Conclusion

Jusqu’à très récemment, le gène TIGR/MYOC (locus GLC1A ) était le seul à avoir été relié à l’apparition du GPAO. En février 2002, des variations identifiées dans le gène codant pour l’optineurine, OPTN (locus GLC1E ), ont été reliées à la présence de GPAO chez 16,7% de 54 familles glaucomateuses testées (31). La majorité de ces familles comportait cependant des individus manifestant du glaucome avec des tensions intraoculaires normales (GTN). Puisque l’impact de ce second gène identifié sur l’incidence du GPAO « classique » (PIOs élevées) n’a toujours pas été validé et testé sur un grand nombre d’individus atteints, TIGR/MYOC reste, à ce jour, le plus important facteur génétique en lien avec le GPAO.

Pour déterminer précisément la proportion des individus atteints de GPAO chez la population québécoise attribuable à des mutations du gène TIGR/MYOC , un total de 422 individus non reliés atteints de glaucome ou d’hypertension oculaire et 18 familles où l’on retrouvait du glaucome ont été systématiquement séquencés sur ce gène. Un total de 50 individus contrôles et 57 conjoints des familles recrutées ont aussi été inclus dans l’étude. Un nombre important d’individus ont été séquencés afin de discriminer avec le plus d’exactitude possible quelles étaient les variations réellement associées à la maladie des polymorphismes non pathogéniques. Un total de 20 variations dans la séquence codante du gène ont été identifiées parmi les 547 individus séquencés. De ces variations, neuf ont été jugées comme étant associées au glaucome. Deux de ces mutations étaient rapportées pour la première fois: les variations Arg126Trp et Ala427Thr. Le statut de sept autres mutations a été confirmé: les variations Thr293Lys (32, 47, 54), Glu352Lys (28, 32, 54), Gly367Arg (57-59), Gln368Stop (47, 51, 53, 56, 60, 61, 88), Lys423Glu (66), Ala445Val (47) et Pro481Leu (32). Une nouvelle variation jugée comme étant un polymorphisme a également été identifiée: la variation Asp77Glu.

Le changement Asp77Glu a été considéré comme un rare polymorphisme parce qu’il n’a été retrouvé que chez un seul individu et que celui-ci codait pour un acide glutamique, un acide aminé quasi identique à l’acide aspartique retrouvé normalement à la position 77, N-terminale à la région de glissières à leucines. D’un autre côté, l’altération Ala427Thr était présumée être une nouvelle mutation du gène entraînant l’apparition du GPAO de par son absence dans la population contrôle et la conservation de l’acide aminé à cette position du domaine d’homologie à l’olfactomédine chez quatre autres espèces mammifères (porc, boeuf, souris, rat). Le recrutement de la famille de l’individu non relié, où la variation avait été détectée, a révélé des antécédents familiaux de glaucome. Deux autres porteurs de cette variation au sein de cette famille ont été diagnostiqués de troubles oculaires autre que le GPAO; une personne manifestait du GTN et l’autre personne avait eu un épisode de fermeture de l’angle irido-cornéen ayant requis une iridotomie au laser. Trois autres individus asymptomatiques ont été identifiés comme porteurs de la variation Ala427Thr. Puisque le plus âgé de ces individus avait seulement 44 ans, il était possible d’envisager que cette variation soit associée à une forme de glaucome à apparition tardive.

La nouvelle variation Arg126Trp a été identifiée chez deux individus non reliés atteints de GPAO et a été suggérée comme étant reliée à l’apparition de la maladie. L’acide aminé à la position 126 dans le motif de glissière à leucine était conservé chez les quatre autres espèces mammifères possédant un homologue de la myociline. Les familles immédiates des deux individus non reliés possédant cette variation avait été recrutées, révélant que chacun de ces propositus avait un frère ou une sœur atteint de glaucome et possédant également la variation. La variation Arg126Trp a toutefois été retrouvée chez un individu de la population contrôle qui faisait partie du groupe de 57 conjoints des familles glaucomateuses recrutées. Cet individu, asymptomatique à 47 ans, était le conjoint d’un membre de l’énorme famille CA comportant à ce jour 314 personnes recrutées dont 121 porteurs de la mutation Lys423Glu de la myociline. De plus, l’un de ces 121 porteurs de la Lys423Glu, le fils du conjoint asymptomatique, était également porteur de la variation Arg126Trp. Cet homozygote composé Arg126Trp/Lys423Glu avait été diagnostiqué d’un GPAO juvénile très agressif à 11 ans. Ces observations suggèrent que TIGR/MYOCArg126Trp pourrait être une mutation reliée au glaucome à apparition tardive et/ou un facteur génétique modulateur pouvant accélérer la pathologie de la maladie lorsque combiné à une autre mutation de TIGR/MYOC ou à d’autres facteurs de risque, génétiques ou non.

Même si la mutation Lys423Glu démontrait un effet fondateur important qui avait été retracé à un seul individu né en 1799 dans l’Est du Québec (5), celle-ci ne fut détectée qu’une seule fois parmi le groupe d’individus non-reliés, démontrant ainsi l’efficacité avec laquelle les individus atteints de cette famille avaient été recrutés. La seule personne du groupe d’individus non reliés possédant cette mutation partageait le même haplotype entourant le gène TIGR/MYOC , mais n’avait cependant aucune connaissance d’être apparenté à cette famille.

Parmi les autres changements d’acides aminés observés, la variation Lys398Arg avait été détectée chez 7 des 384 patients atteints de glaucome alors qu’elle n'était présente que chez 1 des 107 individus contrôles. Parce que cette variation était retrouvée chez moins de 1% de la population contrôle, elle aurait pu être classifiée comme variation pathogénique du gène TIGR/MYOC selon les critères auparavant établis. Cependant, d’autres études rapportaient cette variation comme un polymorphisme aucunement associé au glaucome (32, 51, 53, 54). Dans des cellules de trabéculum humain transfectées, Jacobson et coll. démontraient que les polypeptides TIGR/MYOCLys398Arg étaient sécrétés à l’extérieur des cellules, d’une façon similaire à la sécrétion des protéines sauvages, alors que les polypeptides de mutations confirmées restaient séquestrés à l’intérieur de ces cellules (71). Selon ces arguments, c’est ainsi que la variation Lys398Arg a été considérée comme un polymorphisme non pathogénique présent chez la population québécoise.

Les fréquences de mutation de TIGR/MYOC ont été calculées à 22,2% (4/18) chez les familles ségréguant du GPAO et à 4,0% (17/422) chez les individus non reliés diagnostiqués de glaucome ou d’hypertension oculaire. Parmi toutes les mutations observées, la variation Gln368Stop était la plus commune, représentant 33,3% des évènements mutationnels identifiés dans l’étude (7/21). L’extension de la famille CT à partir du propositus CT003 avait cependant révélé que la mutation Gln368Stop ne ségréguait pas avec les phénotypes de glaucome ou d’HTO identifiés, soulevant la possibilité que cette variation puisse ne pas être reliée à l’apparition du glaucome chez cette famille. Cette observation était en accord avec d’autres études rapportant des individus diagnostiqués de GPAO et d’HTO ne possédant pas de TIGR/MYOCGln368Stop chez des familles ségréguant cette variation (28, 61, 88). Ces études proposaient, entre autres, que la mutation puisse être associée avec un glaucome adulte tardif et/ou interagissait avec certains facteurs inconnus, mais aucune n’avait proposé la possibilité que l’altération soit non-pathogénique. Avec un individu âgé de 71 ans, cliniquement normal, possédant la variation dans notre groupe contrôle et aucune famille québécoise ségréguant cette variation avec le phénotype de glaucome, notre étude démontre la prudence avec laquelle de futurs projets devraient être entrepris concernant le rôle pathogénique de TIGR/MYOC Gln368Stop.

Dans le groupe de 422 individus non reliés, 91 patients ont été diagnostiqués avec des types de glaucome autres que le GPAO classique. Trente-huit (38) cas d’HTO ont également été investigués. Un total de six mutations ont été détectées parmi ces 129 individus. Trois de ces porteurs (1 Thr293Lys, 2 Gln368Stop) étaient diagnostiqués d’HTO avec des PIOs au diagnostic variant de 25 à 33 mmHg. Trois autres porteurs étaient affectés par un glaucome autre que le GPAO; un individu possédant la mutation Gln368Stop était diagnostiqué de GAF, un second individu possédant la mutation Arg126Trp était diagnostiqué de glaucome à mécanisme mixte et un troisième individu possédant la mutation Ala445Val était diagnostiqué de glaucome pigmentaire. Ces corrélations génotype/phénotype démontraient que des mutations de TIGR/MYOC pouvaient être associées à des formes de glaucome autres que le GPAO. Ces observations étaient en accord avec une étude récemment publiée par Vincent et coll. qui rapportait des porteurs des mutations Thr293Lys et Gly399Val de TIGR/MYOC atteints, respectivement, de glaucome pigmentaire et de glaucome à mécanisme mixte (86).

Lorsque le groupe d’individus non reliés atteints de GPAO « typique » était comparé à ceux atteints d’autres types de glaucome, on obtenait une fréquence de mutation de TIGR/MYOC de 3,8% (11/293) chez les cas de GPAO et de 4,7% (6/129) chez les cas d’HTO et autres types de glaucome. Ces valeurs n’étaient donc pas significativement différentes de la fréquence de mutation de 4,0% calculée lorsque tous ces individus étaient considérés comme un seul groupe (17/422). L'utilisation de critères d’inclusion plus larges dans la cohorte de patients séquencés sur ce gène nous a donc permis d’augmenter le nombre de porteurs d’une mutation pouvant bénéficier d’un suivi clinique plus étroit et/ou d'un traitement préventif.

L’établissement de signatures d’haplotypes (ou signatures haplotypiques) en conjonction avec une analyse de mutations à large échelle a démontré l’importance de l’effet fondateur chez la population canadienne française. Non seulement avons-nous observé que des mutations de TIGR/MYOC déjà connues ainsi que des nouvelles étaient présentes au sein de la population québécoise manifestant du glaucome, mais aussi que la plupart des mutations identifiées étaient entourées d’un unique « noyau » de signature haplotypique au locus GLC1A . La majorité des cas de glaucome reliés à TIGR/MYOC chez la population québécoise pouvaient ainsi être apparentés à un nombre limité de fondateurs ayant introduit la maladie. D’une part, il fallait aussi considérer que certaines petites signatures pouvaient être liées à un même évènement mutationnel ancestral précédant l’arrivée des colons français en Amérique. Par exemple, les petites signatures observées chez certains porteurs de mutations (Thr293Lys-HU019, Gly367Arg-UN061, Gln368Stop-UN485-UN499) suggéraient que ces personnes partageaient possiblement un ancêtre commun avec les autres porteurs de ces mutations ayant cependant vécu bien avant la fondation de la Nouvelle-France. D’un autre côté, il était toujours envisageable que ces courtes signatures soient des faux positifs dus à un manque d’informativité des marqueurs couvrant celle-ci. L’utilisation d’haplotypes phasés comme signature de référence pour cinq des six mutations diminuait cependant la probabilité de retrouver de tels faux positifs. En estimant la distribution de fréquences des courts haplotypes rencontrés au locus GLC1A dans une population contrôle, il a été possible d’évaluer la spécificité de ces signatures. Pour celles couvrant les plus courtes distances génomiques, comme celles observées chez les individus UN485 et UN061, il a été considéré qu’elles puissent avoir été observées par coïncidence. Pour vérifier cette hypothèse, nous avons utilisé une nouvelle méthode d’analyse statistique pour reconstruire des haplotypes au sein de notre population contrôle d’individus cliniquement normaux (79). L’haplotype de l’individu UN485, porteur d’une variation Gln368Stop, ne fut pas retrouvé dans les haplotypes reconstruits de la population contrôle (92 chromosomes). Inversement, la signature couvrant uniquement trois marqueurs entourant TIGR/MYOC Gly367Arg chez UN061 a été retrouvée dans 13% (12/92) des haplotypes contrôles reconstruits. Ces estimations supportaient donc l'hypothèse que les signatures retrouvées chez les porteurs de la mutation Gly367Arg puissent avoir originé de deux évènements séparés, alors que les signatures haplotypiques retrouvées chez tous les porteurs de Gln368Stop aient pu provenir d’un ancêtre commun.

Si l’on assumait le fait que toutes les signatures communes observées étaient non coïncidentes, nous pourrions estimer la probabilité (P) qu’un haplotype associé à une mutation soit conservé sur une distance génétique spécifique (θ: fraction de recombinaison) pour un certain nombre de générations (g), obtenant P = (1-θ)g. Donc, la probabilité estimée d’observer au moins un haplotype provenant d’un ancêtre commun plus petit que θ après g générations était plus petite ou égale à P, où P ≤ [1 - (1-θ)gn] avec n haplotypes. Une signature commune de moins de 1 cM était présente chez quatre mutations de TIGR/MYOC : Gly367Arg (UN061), Gln368Stop (UN485, UN499), Thr293Lys (HU019) et Arg126Trp (CA311). Considérant que la majorité de la population canadienne française descendrait d’ancêtres fondateurs ayant vécu approximativement il y a 10 générations (300 ans avec une moyenne de 30 ans/génération (80)) et que le nombre d’haplotypes (signatures) testés pour ces quatre mutations étaient nArg126Trp = 3, nThr293Lys = 4, nGly367Arg = 3 et nGln368Stop = 7, on obtenait, avec θ ≤ 1 cM: PArg126Trp ≤ 0.26, PThr293Lys ≤ 0.33, PGly367Arg ≤ 0.26 et PGln368Stop ≤ 0.51. Ces calculs démontraient donc qu’il y avait de faibles probabilités que ces petites signatures, parfois beaucoup plus courtes que 1 cM, puissent être reliées à un ancêtre commun ayant vécu il y a 10 générations ou moins. Cette possibilité était, par contre, aussi probable que celle d’effectivement avoir en commun un tel ancêtre pour ceux possédant une courte signature de Gln368Stop (PGln368Stop ≤ 0.51). Il fut toutefois considéré que tous les individus mutés partageant de courtes signatures haplotypiques puissent avoir hérité leurs mutations d’un fondateur différent des individus partageant une signature plus longue. Sommairement, cela impliquait que plus d’un individu, fondateur ou non, pouvaient avoir introduit les mutations Arg126Trp, Thr293Lys, Gly367Arg et Gln368Stop chez la population québécoise. Pour appuyer cette affirmation, il y a le fait que les individus HU019, UN061 et UN485 étaient démographiquement plus isolés du reste des porteurs de leur mutation respective (Thr293Lys, Gly367Arg et Gln368Stop) (données non divulguées). Cette observation confirmait que ces individus étaient plus susceptibles d'être moins apparentés à ces autres porteurs.

Deux marqueurs polymorphiques situés à moins de 1 kb centromérique et télomérique à la région codante de TIGR/MYOC discriminaient deux signatures distinctes entre un individu (CA311) et deux autres porteurs de la mutation Arg126Trp (UN248, UN402). Il était fort probable que deux individus avaient, indépendamment, introduit cette variation du gène au Québec sans que ceux-ci n’aient partagé d’ancêtre commun. Les deux types de signatures observées seraient ainsi expliqués par une mutation récurrente, c'est-à-dire des évènements mutationnels distincts. D’ailleurs, l’individu CA311, de descendance irlandaise, vivait dans un village éloigné de plus de 500 km du lieu de résidence des deux autres individus non reliés, de descendance française, qui partageaient la même mutation.

Les sept signatures haplotypiques/alléliques retrouvées pour six mutations différentes démontraient un effet fondateur important dans le bassin de population canadienne française testé. Cependant, si l’on considérait les estimations de probabilité de recombinaison, on avait à spécifier que le total de 21 individus génotypés au locus GLC1A avaient probablement acquis leurs mutations de 7 à 10 fondateurs ou immigrants différents: 2 pour Arg126Trp, 1 ou 2 pour Thr293Lys, 1 ou 2 pour Gly367Arg, 1 ou 2 pour Gln368Stop, 1 pour Lys423Glu et 1 pour Ala445Val.

Des haplotypes/allèles communs concernant des marqueurs entourant le gène TIGR/MYOC avaient été retrouvés chez plusieurs porteurs de la mutation Gln368Stop aux États-Unis, au Canada et en Australie (32, 95), suggérant qu’il y aurait des signatures communes chez plusieurs populations pour des mutations plus anciennes. Nos résultats de génotypage ont démontré que tous les porteurs de la Gln368Stop partageaient une même signature, supportant ainsi cette hypothèse d’effet fondateur au niveau mondial (32). Les individus aux haplotypes/allèles partagés plus courts pouvaient avoir hérité de leur mutation d’un fondateur différent, ces fondateurs partageant tout de même un ancêtre lointain.

Deux autres mutations présentes au Québec: Thr293Lys et Gly367Arg, ont aussi été identifiées dans plusieurs populations (32, 47, 54) (57-59). Cette observation appuyait l’hypothèse que chacune de ces mutations puisse être liée par un évènement mutationnel ancestral disséminé dans diverses populations. Cependant, comme il a été discuté précédemment, la courte signature commune observée chez l’individu UN061 (Gly367Arg) pouvait probablement être le fruit d’une coïncidence. Dans ce cas, plus d’un évènement mutationnel seraient responsables de la dispersion de la mutation Gly367Arg dans plusieurs populations.

La mutation Lys423Glu a seulement été rapportée dans la population canadienne française (66). Cette variation était donc possiblement une mutation plus récente. En effet, quelques individus d’un branchon éloigné de la grande famille ségréguant Lys423Glu ont été identifiés avec le même haplotype familial au locus GLC1A . Même si ces individus étaient reliés à cette famille par un ancêtre commun né au 18e siècle, il s'est avéré qu'ils ne possédaient pas la mutation Lys423Glu (données non divulguées). Aucune mutation n’avait été identifiée dans le gène TIGR/MYOC de ce branchon éloigné; ainsi, la mutation Lys423Glu pouvait avoir été introduite dans la population québécoise par un récent évènement mutationnel ayant eu lieu environ une centaine d’années après l’arrivée en Nouvelle-France des ancêtres de ce pedigree. Avec une mutation aussi récente, nous nous attendions à retrouver un long déséquilibre de liaison entourant le gène TIGR/MYOC chez les porteurs de cette mutation, comme ce fut le cas pour l’individu non relié UN116 qui partageait l’haplotype TIGR/MYOCLys423Glu sur toute la région testée (7,2 Mb). Cet individu s’est avéré être un enfant adopté, fort probablement relié de près au pedigree CA.

Il est bien connu que les jeunes populations isolées (10-15 générations), comme la population du Québec, sont idéales pour la recherche de signatures alléliques/haplotypiques (76). Puisque la diversité génétique réduite retrouvée chez ces populations permet normalement d’obtenir un nombre moindre d’allèles que dans des populations plus vieilles, des signatures haplotypiques devraient y être plus faciles à identifier que chez des populations plus hétérogènes (76). Cependant, pour des maladies communes comme le glaucome, les effets fondateurs pourraient être plus difficiles à démontrer. L’observation de neuf mutations différentes de TIGR/MYOC dans la population du Québec et les courtes signatures communes à certains des porteurs tendent à supporter cette affirmation. Puisque le bassin génétique de la population canadienne française serait d’environ 8500 fondateurs (78), il n’était pas surprenant de retrouver autant de variations du gène et de signatures associées à celles-ci. Il a été proposé que la distribution non uniforme de certaines maladies héréditaires au Québec soit reliée à une stratification géographique de l’effet fondateur (96). Cette fragmentation de l’effet fondateur aurait donc pu favoriser l’homogénéité de l’échantillon si les individus prélevés pour l’étude provenaient tous de la même région du Québec.

Néanmoins, les individus qui partageaient une signature commune couvrant entièrement l’intervalle testé de 7,2 Mb au locus GLC1A étaient plus susceptibles d’être proches parents que ceux partageant des portions plus petites de l’intervalle. Par exemple, les signatures identiques observées chez les individus MT010 et UN218 ont été expliquées lorsque le recrutement de la famille MT a révélé que l’individu UN218 était, en fait, le grand-oncle de MT010. Un tel exemple démontrait comment la caractérisation de signatures haplotypiques/alléliques au sein d’une population relativement isolée permettait de lier des individus non reliés à des familles atteintes participant à la même étude. Cette procédure, combinée à des données généalogiques ordonnées et accessibles, pourrait éventuellement mener à la liaison de chaque individu non-relié atteint, muté sur un gène de maladie héréditaire, avec les familles déjà caractérisées qui sont affectées sur le même gène. Le dépistage génétique des mutations de TIGR/MYOC devrait ainsi être offert aux familles atteintes de glaucome et aux proches parents des individus non reliés ayant participé à l’étude.

L’utilisation de signatures d’haplotypes pour localiser des nouveaux loci de maladies héréditaires chez la population canadienne française pourrait difficilement être appliquée pour les maladies communes comme le glaucome ou d’autres maladies multigéniques parce qu’il y aurait une grande dilution des signatures recherchées. D’un autre côté, ces signatures pourraient être un outil de grande valeur pour raffiner l’intervalle d’un locus de maladie héréditaire déjà identifié. Comme exemplifié par la comparaison d’haplotypes familiaux phasés chez des familles liées au gène TIGR/MYOC avec le génotype d’individus non reliés, l’intervalle minimal de superposition des signatures communes pourrait réduire significativement la région où doit se trouver le gène d’un locus associé à une maladie, accélérant ainsi sa découverte.

Un propositus de chacune des 18 familles ségréguant du GPAO a été séquencé sur la séquence codante du gène TIGR/MYOC . L’analyse de ces séquences a révélé que quatre de ces familles comportaient des individus possédant des mutations de ce gène associées au glaucome: la famille CA (Lys423Glu), la famille CT (Gln368Stop), la famille MT (Gly367Arg) et la famille VA (Pro481Leu). Puisque qu’il avait été observé que la mutation Gln368Stop n’était pas présente chez tous les individus de la famille CT manifestant du glaucome ou de l’HTO, un branchon de cette famille, ainsi que sept autres familles se prêtant à une analyse de liaison, ont été génotypés sur six loci susceptibles d’être liés à la présence de GPAO chez ces familles. L’analyse de liaison sur les loci GLC1B , GLC1C , GLC1D , GLC1E , GLC1F et IRID1 a révélé des possibilités de liaison chez six de ces huit familles: la famille PR – GLC1B , la famille CT (branchon CT060) – GLC1C , la famille GR – GLC1F , la famille FO – GLC1D , la famille HU – GLC1D , GLC1E et IRID1 , et la famille PM – GLC1E .

Il a été déterminé durant ces analyses que les efforts de recherche à la découverte d’un nouveau gène impliqué dans l’apparition du glaucome seraient concentrés sur la liaison de la famille PR au locus GLC1B . Celle-ci représentait, lors des analyses préliminaires, la plus intéressante possibilité de liaison. Le suivi annuel de chacune des familles recrutées pour l’étude a toutefois permis l’identification de nouveaux cas d’HTO et de glaucome ainsi que la modification de certains diagnostics chez certains pedigrees durant la progression du projet. Conséquemment, l’investigation de la liaison de certaines familles, selon des données cliniques plus récentes, pourrait éventuellement être poursuivie.

L’extension du branchon initial de la famille PR avait pour but d’identifier un plus grand nombre d’individus atteints de glaucome chez cette famille en vue de confirmer la liaison de la famille au locus GLC1B et d’éventuellement réduire l’intervalle génétique candidat à contenir le gène responsable du glaucome. L’intervalle initialement identifié en 1996 par Stoilova et coll . (18) avait été établi à 11,2 cM, grâce à des individus atteints recombinant dans la région chromosomique impliquée.

De nouveaux cas de glaucome ou d’HTO ont pu être ajoutés à la famille grâce au recrutement de deux branchons de la famille liés à des ancêtres communs au branchon initial nés en 1839 et 1707. Le génotypage de 12 microsatellites couvrant l’intervalle GLC1B chez le branchon de 1839 semblait révéler un haplotype commun de quatre marqueurs consécutifs entre les deux cas de glaucome de cette extension de la famille et le noyau initial du pedigree. Ces quatre marqueurs couvraient une distance génétique de 3,8 cM et auraient permis, si l’haplotype commun avait été validé, de réduire l’intervalle génétique du locus GLC1B de 11,2 cM à 5,7 cM. La caractérisation de trois marqueurs de type SNP (single nucleotide polymorphism ) à l’intérieur de cette région ne permettant pas de discriminer l’haplotype des deux branchons, la construction d’une carte physique couvrant cette région chromosomique a été entreprise. Cette carte basée sur des YACs ( yeast artificial chromosomes ) permettait d’ordonner correctement les marqueurs de cette région et donnait l’opportunité de tester des nouveaux marqueurs définitivement positionnés dans la région d’intérêt. Des marqueurs polymorphiques de type répétitions GATA, ainsi que des marqueurs à répétitions CA identifiées par ratissage de séquences de BAC ( bacterial artificial chromosome ), ont éventuellement discriminé tout haplotype commun entre chacun des branchons de la famille PR. Sauf pour une série de quelques marqueurs consécutifs communs chez l’haplotype de l’extension de 1707, qui contenait toutefois des allèles très fréquents au sein de la population québécoise, la liaison des branchons extensionnés au locus GLC1B se trouvait plutôt infirmée que confirmée.

Le projet de séquençage du génome humain (HGP) s’est avéré un outil indispensable pour la confirmation de l’ordre des marqueurs caractérisés dans la région d’intérêt, cet ordre étant très important dans la recherche d’haplotypes communs chez les individus malades. Fait à noter, le dernier assemblage disponible publiquement (#30) confirmait presqu’entièrement le positionnement établi par la carte physique de YACs réalisés dans le cadre de ce projet ainsi que la présence de régions non-clonées (ou difficilement clonables) dans la région correspondant au centromère du chromosome 2.

Durant l’évolution du projet, certains gènes situés dans le locus GLC1B ont été investigués en tant que candidats potentiels à être associés au glaucome des familles liées à cette région. Trois gènes, tous positionnés dans l’intervalle potentiel de 5,7 cM identifié lors des premiers essais de caractérisation de l’haplotype du branchon de 1839, ont été séquencés dans le but de vérifier la présence de variations de leur séquence codante ségréguant avec la maladie. Ainsi, les gènes ACTR1B , VAMP5 et le gène codant pour la protéine LOC164828, similaire à FOXI1, ont fait l’objet d’un séquençage partiel ou entier de leur séquence codante chez au moins un individu du branchon initial, entre autres du branchon de 1839 de la famille PR atteints de glaucome ainsi qu’une personne contrôle.

Le gène ACTR1B était un candidat intéressant de par l’implication de la protéine codée, la ß-centractine (376 a.a.), dans une fonction de motilité cellulaire en association avec des protéines de type myosine. La ß-centractine est une sous-unité du complexe de la dynactine, un complexe activateur du mécanisme de motilité des vésicules généré par la dynéine. Il était donc invitant de faire le rapprochement entre un tel mécanisme de motilité des vésicules et les processus impliqués dans la sécrétion de la myociline à l’extérieur de la cellule. De plus, l’expression de la ß-centractine, une isoforme 15 fois plus rare que la forme α, avait été vérifiée dans les tissus humains du trabéculum et de l’iris. Une variation à l’acide aminé 143 de la protéine (A143V) a effectivement été découverte chez tous les individus atteints du branchon initial de la famille PR ségréguant l’haplotype lié au phénotype. Cette variation avait d’autant plus d’intérêt de par sa position sur un acide aminé d’une région connectrice de la protéine très conservée chez toutes les protéines reliées à l’actine. Cette région jouerait un rôle de « charnière » lors de changements conformationnels impliqués dans l’utilisation d’une pochette à ATP au site catalytique de la protéine (101, 105). Cependant, cette variation n’a pu être retrouvée chez aucun des individus atteints des autres branchons de la famille PR. Supposant toutefois que le glaucome manifesté chez ces branchons ait une autre origine que la liaison au locus GLC1B , plus de 84 individus non reliés atteints d’un GPAO cliniquement similaire à celui retrouvé dans la famille PR et 55 individus cliniquement normaux ont été séquencés dans l’exon du gène contenant la variation. Puisque 12,7% des individus normaux s’avéraient posséder la variation A143V, celle-ci n’a pu être retenue comme étant reliée au glaucome.

Le gène VAMP5 , codant pour un protéine (myobrévine) de 116 acides aminés associée aux membranes des vésicules, avait également été identifié comme candidat. L’expression de ce gène avait également été vérifié dans les tissus humains de trabéculum et de l’iris. Le séquençage en entier de ce gène n’avait cependant révélé aucun changement d’acide aminé associé à la maladie, mais avait toutefois permis l’identification de trois marqueurs polymorphiques de type SNP qui ont été utilisés dans la caractérisation de l’haplotype de la famille dans cette région. Un gène de la même famille avait récemment été rapporté dans la même région, VAMP8 (endobrévine), situé à moins de 100 kb de VAMP5 . Ce gène n’a toutefois pas été séquencé dans le cadre de ce projet.

Un nouveau gène, codant pour une protéine de fonction inconnue, avait récemment été positionné au centre de l’intervalle GLC1B . Cette protéine inconnue de 570 acides aminés possédait un domaine de type boîte « forkhead » la rattachant à la superfamille des facteurs de transcription de type « FOX ». Une duplication d’une région incluant ce type de gène, chez une famille québécoise manifestant du glaucome, avait déjà été rapportée dans notre laboratoire (98). Cette région du chromosome 6p25 contenait, entre autres, le gène FOXC1 , où plusieurs mutations ponctuelles, toutes situées dans la boîte forkhead , avaient aussi été associées aux malformations oculaires Axenfeld-Rieger et iridogoniodysgénésie, les deux se présentant fréquemment avec la manifestation du glaucome (112). Trois marqueurs polymorphiques ayant été positionnés sur un même BAC contenant la séquence complète de ce gène ont été vérifiés concernant la présence de duplication dans la région 2p11.2 sans toutefois rien révéler. La séquence codante du gène correspondant à l’exon 1 qui contient environ 70% de la boîte forkhead avait été également séquencée chez trois individus de la famille. Aucun changement d’acide aminé n’était présent. L’exon 2 de ce gène devrait être également séquencé pour éliminer toute possibilité de présence d'une mutation ponctuelle dans la boîte forkhead comme celles existant sur le gène FOXC1 .

En perspective, le projet de découverte du gène associé au locus GLC1B ne pourra pas progresser sans l’ajout de familles liées à cette région de susceptibilité. N’ayant pu trouver d’haplotype commun chez les individus atteints du branchon relié par un ancêtre commun né en 1839, les individus affectés possédant l’haplotype associé au locus GLC1B dans la famille PR du nucléus initial, s’il en est un, ne permettent pas de réduire l’intervalle génétique (et physique) du locus GLC1B déjà connu (11,2 cM). Sans un intervalle plus court, le séquençage systématique de tous les gènes contenus dans l’intervalle ne peut pas être envisagé. Le projet devra donc, dans le futur, être orienté vers le recrutement de nouvelles familles pouvant potentiellement être liées au locus GLC1B pour permettre la diminution de cet l'intervalle. D'un autre côté, il serait possible d'envisager la détermination de signatures alléliques/haplotypiques dans la région de GLC1B chez des individus non reliés exhibant un phénotype similaire à celui présent chez la famille PR. Ces signatures pourraient également permettre de réduire considérablement l'intervalle et relancer le séquençage de gènes candidats. Suite à la mise à jour de plusieurs diagnostics des familles soumises à une analyse de liaison, l'élargissement de certains pedigrees devrait être entrepris. Parmi les plus intéressants, les familles FO, ( GLC1D ) PM ( GLC1E ) et GR ( GLC1F ). Le recrutement de nouveaux individus chez ces familles comme la liaison de nouveaux pedigrees à ces loci pourraient mener à la découverte des nouveaux facteurs génétiques du glaucome situés dans ces régions chromosomiques.