IV. Conclusion

Ce travail de thèse a permis de mettre en évidence plusieurs points permettant de mieux comprendre l'action des HT sur le développement neuronal. D'une part, l’expression d’un récepteur TRβ1 muté spécifiquement dans les neurones est suffisante pour altérer le développement du cervelet. D'autre part, l'inhibition de la production de BTEB conduit a l'abolition de la ramification neuritique induite par la T3, sans en affecter l’élongation. Les actions de la T3 sur la ramification et l'élongation neuritique pourraient inclure la participation des protéines MAP2 et Tau.

Spécificité d’expression et d’action du transgène hmTRβ1 .

Les souris transgéniques que nous avons produites sur-expriment spécifiquement dans les neurones et le cerveau un récepteur TRβ1 humain (hmTRβ1), muté en position 345 (G→R ; Sakurai, 1989), ce qui annihile la liaison de l’hormone. Le promoteur utilisé est celui des neurofilaments léger humain (hNF-L ; Charron et al., 1995a) qui permet une expression stricte au cerveau (cortex, cervelet, pédoncule cérébral, moelle épinière) chez l’adulte et chez l’embryon. L’expression du transgène sous l’influence de se promoteur est toutefois restreinte au myélencéphale et à la moelle épinière lors de l’embryogenèse (Charron et al., 1995b). Ceci suggère que notre transgène n’est pas exprimé dans le cervelet pendant sa formation prénatale. Nous observons la présence du transgène dés le 5eme jour postnatal mais nous n’avons pas investigué son expression sur une période antérieure. Les altérations observées de la lobulation déjà au 5eme jour postnatal suggèrent que le transgène est exprimé avant cette date dans le cervelet et provoque la perte de neurones diminuant l’aire des hémisphères cérébelleux. Néanmoins, seules les cellules de Purkinje expriment le récepteur hmTRβ1 jusqu’au 20eme jour postnatal, dernière date testée et nous n’avons pas observé d’anomalie dans la densité de ces cellules. Il semble que le récepteur hmTRβ1 n’ait, soit pas d’effet sur la genèse de ces cellules, soit qu’il est produit après la formation de ces neurones (vers le jour E17 au plus tôt).

Les cellules de Purkinje n'expriment que le récepteur TRβ1 et de façon infime, le récepteur TRβ2 (Bradley et al., 1992; Li and Boyages, 1996). Le récepteur hmTRβ1 agit en compétition avec le récepteur normal endogène pour la liaison aux TREs présents dans les promoteurs des gènes cibles (Sakurai et al., 1990). Cette compétition se caractérise par une activité dominante négative de la part du récepteur muté, diminuant le fonctionnement du récepteur TRβ1 normal de plus de 75% (Tagami and Jameson, 1998). Le récepteur TRβ2 est le RT majoritaire des neurones de l’hypophyse produisant la TSH (Hodin et al., 1989) et l’action d’un récepteur TRβ1 muté sur son fonctionnement semble peu efficace. En effet, l’expression du récepteur hmTRβ1 spécifiquement dans l’hypophyse n’a aucun effet sur la concentration de TSH sérique (Hayashi et al., 1998), alors que l’absence de TRβ2 provoque son augmentation de plus de 5 fois (Abel et al., 2001). Tous ces résultats suggèrent que l’expression du récepteur hmTRβ1 dans le cervelet de nos souris transgéniques n’interfère qu’avec le fonctionnement du récepteur TRβ1, entraînant les désordres du développement du cervelet que nous avons observés. Il semble jouer un rôle majeur dans la plupart des étapes de développement du cervelet (maturation des cellules de Purkinje, prolifération des cellules granulaire dans l’EGL, migration de ces neurones jusqu'à l’IGL et survie de ces neurones dans l’IGL)par le biais les cellules de Purkinje.

Maturation des cellules de Purkinje lors du développement du cervelet .

L’effet de l’absence d’HT in vivo sur le développement des cellules de Purkinje est bien établi (Legrand, 1982). Récemment, des études menées in vitro ont montré l’importance de la T3 et T4 sur le développement dendritique des cellules de Purkinje (Kimura-Kuroda et al., 2002). Mais, dans les conditions utilisées, cet effet pouvait être indirectement produit par l’action des HT sur d’autres types cellulaires (cellules granulaires, astrocytes et/ou interneurones), étroitement connectés aux cellules de Purkinje (Seil, 2001). L’expression spécifique du transgène chez nos souris transgéniques, par les cellules de Purkinje, suggère que l’altération de leur arborisation est due à un effet direct du disfonctionnement du récepteur TRβ1 induit par hmTRβ1 dans ces neurones.

L’élaboration de l’arbre dendritique des cellules de Purkinje semble un processus très complexe car il implique l’action de nombreux gènes, aux vues des résultats obtenus chez plusieurs modèles de souris transgéniques qui présentent une hypoplasie de ces dendrites. Deux gènes en particulier pourraient jouer un rôle dans l’action du récepteur TRβ1 sur le développement des cellules de Purkinje. Il s’agit des facteurs de transcription rev-erbAα et RORα. Des souris dépourvues du récepteur orphelin rev-erbAα??, qui est spécifiquement exprimé par les cellules de Purkinje de P7 à P15, manifestent un retard du développement de l’arbre dendritique dés P10, dans tout le cervelet (Chomez et al., 2000). Ce facteur pourrait agir en compétiteur des TRβ ou du facteur RORα pour la liaison sur leurs sites de liaison spécifiques respectifs présents sur les promoteurs des gènes cibles. Rev-erbAα active, de façon constitutive, la transcription des gènes dont le promoteur renferme certains sites TREs (Harding and Lazar, 1993; Spanjaard et al., 1994) et inhibe l’activation de la transcription par RORα (Forman et al., 1994). Son absence permettrait aux TRβ et/ou à RORα d’avoir accès à ces promoteurs et de changer l’expression de ces gènes pouvant induire un retard du développement de l’arbre dendritique. Le facteur RORα a la propriété d’activer la transcription induite par les HT (Koibuchi et al., 1999) et semble jouer un rôle important dans le processus de maturation des cellules de Purkinje. 1) Il est spécifiquement exprimé par les cellules de Purkinje dans le cervelet (Koibuchi and Chin, 1998). 2) Il est positivement régulé par les HT in vivo . 3) Son absence entraîne une forte mortalité ainsi qu’un retard de la maturation de ces neurones (Hamilton et al., 1996a). Le mécanisme exact par lequel ces facteurs interagissent entre eux dans ce processus de maturation des cellules de Purkinje reste encore à définir. Le gène Pcp-2 de fonction inconnue, spécifique des cellules de Purkinje, pourrait être un intermédiaire possible dans cette interaction. En effet, son expression est régulée par les HT in vivo via probablement TRβ1 (Strait et al., 1992) et son promoteur possède des sites de liaison pour les RT (Zou et al., 1994) ainsi que pour RORα (Matsui, 1997). Des résultats obtenus dans cette thèse nous permettent d'envisager un autre mécanisme possible, décrit dans les prochains paragraphes, par lequel le récepteur TRβ1 pourrait induire le développement de l’arborisation des cellules de Purkinje.

Notre laboratoire a récemment découvert un nouveau facteur de transcription, BTEB, régulé in vivo par les HT (Denver et al., 1999). Cette régulation semble médiée spécifiquement par le récepteur TRβ1 car la T3 augmente l’expression de l’ARN de BTEB dans les N2a-TRβ1 mais pas dans les N2a-TRα1 (Denver et al., 1999). Nos souris transgéniques présentent un retard de l’expression de l’ARN de BTEB dans le cervelet mais moindre que celui obtenu dans les souris hypothyroïdiennes. Les trois types cellulaires majoritaires du cerveau expriment BTEB mais la T3 n’élève significativement l’expression de BTEB que dans les neurones. Cette différence de retard d’expression pourrait être due à la l’altération de son expression uniquement dans les cellules de Purkinje, neurones minoritaires en nombre dans le cervelet. L’intérêt de ce facteur est que sa sur-expression dans des N2a induit une neuritogenèse. Les études réalisées, lors de cette thèse, sur des cultures primaires de neurones ont révélé une implication de ce facteur dans la maturation neuritique induite par la T3. Sa suppression entraîne une diminution quasi-totale de la ramification neuritique induite par l’hormone sans en affecter l’élongation. Ces résultats suggèrent que deux mécanismes distincts coexistent pour induire la ramification d’une part, et l’élongation neuritique d’autre part.

Le processus de la maturation neuritique est fortement régulé par les HT in vivo (Legrand, 1982) et celui-ci implique la participation du cytosquelette et de ces protéines associées (MAPs) qui modulent la polymérisation et la stabilité des microtubules (Tucker, 1990). Parmis ces MAPs, deux protéines jouent un rôle très important dans la maturation axonale et dendritique : MAP2 et Tau (Johnson and Jope, 1992 ; Sheetz et al., 1998 ; Sheetz et al., 1998; Paglini et al., 2000). La maturation et la distribution de ces deux protéines sont régulées par les HT lors de la maturation neuronale dans le cervelet. En accord avec ces données, nous n’avons observé aucun effet de la T3 sur le niveau d’expression de ces deux protéines dans les neurones en culture. Par contre, l’état de phosphorylation des protéines MAP2 et Tau, joue un rôle important dans les processus de ramification et d‘élongation neuritique (Diez-Guerra and Avila, 1993; Mawal-Dewan et al., 1994 ; Diez-Guerra and Avila, 1995 ; Lovestone and Reynolds, 1997). Plus que l’état général de phosphorylation de ces protéines, il semble que la phosphorylation de certains sites précis influence davantage le fonctionnement de ces protéines (Riederer et al., 1995; Sanchez et al., 2000; Wagner et al., 1996; Biernat and Mandelkow, 1999 ; Evans et al., 2000). Des résultats préliminaires obtenus lors de cette thèse indiquent que la T3 intervient dans la déphosphorylation de certains sites de ces deux protéines. Au moins cinq sites de Tau semblent influencé par la T3 ce qui suggère que cette protéine participe à l’effet de T3 sur la maturation neuronale. De par sa distribution et son influence établie sur l’élongation axonale, Tau contribuerait surtout à l’élongation neuritique induite par la T3. Le manque d’effet de l’inhibition de BTEB (qui n’a aucune répercussion sur l’élongation neuritique) sur la phosphorylation de Tau induite par la T3 appuie cette hypothèse. L’activité de certaines kinases et phosphatases, contribuant à la phosphorylation de Tau, pourrait être régulée par les HT. En effet, l’action de la T3 sur l’activité de certains types de kinases en cultures a déjà été décrit (Shanker and Pieringer, 1987 ; Perez-Juste and Aranda, 1999) comme par exemple, la kinase cdc2 (Williamson et al., 2002) qui induit la phosphorylation de près de dix sites différents de Tau. Nous avons observé que la T3 influence la phosphorylation d’au moins deux sites sur les protéines MAP2c et MAP2b. Tout comme Tau, MAP2 est hyper-phosphorylée in vivo (près de quarante sites phosphorylés). Les HT régulent notamment la phosphatase PP2B in vivo qui participe à la déphosphorylation de plus de 10 sites différents sur MAP2. L’implication de cette enzyme dans la ramification neuritique (Audesirk et al., 1997) rapportée à la distribution dendritique de MAP2 suggère que cette dernière participerait à la ramification neuritique induite par la T3. L’altération de la ramification par inhibition de BTEB, qui semble supprimer aussi la déphosphorylation de MAP2 induite par la T3, est en faveur de cette hypothèse. MAP2 est fortement exprimée dans les dendrites des cellules de Purkinje et l’absence d’hormone dans les souris hypothyroïdiennes pourrait induire l’altération de sa distribution provoquée par sa sur-phosphorylation. Le disfonctionnement du récepteur TRβ1 dans nos souris transgéniques pourrait avoir la même conséquence.

Prolifération des cellules granulaires dans la CGE . et migration vers la CGI.

Nous avons observé un retard de l’arrêt de la prolifération dans la CGE et un retard de migration des cellules granulaires vers la CGI dans le cervelet de nos souris transgéniques. Ces résultats suggèrent que les cellules de Purkinje sont indispensables pour ces deux processus. D’autres modèles de souris transgéniques présentent les mêmes altérations de maturation des cellules granulaires. Les souris dépourvues du facteur rev-erbAα présentent aussi le mêmes retard de maturation des cellules granulaires (Chomez et al., 2000). La perte complète de RORα ou de la cycline-kinase 5 (cdk5) occasionne une forte altération du développement du cervelet uniquement par déficit des cellules de Purkinje par mortalité précoce (Hamilton et al., 1996b) ou par défaut de migration (Ohshima et al., 1999). Tous ces modèles mettent en lumière l’importance majeure des cellules de Purkinje dans le développement du cervelet.

Le fonctionnement normal du récepteur TRβ1, nécessaire à la maturation complète des cellules de Purkinje, est vraisemblablement impliqué dans l’évolution de la CGE. Une controverse existe dans la littérature sur le rôle spécifique tenu par les RT dans ce processus. Cette couche disparaît normalement à partir du 15eme jour postnatal chez les rongeurs mais persiste quelques jours de plus chez les animaux hypothyroïdiens (Lauder, 1977). Elle est constituée de deux zones, une externe de prolifération et une interne de prémigration. Les cellules granulaires en prolifération n’expriment aucun TR. L’arrêt de la prolifération et le passage dans la zone prémigratoire s’accompagne de l’apparition du récepteur TRα1 dans ces cellules. Il est encore peu clair si l’arrêt de la prolifération est dû à l’apparition du récepteur Trα1 ou bien si un signal extérieur provoque cet arrêt qui induit, à son tour, l’expression de ce récepteur. Récemment a été émis l’hypothèse que le récepteur Trα1 était seul responsable de l’arrêt de la prolifération et de la migration des cellules granulaires (Morte et al., 2002). Des résultats similaires aux nôtres obtenus par l’équipe du Dr Wondisford en changeant le gène TRβ par une construction générant uniquement des récepteurs TRβ1 et TRβ2 mutés pour la liaison de l’hormone renforce notre hypothèse de départ et affaiblit considérablement celle du laboratoire du Dr Bernal (Hashimoto et al., 2001). Leur construction permet une expression de ces récepteurs déficients dans toutes les cellules du corps produisant normalement les récepteurs TRβ. Les résultats obtenus dans ces souris suggèrent un rôle majeur des récepteurs TRβ dans la maturation des cellules granulaires. Mais, par contre, il est difficile à partir de ces souris de tirer une conclusion sur le rôle précis du récepteur TRβ1 et de chaque type cellulaire dans la maturation du cervelet pour plusieurs raisons. 1) Les deux récepteurs TRβ sont affectés dans ce modèle, ce qui rend ambigu l’implication spécifique d’un récepteur en particulier. 2) Toutes les cellules du corps, qui expriment normalement ces deux récepteurs, produisent les récepteurs mutés. L’altération du développement du cervelet observé chez ces souris pourrait être indirectement produite par l’action périphérique des TRβ mutés. De plus, la croissance des cellules gliales (astrocytes et oligodendrocytes) peut être affectée par ces récepteurs mutés puisqu’elles expriment normalement le récepteur TRβ1, comme les cellules de Purkinje (Carlson et al., 1996 ; Carre et al., 1998). Puisque les cellules granulaires utilisent les prolongements des cellules de Bergmann (astrocytes) pour leur migration (Grovas and O'Shea, 1984; Ezerman, 1991), dans ces souris l’action spécifique des cellules de Purkinje sur ce phénomène est équivoque. Mais leurs résultats combinés aux nôtres et à la spécificité d’action et d’expression de notre transgène hmTRβ1 permettent d’émettre l’hypothèse suivante : le récepteur TRβ1 induit l’arrêt de la prolifération des cellules granulaire dans la CGE et leur migration vers la CGI par l’intermédiaire des cellules de Purkinje.

Deux voies d’activation de la prolifération, présentes lors de la formation du cerveau pendant l’embryogenèse, semblent coexister pendant le développement postnatal du cervelet, chez les rongeurs, et pourraient être impliquées dans les effets du récepteur TRβ1: la voie de signalisation de Sonic hedgehog (Shh) (Rowitch et al., 1999) et celle de Notch (Lindsell et al., 1996). En effet, ces deux voies induisent une prolifération des cellules granulaires de la CGE (Dahmane and Ruiz-i-Altaba, 1999; Solecki et al., 2001; Wallace, 1999). Est-ce que la prolifération des cellules granulaires de la CGE et la migration vers la CGI sont deux phénomènes indépendants ? On peut envisager que l’arrêt de la prolifération est nécessaire au passage des cellules granulaires vers la zone pré-migratoire et ainsi au déroulement convenable de la migration à travers la CM. TRβ1 pourrait induire l’expression, ou bien la génération de la forme active de Shh, produit uniquement par les cellules de Purkinje, qui va activer son récepteur, Patched (Ptc), présent dans la zone proliférative de la CGE uniquement. De plus, Shh régule l’expression du facteur de transcription gli1, co-localisé avec Ptc (Wallace, 1999), qui est connu pour son rôle majeur dans la prolifération des précurseurs neuronaux (Britto et al., 2002). De plus, Shh induit la différentiation des cellules de Bergmann, impliquées dans la migration des cellules granulaires (Dahmane and Ruiz-i-Altaba, 1999). On retrouve aussi une spécificité de localisation de certains membres de la voie de Notch dans le cervelet en développement, chez les rongeurs. Le plus abondant des récepteurs Notch dans la CGE est l’isoforme Notch2. Il est présent dans la zone externe de la CGE uniquement durant la phase proliférative (jusqu’à environ P10) (Tanaka et al., 1999). Plusieurs ligands de Notch2 sont présents dans le cervelet mais seul Delta3 est exprimé spécifiquement par les cellules de Purkinje (Stump et al., 2002). Notch nécessite un contact de cellule à cellule pour être activé et contrôle alors l’expression de facteurs de transcription comme Hes1, régulateur négatif de la neurogenèse (Kageyama et al., 1995).

Survie des cellules granulaires dans la CGI .

Nous avons remarqué une augmentation nette de l’apoptose dans la CGI à 15 jours chez nos souris transgéniques, équivalente à celle observée chez les animaux hypothyroïdiens (Patel and Rabie, 1980). L’altération de l’arbre dendritique pourrait être la principale cause de ce phénomène. Les cellules granulaires créent des synapses par l’intermédiaire de leurs axones (les fibres parallèles) avec les dendrites des cellules de Purkinje dés le 5eme jour postnatal (Lossi et al., 2002). Le manque de contacts appropriés entre ces deux types de prolongements prévient le passage d’information des cellules de Purkinje vers les cellules granulaires (Herrup and Busser, 1995). Celles-ci continuent à migrer mais meurent en arrivant dans la CGI par absence d’un signal de survie. Les neurotrophines citées plus haut interviennent aussi dans la survie des neurones et annulent l’action du déficit en HT sur l’augmentation de l’apoptose dans la CGI (Neveu and Arenas, 1996).

Au final... .

Nous avons recherché l’implication du récepteur TRβ1 dans la régulation de la maturation neuronale par les HT. Pour cela, nous avons développé une lignée de souris transgéniques exprimant, spécifiquement dans les neurones, un récepteur TRβ1 muté (hmTRβ1), qui affecte le fonctionnement du récepteur TRβ1 endogène. L’expression unique du transgène par les cellules de Purkinje nous a permis de déterminer le rôle majeur tenu par TRβ1 dans le développement neuronal du cervelet. Son disfonctionnement altère directement la maturation des cellules de Purkinje : le développement du corps cellulaire est retardé et on observe une hypoplasie de l’arbre dendritique. Le facteur de transcription BTEB, dont l’expression semble régulée par le récepteur TRβ1, est un médiateur de l’effet des HT sur la ramification neuritique et la déphosphorylation de MAP2. La production de hmTRβ1 par nos souris transgéniques engendre une diminution de l’expression de BTEB dans le cervelet, qui pourrait occasionner la sur-phosphorylation de MAP2, conduisant au défaut de maturation de l’arbre dendritique observé.

Le disfonctionnement de TRβ1 dans les cellules de Purkinje et/ou l’altération de la maturation de ces neurones provoquent une persistance de la prolifération des cellules granulaires dans la CGE et un retard de leur migration dans la CGI. Même si les cellules granulaires expriment le récepteur Trα1, il semble que TRβ1 joue un rôle majeur dans la maturation de ces neurones par le biais des cellules de Purkinje. Celles-ci dispenseraient divers signaux aux cellules granulaires provocants l’arrêt de leur prolifération et/ou leur migration à travers la CM. Trois voies de signalisation possibles, susceptibles de coexister, pourraient participer à l’action du récepteur TRβ1 sur la diffusion d’information par ces neurones : la voie des neurotrophines NT-3 et BDNF, celle de Sonic hedgehog-Patched et celle de Notch2-Delta.