de digoxygénine-11-ddUTP et détectées par chemo-luminescence utilisant le système DIG (Roche) avec des films BioMax MR-1 (Kodak).

Le génotypage des membres de pedigrees ségréguant du GPAO a pour but de lier le phénotype retrouvé chez les individus malades de ces familles à une région chromosomique du génome humain partagée par toutes les personnes affectées. Lorsqu'un haplotype caractéristique ségréguant avec la maladie est identifié chez une famille, il est primordial de déterminer l'étendue de la région chromosomique susceptible de contenir le gène responsable du phénotype. C'est le phénomène naturel de recombinaison se produisant lors de la méiose, appelé crossing-over , qui peut permettre la restriction de l'intervalle génétique associé à une maladie (Figure 18). C'est donc en comparant les haplotypes retrouvés chez tous les individus affectés d'une famille que ces évènements de recombinaison délimitent le plus petit haplotype partagé.

La probabilité de recombinaison entre deux marqueurs génétiques est proportionnelle à la distance qui les sépare. Ainsi, la fréquence de recombinaison est la mesure de distance génétique entre les marqueurs (Figure 19).

Pour exprimer numériquement la probabilité statistique que deux marqueurs/gènes/loci soient rapprochés l'un de l'autre, il est possible de calculer la valeur "lod" ( lod score ). Cette valeur exprime la probabilité (lod = logarithm of the odds ) de liaison de deux facteurs (gènes ou marqueur génétique) selon leur transmission dans un pedigree à travers une ou plusieurs générations (Figure 20). Le calcul mathématique derrière la valeur lod nécessite l'utilisation d'ordinateurs puissants pouvant traiter et générer une quantité importante de données. Puisque la valeur lod est un logarithme, une valeur de 3 signifie que la probabilité d'une liaison est favorisée d'un facteur de 1000, alors qu'une valeur de 4 signifie qu'elle est favorisée d'un facteur de 10 000 etc. Un dénommé Morton, en 1955, a postulé que les valeurs lod de 3 et -2 pourraient, respectivement, servir de valeurs arbitraires pour confirmer ou infirmer une liaison. Ces valeurs sont toujours utilisées comme références aujourd'hui pour appuyer l'association (liaison) des phénotypes de familles à des régions chromosomiques spécifiques.

Lors de la méiose, les deux chromosomes homologues sont composés de deux chromatides sœurs. Il peut se produire un échange de matériel génétique entre les loci A et B entre les deux chromatides provenant chacune des chromosomes homologues. Une fraction proportionnelle à l'éloignement des loci A et B des gamètes produites posséderont un haplotype recombiné en A1B2 ou A2B1.

La distance génétique entre deux loci est déterminée par la fréquence de recombinaison entre ces loci. Une distance génétique de 1 cM est définie comme étant égale à 1% de recombinaison entre les marqueurs/loci séparés par cette distance. Même si les intervalles génétiques peuvent s'additionner pour le calcul de la distance totale entre les loci A et D, par exemple, la fréquence de recombinaison entre deux marqueurs ne peut toutefois pas excéder la valeur de 50% (θ = 0,5).

La valeur lod représente, d'une façon simplifiée, le logarithme de la probabilité que deux facteurs génétiques soient liés pour une fréquence de recombinaison donnée (0 ≤ θ ≤ 0,5) versus la probabilité qu'ils soient indépendants (non liés, i.e. θ = 0,5).

Les informations concernant chaque individu et famille participant au projet ainsi que les données recueillies lors du génotypage de ceux-ci étaient compilées sur une base de données créé par le logiciel « 4D » sur un Macintosh G4 (pour plus de détails techniques, voir (5)). Les données brutes de génotypage étaient importées dans la base 4D à l’aide d’un programme développé localement à cette fin. Indépendamment de la technique utilisée, chaque individu se voyait attribuer des valeurs alléliques en référence à l’individu du Centre d’Étude du Polymorphisme Humain (CEPH) M134702. Les informations désirées pour chacun des calculs de liaison étaient transférées à partir de la base de données 4D à des ordinateurs SUN à l’aide du logiciel pour serveur CAP Appleshare. Les calculs de liaison étaient réalisés par un SUN Enterprise Ultra 30 ou un SUN Enterprise 450. Les valeurs lod en deux points paramétriques étaient calculées par le programme MLINK du logiciel LINKAGE (FASTLINK 4.1P) (82), avec une fréquence de l’allèle lié à la maladie de 0.001 et un modèle de transmission autosomal dominant. Selon les informations provenant des dossiers cliniques ou des pedigrees eux-mêmes, quatre classes de liaison ont été définies avec une pénétrance dépendante de l’âge de 15% (< 20 ans), 30% (20-29 ans), 50% (30-39 ans) et 90% (≥ 40 ans) avec des probabilités de phénocopies de 0,4%, 1,0%, 1,0% et 1,0%, respectivement. Le phasage des haplotypes familiaux était réalisé par le programme SIMWALK 2.8 (83). Puisque la distribution des fréquences alléliques associées aux marqueurs testés au sein de la population québécoise n’était pas connue, les fréquences alléliques associées aux allèles de chaque marqueur étaient estimées comme étant égales.

L'outil de cartographie physique basé sur l'utilisation de chromosomes artificiels de levures (YAC) a été choisi pour la caractérisation d'une région d'intérêt ( GLC1B ). Cette technique peut être définie comme une cartographie par sequence-tagged sites (STSs) utilisant les YACs comme matrice de construction. Les STSs sont des courtes séquences uniques dans le génome et amplifiable par PCR. Le STS permet d'identifier parmi une banque de clones (de levures par exemple) ceux qui le contiennent, recouvrant une même région ou élargissant la couverture de cette région. Les STSs permettent donc de constituer des groupes de chevauchement. Deux YACs sont ainsi considérés comme chevauchants s'ils sont tous les deux positifs pour un même STS. Certains STSs peuvent être représentés par une séquence codante (ils sont alors nommés EST, ou expressed sequence tag ), ou bien par des marqueurs de cartes génétiques. Dans ce dernier cas, il peut ainsi être possible d'intégrer l'ordre des marqueurs d'une carte physique à celui indiqué sur une carte génétique.

Une carte physique a été construite à l’aide de chromosomes artificiels de levures (YAC). Les YACs contenus dans les contigs 2.6, 2.7 et 2.8 du Whitehead Institute Center for Genome Research (WICGR) (URL : http://www-genome.wi.mit.edu/cgi-bin/contig/phys_map), Cambridge MA, ont été obtenus grâce à la collaboration de Steve Sherer de The Hospital for Sick Children de Toronto ainsi que de son assistante Jennifer Skaug. Des prélèvements de chacune des colonies de YAC provenant des contigs à tester ont été reçus dans des tubes eppendorf 1,5 ml contenant du milieu YPD solide. Les colonies étaient ensuite striées sur des pétris de 30 ml contenant le milieu YPD avec de l’ampicilline (1 µl/ml), sélectionnant ainsi les levures contenant des chromosomes artificiels par la couleur rose des colonies ayant proliféré pendant 48 h à 30°C. Les colonies sélectionnées étaient ensuite individuellement placées en culture liquide de 5 ml de milieu AHC/ampicilline(1 µl/ml) dans un tube de 50 ml pour une incubation de 24-48 h à 30°C. Pour conserver les colonies pour de futures utilisations, 75 µl de milieu liquide était parallèlement stocké à -80°C dans 2 tubes contenant un total de 200 µl d’une solution de glycérol 50%. La culture liquide restante était ensuite centrifugée 2 fois à 1600 g, en lavant chaque fois le culot avec 10 ml d’une solution EDTA 50 mM à pH 8,0. Une troisième centrifugation de 5 min à 1600 g était effectuée pour resuspendre le culot dans 100 µl de solution SEC transférée dans un tube eppendorf. Par la suite, 100 µl d’une solution SEC (sorbitol 1M, citrate de sodium 0,1 M, EDTA 0,06 M pH 7,0) contenant en plus 200 U/ml de zymolase et 20 µl de ß-mercapto-éthanol 0.28 M était ajoutée au tube pour une incubation de 2 h à 37°C. Une solution de lyse (220 µl - 20 mM Tris/HCl pH 8,0, EDTA 100 mM, sarcosyl 2%, protéinase-K 2mg/ml) était par la suite ajoutée pour une incubation de 2 h à 50°C. L’ADN était ensuite extrait avec 500 µl de phénol/chloroforme, avec une centrifugation de 13000 rpm (centrifugeuse de table) pendant 15 min. L’ADN (~500 µl de phase aqueuse) était ensuite précipité à l’aide de 250 µl d’acétate d’ammonium 7,5 M et 1250 µl d’éthanol 96% froid (-20°C) dans un tube de 2ml centrifugé 20 min à 13000 rpm. L’ADN était alors lavé avec de l’éthanol 70% et recentrifugé pendant 5 min à 13000 rpm. L’ADN était par la suite resuspendu dans 100 µl de tampon Tris/EDTA (TE) 10:1 une fois le culot bien séché. L’ADN était par la suite dosé et des échantillons en concentration de 10 ng/µl étaient préparés pour chaque colonie.

Pour procéder à la cartographie des YACs préparés, la vérification de l’expression de fragments d’ADN par l’amplification des amorces de chacun des marqueurs à positionner s’effectuait par un essai PCR standard. Les PCRs étaient réalisés dans un Hybaid Omnigene Temperature Cycling System (Omnigene). Dans un volume de 50 µl contenant 100 ng d’ADN génomique de YAC, 31,3 µM de chaque dNTP, 10-50 pmol de chaque amorce spécifique au marqueur testé, une concentration de tampon à PCR (1X) comprenant 50 mM de KCl, 10 mM de Tris (pH 9,0), 1,5 mM de MgCl2, 0,01% de gélatine et 0,1% de Triton X-100, et 1 U de la polymérase Taq (Perkin-Elmer Cetus), celle-ci ajoutée durant une procédure de départ de la réaction à chaud (« hot-start  ») de 5 min. Les échantillons étaient ensuite soumis à 35 cycles consécutifs de dénaturation (30 s à 95°C), d’hybridation (30 s à 55-57°C) et d’élongation (30 s à 72°C).

Une collection d’ARNm isolés de l’iris et du trabéculum humain a été produite afin de vérifier l’expression de gènes candidats dans ces tissus oculaires. L’extraction de ces tissus avait lieu à la banque d’yeux du Centre Hospitalier de l’Université Laval (CHUL), qui fournissait les yeux prélevés post-mortem chez des patients décédés dans différents hôpitaux de la région de Québec et de l’Est du Québec. Chaque extraction des tissus oculaires était effectuée 12-36 h après le décès. Les tissus était prélevés à l’aide d’une incision circulaire complète dirigée de 3-5 mm vers la chambre postérieure à partir de la limite périphérique de la cornée. L’iris et le trabéculum ainsi exposés dans la chambre antérieure décapsulée étaient prélevés et conservés séparément dans des tubes eppendorf.

Pour procéder à l’extraction, les tissus étaient resuspendus dans 800 µl de tampon de dénaturation (guanidinium thiocyanate 4 M, citrate de sodium pH 7,0 25 mM, N-lauroy/sarcosine 0,5%). On ajoutait ensuite à ce tube 5,6 µl de ß-mercapto-éthanol, 80 µl d’acétate de sodium 2 M (DEPC), 800 µl de phénol et 180 µl de chloroforme. Le tube était par la suite soumis à un vortexage et placé sur de la glace pour 15 min. On procédait par la suite à une centrifugation à 13000 rpm (centrifugeuse de table) pendant 20 min, après quoi la phase aqueuse était transférée dans un nouveau tube auquel on ajoutait 1 ml d’isopropanol. On soumettait ensuite le tout à un vortexage pour ensuite laisser reposer l’échantillon 30 min à -20°C. Après une seconde centrifugation à 13000 rpm pendant 10 min, le culot était dissous dans 300 µl de tampon dénaturant et 300 µl d’isopropanol par vortexage et replacé 30 min à -20 °C. On recentrifugeait ensuite l’échantillon à 13000 rpm pendant 10 min pour ensuite laver le culot dans 200 µl d’éthanol-DEPC 70% pendant 5 min à la température de la pièce. Après une dernière centrifugation de 5 min à 13000 rpm, le culot asséché était dissous à nouveau dans 50 µl (trabeculum) ou 100 µl (iris) d’H2O-DEPC à 4°C et entreposé à -20°C.

Dans le but de vérifier l’expression de gènes candidats dans les tissus du trabeculum et de l’iris, l’ARNm extrait de ces tissus était transcrit en ADNc par reverse-transcription . À partir de cette matrice en ADNc, un essai PCR standard avec des amorces spécifiques amplifiant une région du gène testé pouvait être réalisé. Ainsi, un volume de 6 µl d’ARNm purifié (trabeculum ou iris) était ajouté à 5 µl H2O-DEPC et 1 µl d’oligos dT (0,165 µg/µl) pour être incubé à 70°C pendant 10 min. Sur glace, on procédait ensuite à l’addition de 4 µl de tampon « first strand  » (Gibco/BRL), 2 µl de DTT 0,1 M et 1 µl de dNTP 10 mM. Le tout était incubé à 42°C pendant 2 min avant de procéder à l’ajout de 1 µl de reverse transcriptase (Gibco/BRL) pour une incubation de 50 min à 42°C et 15 min à 72°C. On ajoutait ensuite à l’échantillon 1 µl de RNaseH pour une incubation de 20 min à 37°C. On conservait par la suite l’échantillon à 4°C.

Pour effectuer un essai PCR sur l’ADNc obtenu par reverse transcription , on procédait à la purification de l’ADNc avec un colonne de purification Qiaquick (Qiagen). Le purifiat était ensuite dosé qualitativement sur gel d’agarose pour en estimer la concentration, sans toutefois perdre beaucoup de matériel. Les PCRs étaient réalisés dans un Hybaid Omnigene Temperature Cycling System (Omnigene). L’essai PCR contenait un volume de 50 µl à 100 µl contenant ~50-100 ng d’ADNc, 31,3 µM de chaque dNTP, 10-50 pmol de chaque amorce spécifique au gène dont l’expression était testée, une concentration de tampon à PCR (1X) comprenant 50 mM de KCl, 10 mM de Tris (pH 9,0), 1,5 mM de MgCl2, 0,01% de gélatine et 0,1% de Triton X-100, et 1 U de la polymérase Taq (Perkin-Elmer Cetus), celle-ci ajoutée durant une procédure de départ de la réaction à chaud (« hot-start  ») de 5 min. Les échantillons étaient ensuite soumis à 35 cycles consécutifs de dénaturation (30 s à 95°C), d’hybridation (30 s à 55-57°C) et d’élongation (30 s à 72°C).

Les gènes candidats de l'intervalle GLC1B ont été séquencés à l'aide d'une technique de séquençage non automatisée utilisant l'isotope radioactif 33P. Les fragments d'ADN à séquencer étaient initialement amplifiés par PCR standard (selon les conditions décrites à la section 2.2.1 , page 49). Les amplifiats étaient ensuite purifiés dans des colonnes QiaQuick (Quiagen) pour ensuite être soumis à une seconde réaction PCR visant à produire des fragments radioactifs de longueurs variables. Pour chaque séquence produite, quatre réactions PCR étaient réalisées (une par nucléotide) pour permettre l'incorporation aléatoire de nucléotides "di-déoxy" ([α-33P]ddNTP). Le protocole de séquençage Thermo Sequenase (Amersham Pharmacia Biotech) comprenait l'assemblage d'une solution maîtresse contenant 2 µl de tampon de réaction, 1 µl de l'amorce (4 µM) de séquençage, 5 µl d'H2O, 10 µl de l'ADN de la première amplification purifiée et 2 µl de l'enzyme de type polymérase ADN nommée Thermo Sequenase. Cette solution maîtresse était séparée en quatre réactions (A,C,G,T) contenant 0,5 µl du [α-33P]ddNTP correspondant et 2 µl de dNTP (dITP au lieu de dGTP pour les séquences GC riches). Les échantillons étaient ensuite à 35-40 cycles consécutifs de dénaturation (30 s à 95°C), d’hybridation (30 s à 55-60°C) et d’élongation (30 s à 1 min à 72°C). Les réactions de séquences étaient par la suite déposées sur un gel de polyacrylamide 6% tolérant au glycérol pour une migration d'environ 2 h à 55 W, pour ensuite être transférées sur papier Whatman et exposé 24 h sur film Biomax (Kodak).