III. Résultats complémentaires

Table des matières

Traitement des cultures .

Les cultures primaires de neurones sont préparées à partir d’hémisphères cérébraux d’embryons de rat de 16 jours (Puymirat, 1992). Les cellules sont dissociées mécaniquement et mises en culture à une densité de 3 x 105 cellules/ml dans des boîtes de culture préalablement traitées à la gélatine (250 μg/ml) et à la poly-L-lysine (10 μg/ml). Les cellules sont cultivées dans du DMEM-F12 supplémenté en glutamine (50 mM), insuline (5 μg/ml), transférine (100 μg/ml), progestérone (6.3 ng/ml), sélénite de sodium (5.2 ng/ml), putréscine (100 μM) et β-oestradiol (1 pM) en atmosphère humide (5% CO2 à 37oC). Les neurones sont traités par la T3 à partir du jour 5 de culture durant 24h. On ajoute alors l’actinomycine D (5 μg/ml) et les cultures sont arrêtées à différents temps de traitement pour déterminer la demi-vie de l’ARN de BTEB.

Une autre expérience a consisté à traiter les cultures primaires par l’actinomycine D (5 μg/ml) ou la cyclohéximide (10 μg/ml) durant 1h avant l’ajout de T3. Les cellules sont récoltées 5h après l’addition de l’hormone, congelées en culot sec à -80ºC ou directement utilisées pour l’extraction des ARNs.

Northern blot .

Les ARNs totaux provenant des cultures traitées sont déposés sur un gel d’agarose-formaldéhyde 1% puis transférés sur une membrane de nylon. Les ARNs sont hybridés avec une sonde spécifique de BTEB ou de la cyclophiline A marquée au 32P (ADNc), lavés dans un bain de SSC 0.1X, SDS 0.5% à température de la pièce pendant 10 min, puis un bain de SSC 0.1X, SDS 0.5% à 67oC pendant 20 min. Ils sont ensuite révélés à l’aide d’un film d’autoradiographie.

Les cultures primaires de neurones ont été traitées en présence ou en absence de T3 par l’actinomycine D durant 1h, 3h ou 6h. L’actinomycine D diminue significativement ( p<0,0001 ) l’ARN de BTEB dès la première heure de traitement. L’analyse par northern-blot a permis de déterminer le temps de demi-vie de l’ARN de BTEB, qui est le même dans les neurones traités ou non par la T3 : 2.6 h ( Figure 11). Ces résultats suggèrent que la T3 régule l’expression de BTEB au moins, en partie, au niveau transcriptionnel.

Les cultures primaires de neurones ont été traitées par la T3 durant 24h puis par 5 μg/ml d’actinomycine D. Les ARNs totaux ont été extraits après 1h, 3h et 6h de traitement et analysés par northern-blot. On observe la même diminution du taux d’ARN de BTEB dans les cultures traitées (•) ou non (5) par la T3. La diminution de l’ARN de BTEB, induite par l’actinomycine D, est significative dès la première heure de traitement, par rapport au contrôle (<) ( p<0.01 ).

Lorsque l’on traite les cultures à l’actinomycine D avant d’ajouter la T3, on annule complètement l’effet de la T3 sur l’augmentation de l’ARN de BTEB ( Figure 12). Tous ces résultats suggèrent fortement que la T3 agit directement sur la transcription de l’ARN de BTEB probablement via le récepteur TRβ1.

La T3 augmente de 5.2 fois (0.8±0.02 versus 4.2±0.03, p<0.01 ) le taux d’ARN de BTEB. L’actinomycine D empêche complètement l’action de la T3 et diminue le taux d’ARN de 80% par rapport au contrôle (0.15±0.01 versus 0.8±0.02, p<0.001 ).

Les cultures primaires de neurones ont été traitées par la cyclohéximide durant 1h, avant d’ajouter ou non de la T3. Les ARNs ont été extraits après 5h de traitement. Contrairement à l’action de l’actinomycine D, la suppression de la traduction par la cyclohéximide augmente de 2.9 fois ( p<0.01 ) le taux d’ARN de BTEB en absence d’hormone et de 5.2 fois ( p<0.001 ) en sa présence ( Figure 13).

Les neurones sont mis en culture pendant 5 jrs avant le traitement. 1h après l’addition de cyclohéximide, les cultures sont traitées ou non par la T3 durant 5h et les ARNs extraits sont analysés en northern-blot. La cyclophiline A sert à normaliser les dépôts. La T3 augmente de 5.2 fois ( p<0.01 ) le taux d’ARN de BTEB. La cyclohéximide augmente significativement le taux d’ARN de BTEB de 2.9 fois (- T3; p<0.05 ) et 22 fois (+T3; p<0.0001 ) par rapport au contrôle.

Ces résultats suggèrent que la synthèse d’une ou plusieurs protéines contribuent à la régulation du taux de l’ARN de BTEB. Elle se situe plus probablement au niveau de la dégradation de l’ARN, qu‘au niveau de la transcription, car plusieurs mécanismes de stabilisation des ARNs sont inhibés par la cyclohéximide (Ross, 1995).

La T3 semble réguler la transcription de l’ARN de BTEB via le récepteur TRβ1 et une (ou des) protéine(s) régulent la stabilisation de l’ARN de BTEB, indépendamment de la T3.

Les protéines MAP2 et Tau, spécifiques des neurones (Caceres et al., 1984), jouent un rôle très important dans l’élongation et la ramification neuritique, par stabilisation et assemblage des microtubules (pour revue Brandt, 1996; Sanchez et al., 2000; Paglini et al., 2000; Buee et al., 2000). Plusieurs études ont montré que ces protéines subissent d’importantes variations dans leur état de phosphorylation in vivo , au cours du développement du cerveau (Binder et al., 1984; Tsuyama et al., 1987; Tucker et al., 1988; Sanchez et al., 1995; Lindwall and Cole, 1984; Butler and Shelanski, 1986; Watanabe et al., 1993), ce qui détermine leur liaison aux microtubules (Brugg and Matus, 1991). Même si leur répartition intracellulaire est spécifique in vivo , MAP2 dans les dendrites, (sauf pour MAP2c aussi retrouvée dans les axones) (Huber and Matus, 1984; Caceres et al., 1984) et Tau dans les axones (Binder et al., 1985), elles sont exprimées uniformément in vitro dans tous les neurites (Diez-Guerra and Avila, 1995). Le niveau de phosphorylation de ces deux protéines est impliqué fortement dans la maturation neuronale in vitro (Diez-Guerra and Avila, 1993; Diez-Guerra and Avila, 1995; Kanai et al., 1989; Caceres and Kosik, 1990) . Les HT augmentent l’élongation ainsi que la ramification des neurites de diverses populations de neurones en culture. Il est donc intéressant de découvrir si ces effets passent par la phosphorylation de ces protéines.

Un épissage alternatif permet d’obtenir plusieurs isoformes de MAP2 à partir du même gène (Papandrikopoulou et al., 1989). En culture, les neurones expriment principalement les isoformes MAP2c/d (70 KDa) et MAP2b (250 KDa) (dites formes juvéniles). Elles sont présentes dans le cerveau en développement et disparaissent vers le 10eme jour postnatal chez le rat (Riederer and Matus, 1985) où apparaît alors MAP2a (270 KDa) (dite forme adulte). Tau est aussi un ensemble d’isoformes codées par différents ARNs issus d’épissage alternatif du même gène. La forme juvénile de Tau (56 KDa) est exprimée très précocement dans le cerveau et est, en général, la seule présente dans les neurones en culture (Butler and Shelanski, 1986). Les HT influencent la répartition de MAP2 dans les neurones (Silva and Rudas, 1990) et régulent l’épissage alternatif de Tau qui donne les diverses isoformes (six au total) présentes dans le cerveau adulte (Aniello et al., 1991; Janke et al., 1996).

Nous avons donc étudié la phosphorylation de MAP2 et Tau dans des cultures primaires de neurones en réponse à la T3. Comme la diminution de l’expression de BTEB affecte la ramification neuritique, nous avons vérifié si cette diminution influence la phosphorylation de ces deux protéines.

Cultures primaires de neurones et traitements .

Les neurones sont traités par les ODNs anti-sens de L’ARN de BTEB ou non-sens à partir du 5eme jour de culture. On ajoute alors la T3 (30 nM) à différents temps.

Phosphorylation in vitro et immunoprécipitation .

200 μCi/ml de milieu de culture d’ortho-phosphate 32P sont ajoutés en même temps que la T3. Les cellules sont récupérées ensuite à différents temps puis lysées dans un tampon d’immunoprécipitation (Tris-HCl 50 mM, pH 7.4; NaCl 150 mM; Tween 20 0.01%; inhibiteurs de protéases (cocktail d’inhibiteur, Roche diagnostic); inhibiteurs de phosphatases (NaF 50 mM; Na pyrophosphate 10 mM; Na orthovanadate 1 mM; EGTA, 2 mM) par congélation-décongélation. Le lysat est centrifugé 30 min à 13000g puis 2 μl d’anticorps anti-MAP2 (clone HM-2) ou anti-Tau (clone Tau-5) sont ajoutés au surnageant. Le mélange est incubé, sous rotation, à température de la pièce, pendant 1H30 puis 25 μl de protéine G-agarose sont ajoutés. L’incubation est poursuivie 1H à température de la pièce, sous rotation. Les billes de protéine G-agarose sont ensuite lavées 3 fois dans le même tampon d’immunoprécipitation et reprises dans du tampon Laemli. Les protéines MAP2 et Tau immunoprécipitées sont déposées sur un gel d’acrylamide de 8% et 10% respectivement. Elles sont ensuite transférées sur membrane PVDF et révélées par un film d’autoradiographie. La quantification des protéines est réalisée par immuno-buvardage sur la même membrane avec les anticorps spécifiques de chaque protéine. Les résultats sont exprimés en reportant la quantification de la phosphorylation sur celle de la protéine.

Immuno-buvardage et 2D.

Les neurones des cultures primaires, traitées ou non par la T3, en présence ou absence d’ODN à différentes concentrations, sont lysés dans un tampon MES (acide morpholino-ethanesulfonique 0.1M, pH 6.5; NaCl 1M; MgCl2 0.5 mM; Triton X100 0.2%; EGTA 1 mM; EDTA 1 mM; Inhibiteurs de protéases (cocktail d’inhibiteur, Roche diagnostic + PMSF 0.1 mM); inhibiteurs de phosphatases (NaF 50 mM; Na pyrophosphate 10 mM; Na orthovanadate 1 mM; EGTA, 2 mM) puis centrifugés à 50000g pendant 30 min à 4ºC. Le surnageant est ensuite bouilli 5 min après ajout de 0.5% de β-mercapto-éthanol. Après centrifugation à 50000g pendant 20 min à 4ºC, une partie du surnageant est récupérée et déposée sur un gel d’acrylamide de 10%. Après transfert sur membrane PVDF, les protéines sont immuno-buvardées avec un anticorps anti-MAP2 (clone HM-2) ou anti-Tau (clone Tau-5). L’autre partie subit une précipitation partielle à l’acide perchlorique 2.5% pour purifier partiellement la protéine Tau. Après centrifugation à 50000g pendant 20 min à 4ºC, les protéines du surnageant sont précipitées au TCA 6% et le culot de protéines est lavé 3 fois à l’éthanol 100%. Ce culot est déposé sur une barrette de gradient de pH immobilisé (de 3 à 10; Pharmacia biotech). Après électrofocalisation des protéines, la barrette est déposée sur un gel d’acrylamide 10%. Les protéines sont transférées sur PVDF et incubées avec le clone Tau-5. La détection est réalisée à l’aide d’un anticorps anti-IgG de souris couplé à la péroxidase. La révélation est effectué par ECL. La normalisation a été faite en utilisant un anticorps dirigé contre une protéine nucléaire ubiquitaire de 55 KDa, 2B3G8 (J Puymirat, communication personnelle ).

Le gel Anderson permet de séparer les isoformes phosphorylées. On peut arriver, dans certains cas, à séparer deux états de phosphorylation distincts de seulement un site. À chaque pourcentage de gel correspond un rapport acrylamide/bis-acrylamide différent. Pour un gel de 10%, le rapport est de 77 : 1. Le gel de tassement est le même que pour un SDS-page normal et la migration est effectuée dans un tampon glycine (glycine 28 g/l; Tris base 6 g/l; SDS 0.1%). Un gel de10% acrylamide a été utilisé pour séparer les différentes isoformes des protéines MAP2 et Tau.

La phosphorylation de la protéine Tau, sous l’influence de la T3, a été analysée après immunoprécipitation, migration sur gel d’acrylamide et transfert sur PVDF ( Figure 15). On observe une diminution de 1.6 fois en moyenne (entre 1.2 fois et 2.1 fois; p<0.05 ) de la phosphorylation de Tau en présence de l’hormone après trois heures de traitement. Par contre, les ODNs anti-sens de BTEB n’ont aucun effet sur cette phosphorylation ( p=0.22 ). On observe la même différence de phosphorylation de Tau entre les neurones traités et non traités par les ODNs.

Les cultures préalablement traitées ou non durant 24h par l’anrisens de BTEB (1.5 μM) reçoivent de la T3 (30nM) en présence d’ortho-phosphate 32P. Après 3h de traitement la protéine Tau est immunoprécipitée par un anticorps anti-Tau et déposée sur gel d’acrylamide à 10 %. Le taux de phosphorylation est calculé en reportant la quantification de la phosphorylation sur la quantité de protéine. Le résultat est exprimé en % du contrôle. *, p<0.05 sur 4 expériences réalisées à partir de 4 cultures différentes .

Cette différence dans la maturation post-traductionnelle de Tau, induite par la T3, est confirmée par migration sur un gel en 2 dimensions (2D) et par le gel Anderson ( Figure 16). Ce dernier permet de séparer les isoformes dans différents états de phosphorylation. Le gel en 2D montre une diminution des isoformes ayant un point isoélectrique ( pi ) bas ainsi qu’une augmentation des isoformes qui ont un pi élevé en présence de T3. La phosphorylation d’une protéine abaisse son pi apparent et le déplacement des isoformes vers les pi élevés conforte les résultats obtenus précédemment sur la déphosphorylation de Tau par la T3. Le gel Anderson confirme que plusieurs isoformes phosphorylées diffèrent entre le traitement par la T3 et l’absence de traitement. La T3 semble agir sur plusieurs sites de phosphorylation de Tau, modifiant ainsi sa capacité de liaison aux microtubules et probablement ces fonctions d’assemblage et d’élongation de ces derniers.

  1. Gel 2 dimensions : Déplacement des isoformes vers les pi élevés en présence de T3.

  2. Gel Anderson : 2 bandes supplémentaires en présence de T3 (flèche rouge) et 3 bandes supplémentaires en absence de T3 (flèches noires).

La phosphorylation spécifique de certains sites dans le domaine de liaison aux microtubules, par des kinases ou phosphatases spécifiques, régule les fonctions d’assemblage et de stabilisation de Tau (Merrick et al., 1996), impliquées dans le développement de la neuritogénèse (Biernat and Mandelkow, 1999). L’hyperphosphorylation de Tau diminue son interaction avec les microtubules et est impliquée dans des maladies neurodégénératives comme la maladie d’Alzheimer (Billingsley and Kincaid, 1997). La T3 diminue la phosphorylation générale de Tau et renforcerait ainsi son interaction aux microtubules. Cet effet augmenterait ces propriétés d’assemblage et de stabilisation des microtubules, induisant la croissance axonale et le transport vésiculaire jusqu’aux terminaisons dépendantes de Tau.

La phosphorylation de la protéine MAP2, sous l’influence de la T3, a été analysée comme pour la protéine Tau ( Figure 17). On observe une diminution de 1.3 fois (varie de 1.17 fois à 1.4 fois; p >0.01 ) de la phosphorylation de Tau en présence de l’hormone après six heures de traitement. La T3 a moins d’effet sur la phosphorylation globale de cette protéine que sur celle de Tau. De plus cette différence de phosphorylation n’est visible qu’après 6h de traitement par l’hormone au lieu de 3h pour Tau. Mais contrairement à cette dernière, l’ODN antisens de BTEB abolit l’effet de la T3 (1 versus 1.24 ± 0.07, p<0.01) et restaure quasiment le niveau de phosphorylation détecté en absence d’hormone (1.3 ± 0.12 versus 1.24 ± 0.07, p=0.3 ). La phosphorylation de MAP2 influence la polymérisation de la tubuline et la stabilisation des microtubules. Tout comme pour Tau, la phosphorylation spécifique de certains sites dans le domaine de liaison aux microtubules régule, par des kinases ou phosphatases spécifiques, les fonctions d’assemblage et de stabilisation de MAP2 (Ainsztein and Purich, 1994; Olesen, 1994; Itoh et al., 1997; Sanchez Martin et al., 1998). Ceci expliquerait pourquoi l’état global de phosphorylation de MAP2 est peu modifié par l’action de la T3.

Les cultures préalablement traitées ou non durant 24H aux ODNs (1.5 μM) reçoivent de la T3 (30nM) en présence d’ortho-phosphate 32P. Après 6 H de traitement la protéine MAP2 est immunoprécipitée par un anticorps spécifique et déposée sur gel d’acrylamide à 8 % . Le taux de phosphorylation est calculé en reportant la quantification de la phosphorylation sur la quantité des isoformes MAP2c/d. Le résultat est exprimé en % du contrôle. **, p<0.01 par rapport aux cultures traitées par la T3 ; *a, p<0.05 par rapport aux cultures traitées par l’ODN anti-sens . n= 3 expériences réalisées à partir de 3 cultures différentes.

Cette différence dans la maturation post-traductionnelle de MAP2 induite par la T3 est partiellement confirmée par le gel Anderson. Une bande supplémentaire apparait au niveau de MAP2c/d en absence de T3 et une bande supplémentaire en présence de T3 au niveau de MAP2b. Malheureusement, nous n’avons pu observer cet effet de la T3 sur la phosphorylation de MAP2b lors des essais de phosphorylation par l’ortho-phosphate 32P, en raison peut-être du faible taux de phosphorylation de cette isoforme, rendant sa détection difficile. Ces résultats confirment qu’il y a une réelle différence dans l’état de phosphorylation des isoformes de MAP2 entre les cultures traitées et non traitées par la T3. Il semble que la phosphorylation dépendante de la T3 affecte peu de sites même s’il est évident qu’au moins deux isoformes différents sont modifiés sous l’action de la T3.

L’analyse du gel Anderson attribue 1 bande supplémentaire en présence de T3 (flèche rouge) à MAP2b et 1 bande supplémentaire sans traitement (flèches noires) à MAP2c/d.

Il est admis que l’hyperphosphorylation de MAP2 diminue sa capacité de liaison aux microtubules et que la diminution de sa phosphorylation l’augmente. Il est donc intéressant de constater que la T3 diminue cette phosphorylation et ainsi augmenterait l’activité de MAP2, en corrélation avec l’augmentation de l’élongation et de la ramification induites par l’hormone. En faveur de cette hypothèse, des études d’inhibition de certaines kinases et phosphatases impliquées dans la phosphorylation de MAP2 apportent des éléments intéressants. Par exemple, la protéine kinase II dépendante de la Ca2+-calmoduline (CaMKII) est essentiellement retrouvée dans les neurones et peut phosphoryler MAP2 sur 18 sites différents. Cette kinase induit la neuritogénèse dans les N2a lorsqu’elle est sur-exprimée (Goshima et al., 1993), et une diminution de la ramification dendritique et axonale lorsqu’elle est inhibée (Audesirk et al., 1997). De plus, sa distribution est retardée dans le cerveau de rats hypothyroïdiens (Wang and Rostas, 1996). La calcineurine PP2B est une phosphatase capable de déphosphoryler les sites propres aux kinases CaMKII et PKA sur MAP2 (Goto et al., 1985; Gong et al., 2000). Elle est associée aux microtubules in vivo (Dudek and Johnson, 1995) et son inhibition entraîne une diminution de la ramification dendritique (Audesirk et al., 1997). L’activité des calcineurines est régulée par les HT in vivo (Ruiz de Elvira et al., 1989). Les HT pourraient jouer un rôle sur la phosphorylation de MAP2 in vivo par l’intermédiaire de la régulation d’une(de) kinase(s) ou d’une(de) phosphatase(s) dans les neurones. Cet effet pourrait participer à l’action des HT sur la ramification et/ou l’élongation dendritique au cours du développement. BTEB pourrait être un intermédiaire entre les HT et la régulation de la phosphorylation de MAP2.