Chapitre 3 Résultats et discussion

Table des matières

Pour mettre au point le système de Lentivirus et ainsi pouvoir infecter des neurones primaires, les essais de transfections et d’infections ont été effectuées sur des cellules embryonnaires de reins humains 293T. Lors d’un premier essai, en utilisant la méthode au chlorure de calcium, nous avons transfecté 5μg de PMDG, 20μg de PCMV∆R8,9 et 12μg pSIN/PS1H115Y dans les cellules 293T. Dans ce cas-ci, notre gène d’intérêt est la préséniline1 mutée, une mutation impliquée dans le développement de la maladie d’Alzheimer sous forme héréditaire. La mutation H115Y résulte de l’inversement d’un acide aminé pour un autre, l’histidine est remplacée par une tyrosine. Après la transfection, le milieu d’infection est récupéré et les cellules sont infectées avec des virions qui contiennent notre gène d’intérêt PS1H115Y (voir méthode point 2.8). L’ARN total, des cellules infectées avec différentes quantités de milieu d’infection, servira à réaliser un RT-PCR (voir méthode point 2.11 et 2.12).

Les produits obtenus après RT-PCR sont vérifiés sur gel d’agarose 1% (figure 9). Dans chacun des puits nous voyons une augmentation de l’intensité de la bande à 700pb, ce qui corrèle avec l’augmentation de la quantité de milieu d’infection utilisée de 0, 50μl, 100μl, 250μl, 500μl jusqu’à 1000μl. Le contrôle se retrouve dans le premier puits où aucune quantité de milieu d’infection a été ajoutée sur les cellules. Ainsi, la bande de faible intensité retrouvée dans ce puits représente l’expression endogène de la protéine PS1 dans les cellules HEK293T. D’après les résultats obtenus, nous pouvons déterminer la quantité de milieu d’infection optimale pour infecter d’autres cellules avec ce même milieu d’infection.

Ces résultats montrent que le système de Lentivirus est efficace, car une augmentation de l’intensité des bandes corrèle avec l’augmentation de la quantité de milieu ajoutée. Ceci indique qu’il y a une augmentation de l’ARNm menant à la formation de notre protéine d’intérêt. Nous voulions reproduire les mêmes résultats mais en utilisant des plasmides qui contiennent une portion du gène Notch; pSIN/E+C ou pSIN/ICN.

Figure 9 Vérification sur gel d’agarose 1% des produits du RT-PCR suite à l’infection des cellules HEK293T par le système de Lentivirus. Les vecteurs utilisés pour l’infection sont PMDG, PCMV∆R8,9 et pSIN/PS1H115Y. Le contrôle négatif se retrouve dans le puits 1. Les cellules des puits 2 à 6 ont été infectées avec une quantité de milieu d’infection précise de 50μl, 100μl, 250μl, 500μl et 1000μl. Dans chacun des puits, il apparaît une bande de 700pb qui augmente d’intensité du puits 1 à 6.

La portion E+C du gène Notch (figure 4) est rattachée à la membrane et doit être clivée par la γ-sécrétase pour libérer le domaine intracellulaire de Notch (NICD). Ainsi, le domaine NICD pourra transloquer au noyau et avoir un effet sur des gènes cibles. En ce qui concerne la portion ICN de Notch, aucun clivage n’est nécessaire. Le fragment ICN sera constitutivement actif lorsque présent dans la cellule.

Plusieurs essais ont été effectués avec le plasmide pSIN/E+C ou pSIN/ICN pour obtenir les mêmes résultats qu’avec le vecteur pSIN/PS1H115Y. Nous nous sommes assurés d’utiliser les mêmes conditions. Les résultats obtenus après plusieurs essais pour pSIN/E+C (figure 10A) ou pSIN/ICN (figure 10B) sont négatifs, il n'y a aucune bande de 1kb tel qu’attendue. Pour s’assurer que la réaction de RT-PCR n’est pas la cause des résultats négatifs obtenus, nous avons utilisé des contrôles positifs. Le contrôle positif pour la réaction de la transcription inverse consiste à prendre l’ADNc nouvellement synthétisé après le RT de quelques échantillons et d’effectuer une réaction PCR dans le but d’amplifier le gène GAPDH. Le gène GAPDH est une enzyme clé dans la voie de la glycolyse et il est exprimé de façon ubiquitaire dans la cellule (Berry and Boulton 2000). Le contrôle de la réaction PCR consiste à mettre 1μl du vecteur pSIN/E+C au lieu de l’ADNc provenant du RT et d’effectuer la réaction PCR en utilisant les mêmes conditions que dans les autres tubes.

Figure 10 Vérification sur gel d’agarose 1% des produits du RT-PCR suite à l’infection des cellules HEK293T par le système de Lentivirus. Les vecteurs utilisés pour l’infection sont PMDG, PCMV∆R8,9 et pSIN/E+C (A) ou pSIN/ICN (B). Le contrôle négatif se retrouve dans le puits 1 de chacun des gels. Les cellules des puits 2 à 6 ont été infectées avec une quantité de milieu d’infection précise de 50μl, 100μl, 250μl, 500μl et 1000μl. Il n’apparaît aucune bande dans ces puits. (A) Dans le puits 7, il y a amplification du contrôle positif de la réaction PCR, soit une bande à 1Kb. (B) Dans les puits 7 à 10, amplification du gène GAPDH donnant une bande à 570pb, soit les contrôles du RT.

Les résultats négatifs obtenus ne mettent pas en cause la réaction PCR car il y a eu amplification d’une bande de forte intensité à 1kb, la longueur attendue (puits 7, figure 10A). Il en est de même pour la transcription inverse, car il y a eu amplification de GAPDH représenté par une bande de forte intensité de 570pb (puits 7 à 10, figure 10B) à partir des 4 échantillons d’ADNc vérifiés. Suite à ces essais et aux résultats obtenus, nous avons envisagé d’autres alternatives en nous concentrant sur les diverses méthodes de transfections existantes ainsi que sur la concentration des virions.

Au lieu de transfecter nos cellules HEK293T en utilisant le chlorure de calcium, nous avons fait des essais avec la méthode d’électroporation et en utilisant des produits spécifiques permettant l’intégration de l’ADN plasmidique dans les cellules tels que Fugene et la lipofectamine. Malgré tous ces essais, nous n’avons pas obtenu les résultats escomptés lorsque nous vérifions sur gel d’agarose les produits de RT-PCR des cellules infectées. En effet, soit qu’il n’y avait aucune bande du poids moléculaire attendu ou bien il n’y avait aucune augmentation de l’intensité des bandes en corrélation avec l’augmentation du milieu d’infection utilisé. Étant donné que les réactions de transcription inverse et de polymérisation en chaîne sont contrôlées lors des essais, nous avons regardé si l’étape limitante était la transfection ou bien l’infection.

Pour ce faire, le plasmide pSIN.EGFP/PS1wt a été transfecté par électroporation. L’utilisation de ce plasmide a l’avantage que le gène de la préséniline1 est fusionné avec EGFP qui lorsque intégré dans une cellule émettra une couleur verte sous microscope à fluorescence. Nous pouvions ainsi contrôler l’étape de la transfection mais également celle de l’infection. Après transfection, plus de 50% des cellules émettaient de la fluorescence, ce qui indiquait que ces cellules avaient intégré le plasmide pSIN.EGFP/PS1wt. Suite à l’infection des cellules avec ce milieu d’infection, la fluorescence était quasi inexistante. Ainsi, l’infection serait l’étape limitante. Par contre, il faut prendre en considération que ces essais avec EGFP ont été seulement effectués avec la méthode par électroporation et que nous n’avions aucun moyen de vérifier si la cellule a intégré les deux autres vecteurs (PMDG et PCMVΔR8,9) qui sont nécessaires à la formation des virions permettant l’infection des cellules.

Nous avons envisagé que l’étape de l’infection des cellules pourrait être limitante à cause de la quantité trop faible de virions disponibles pour l’infection. Donc, dans le but de maximiser l’infection des cellules HEK293T, nous avons concentré les virions en effectuant une série d’ultracentrifugation. Ces essais ne donneront pas les résultats espérés. Lors de cette manipulation, nous ne pouvons pas apercevoir de culot car les virions sont des particules invisibles à l’œil nu, donc nous ne savons pas si les virions sont dans le fond du tube sous forme d’un culot ou bien encore en suspension dans le surnageant. En plus, malgré le fait que nous faisons attention lorsque nous enlevons le surnageant après centrifugation, il se pourrait bien que nous enlevions également une partie des virions.

Nous avons démontré que le système de Lentivirus peut être efficace en utilisant des cellules HEK293T. Par contre, malgré la multitude d’essais que nous avons effectué pour mettre au point le système de Lentivirus avec le plasmide contenant la portion ICN et E+C du gène Notch, nous n’avons pas obtenu les résultats escomptés. Nous voulions utiliser le système de Lentivirus pour pouvoir infecter des neurones primaires. Ces cellules infectées auraient surexprimé la portion E+C ou ICN du gène Notch, nous permettant de les utiliser pour construire une banque d’ADNc. Ainsi, pour nous permettre de réaliser notre objectif de construire une banque d’ADNc, nous avons choisi une autre alternative qui consiste à réaliser une lignée cellulaire stable dans les neuroblastomes de souris (Neuro2A).

Nous avons choisi d’utiliser les neuroblastomes de souris (Neuro2A), car ce sont des neurones transformés qui peuvent être facilement gardées en culture cellulaire. En plus, elles ont les caractéristiques associées aux neurones. Pour établir la lignée cellulaire stable, nous avons transfecté les cellules Neuro2A avec le plasmide pCDNA3/E+C qui exprime la portion E+C du gène Notch (figure 4). Ce plasmide a également la propriété de posséder un gène de résistance à la néomycine dont l’analogue est la généticine (G-418sulfate). Ainsi, nous avons la possibilité de sélectionner les cellules qui ont intégré le plasmide de celles qui ne l’ont pas en utilisant une quantité prédéterminée de G-418sulfate. Les Neuro2A possède une résistance naturelle à la drogue G-418 et c’est pour cela que nous devons déterminer la quantité idéale de drogue à utiliser pour garder les cellules en sélection.

Pour ce faire, nous avons mis dans chacun des puits (35mm), 100 000 cellules Neuro2A non-transfectées avec 2ml de milieu DMEM supplémenté contenant une quantité précise de G-418sulfate allant de 0mg/ml à 2,5mg/ml (tableau 9). Pendant une semaine, ces cellules ont été comparées avec les cellules servant de contrôle où aucune drogue n’a été ajoutée. Lorsque les cellules du contrôle ont atteint une confluence de 100%, nous avons pris en considération que la survie cellulaire est de 100%. Ensuite, nous avons déterminé la survie cellulaire des cellules dans les autres puits en déterminant le pourcentage de cellules adhérent au pétris comparativement au contrôle (tableau 15). Ces résultats nous démontrent qu’il n’y a aucune survie cellulaire lorsque les cellules sont en présence d’une quantité égale ou supérieure à 2mg/ml.

Nous avons créé notre lignée cellulaire stable en faisant un essai avec une quantité de 2mg/ml de la drogue G-418sulfate mais également avec une quantité de 3mg/ml. En utilisant ces concentrations, nous nous assurons que les cellules qui survivront possèderont notre plasmide d’intérêt et qu’il n’y aura pas la croissance d’une population cellulaire résistante à la drogue.

Avant qu’elles ne soient mises en présence de la drogue, les cellules Neuro2A doivent être transfectées avec le plasmide pcDNA3/E+C. Nous avons vérifié l’expression de notre protéine d’intérêt après transfection en effectuant un immunobuvardage et en sondant la membrane avec l’anticorps btan20 qui reconnaît la partie C-terminal du gène Notch. Les résultats obtenus nous permettent d’affirmer qu’il y a une forte expression de la protéine Notch E+C après transfection. En effet, une bande de forte intensité apparaît à 97kDa pour l’essai numéro 1 et 2 (figure 11a, puits 1,2). Des cellules Neuro2A non transfectées nous servent de contrôle négatif et dans ce cas-ci nous pouvons observer qu’il n’y a pas détection de l’expression de la protéine Notch endogène (figure 11A, puits 3).

En sachant que nos cellules expriment notre protéine d’intérêt, nous les avons cultivées en sélection avec 2mg/ml pour l’essai numéro 1 et 3mg/ml pour le deuxième essai. Lorsque les cellules étaient confluentes, les cellules étaient récoltées et séparées en deux parties. Avec la première partie nous remettions les cellules en sélection avec la même quantité de drogue utilisée au départ tandis que la deuxième partie des cellules était gardée pour effectuer un immunobuvardage et ainsi vérifier l’expression de notre protéine.

Au premier passage des cellules en sélection, les résultats de l’immunobuvardage démontrent clairement une diminution importante de l’expression de ma protéine (figure 11A, puits 4 et 5). Il n’y a pas de différences majeures entre les résultats obtenus des cellules mises en sélection avec 2mg/ml de G-418sulfate (1) de celles en présence de 3mg/ml de G-418sulfate (2). Suite au deuxième et troisième passage des cellules (figure 11A, puits 6 à 9), nous ne remarquons plus aucune expression de la portion E+C de la protéine Notch. Pour les deux essais effectués, il y a perte d’expression.

Nous nous sommes assurés qu’il y avait une quantité égale de protéine dans chacun des puits en sondant de nouveau la membrane avec l’anticorps Ab14 qui reconnaît la partie N-terminal de la préséniline1 endogène. Ainsi, nous avons montré que la quantité de protéines est équivalente dans chacun des puits par l’apparition d’une bande à 33kDa (figure 11B).

Figure 11 Vérification de l’expression de la portion E+C de Notch par immunobuvardage après transfection et lors de la sélection des cellules Neuro2A avec la drogue G-418sulfate. (A) Expression de la protéine Notch pour l’essai 1 et 2 (puits 1et 2) après transfection montrant une bande à 97kDa. (3) Des cellules Neuro2A non transfectées. Pour les puits 4 à 9, l’expression de la protéine Notch après 3 passages subséquents des cellules Neuro2A en sélection avec 2mg/ml de G-418sulfate (1) ou 3mg/ml de G-418sulfate (2). (B) La même membrane sondée avec Ab14 qui reconnaît la partie N-terminal de la préséniline1 en donnant une bande de 33kDa.

Nous avons également vérifié si nos cellules contenaient encore le plasmide pcDNA3/E+C par RT-PCR, mais nous n’avons pas obtenu de résultats concluants. Étant donné que nous utilisons une quantité élevée de G-418sulfate, la possibilité que les cellules développent une résistance naturelle à la drogue est très peu probable. Cependant, c’est un aspect à prendre en considération, car nous n’avons pu démontrer la présence du plasmide dans nos cellules Neuro2A en sélection. Par contre, l’hypothèse la plus probable est que la cellule développe un mécanisme de dégradation de notre protéine. En effet, nous savons qu’une très faible quantité de NICD est nécessaire pour permettre l’activation des gènes cibles au noyau (Schroeter, Kisslinger et al. 1998). En plus, nous ne pouvons observer Notch endogène en immunobuvadarge lorsque sondé avec un anticorps qui reconnaît la partie C-terminal. Donc, il est possible que l’expression de Notch soit régulée de façon stricte évitant ainsi une accumulation plus élevée que le niveau endogène.

Nous voulions établir une lignée cellulaire stable dont les cellules surexprimeraient la portion E+C de notre protéine d’intérêt, dans le but d’utiliser ces cellules pour construire une banque d’ADNc. Par contre, la perte d’expression de notre protéine nous amène à envisager une façon différente de construire notre banque d’ADNc. En effet, nous allons procéder par des transfections transitoires dans les cellules Neuro2A et HEK293T.

Nous avons effectué une banque d’ADNc à partir de cellules Neuro2A et HEK293T qui surexpriment la portion E+C du gène Notch lors de transfections transitoires. Pour ce faire, nous avons effectué 4 transfections indépendantes avec chaque type cellulaire en utilisant le plasmide pcDNA3/E+C et la méthode de la lipofectamine. Après transfection, le tiers des cellules Neuro2A ou HEK293T est gardé pour vérifier l’expression de notre protéine par immunobuvardage (figure 12) en sondant les membranes avec l’anticorps btan20 qui reconnaît la partie C-terminal de la protéine Notch. Un contrôle positif (figure12, C) a été utilisé pour nous permettre de s’assurer que la migration du gel et le transfert des protéines ont été efficaces. Ce contrôle consiste à prendre 20μl d’un lysat cellulaire qui nous a déjà donné les résultats voulus lorsque la membrane avait été sondée avec l’anticorps btan20 lors d’un immunobuvardage. Incluant les contrôles, nous avons obtenu la bande attendue de 97kDa de forte intensité dans chacun des puits. En sachant que l’expression de la protéine Notch endogène n’est pas détectable en immunobuvardage (démontré à la figure 11, puits 3), ceci nous indique qu’il y a surexpression de notre protéine d’intérêt après transfection pour les cellules Neuro2A (figure 12A) et pour les cellules HEK293T (figure 12B). En comparant l’expression de la protéine Notch chez les deux types cellulaires (figure 12 A et B) nous observons que la protéine est exprimée plus fortement dans les cellules HEK293T que dans les cellules Neuro2A. Nous pouvons expliquer ces résultats simplement par le fait que l’efficacité de la transfection est supérieure lorsque nous utilisons des cellules HEK293T.

Le tiers des cellules a été utilisé pour vérifier l’expression de notre protéine, tandis que nous nous sommes servis du deux tiers des cellules pour extraire l’ARN total dans le but d’établir la librairie d’ADNc. Pour chaque type cellulaire, nous avons combiné les culots d’ARN total obtenus des quatre transfections effectuées. Pour effectuer le protocole permettant la synthèse des fragments d’ADNc, nous avons extrait l’ARNm de l’ARNtotal pour ensuite procéder à la synthèse d’ADNc telle que décrite à la figure 6. Deux essais ont été effectués en combinant l’ARNm des cellules Neuro2A avec l’ARNm des cellules HEK293T.

Figure 12 Vérification de l’expression de la portion E+C de Notch par immunobuvardage après transfection du plasmide pcDNA3/E+C dans des cellules Neuro2A et des cellules HEK293T. (A) Les 4 transfections indépendantes (1 à 4) dans les Neuro2A donc le C représente un contrôle positif. (B) Les 4 transfections indépendantes (1 à 4) dans les cellules HEK293T donc le C représente un contrôle positif.

La synthèse des fragments d’ADNc se fait en plusieurs étapes dont certaines peuvent être contrôlées en utilisant la radioactivité. En utilisant le P32dCTP, nous avons pu démontrer par un autoradiogramme que la synthèse du 1er brin d’ADNc à partir de l’ARNm a été effectuée car nous pouvons voir une traînée sur le film (figure 13, puits 2). À cette étape, nous n’avons obtenu aucun résultat pour l’essai 1, ce qui résulte d’une erreur de manipulations étant donné que nous obtenons les résultats escomptés lors de la suite de l’expérience (figure 13, puits 3 et 5). Avant d’effectuer la synthèse du deuxième brin d’ADNc par une réaction PCR, nous avons prélevé 5μl du mélange de chacun des essais et ajouté du P32dCTP. Ces tubes serviront de contrôles pour noter la différence avant et après la synthèse du deuxième brin d’ADNc. Les résultats obtenus indiquent que la synthèse du deuxième brin a été effectuée car nous observons une augmentation de l’intensité et de la hauteur des bandes si nous comparons avec les contrôles (figure 13, puits 5 et 6).

La suite du protocole nous permet d’obtenir des fragments d’ADNc de différentes longueurs et unidirectionnels. En effet, les fragments contiennent une extrémité EcoR1 et une extrémité Xho1, ce qui amène un avantage primordial lors de la ligation de ces fragments dans le vecteur pGADT7 préalablement digéré par EcoR1 et Xho1. Ainsi, les fragments peuvent seulement se lier dans une direction précise qui corrèle avec leur cadre de lecture.

Plusieurs essais de ligations ont été effectués. Pour le contrôle négatif, nous mettons le vecteur seul avec les composantes permettant la ligation. Nous pouvons ainsi vérifier si le vecteur peut se lier même en l’absence de fragments. Ainsi, nous avons isolé chacun des clones obtenus en effectuant des transformations bactériennes par électroporation avec les produits de ligation. Pour que nous puissions être en mesure de vérifier l’efficacité de la transformation, nous utilisons le vecteur puc19 comme contrôle. L’efficacité des transformations bactériennes par électroporation est très élevée allant de 1x108 à 1x109 colonies lorsque nous utilisons des cellules électrocompétentes DH10B commerciales. Toutes les ligations effectuées ont été vérifiées par transformation par électroporation. Malgré le fait que nos transformations étaient très efficaces lorsque vérifié avec le contrôle positif puc19, il en était tout autre pour les produits de ligations des ADNc clonés dans le vecteur pGADT7. Idéalement nous aurions dû obtenir une efficacité d’environ 1x109 mais nous étions très en dessous ce chiffre (seulement quelques colonies sur les pétris avec ampicilline).

Figure 13 Autoradiogramme des 2 essais représentant les étapes de la synthèse des fragments d’ADNc. Dans chacun des tubes, une concentration de 800Ci/mmol de P32dCTP a été utilisée. (1, 2) Synthèse du premier brin d’ADNc à partir de l’ARNm. (3, 4) Contrôles avant la deuxième synthèse des fragments d’ADNc. (5, 6) Synthèse du deuxième brin d’ADNc.

Nous pouvons expliquer ces résultats par le fait que nos ligations n’ont pas fonctionné mais également par certains problèmes rencontrés lors du protocole de la transformation. En effet, dans plusieurs des cas, après la pulsion, il y avait explosion de mon mélange de cellules compétentes et de milieu de ligation, ce qui ne favorise aucunement la transformation. Le milieu de ligation contient des sels, alors nous soupçonnons que c’est probablement la cause majeure causant l’explosion. En plus, après avoir étalé sur des pétris sélectifs, il y avait la présence de colonies satellites qui envahissaient nos colonies d’intérêt.

Pour régler le problème des ligations, nous avons fait des tests en faisant différentes dilutions du milieu de ligation avant d’effectuer la transformation. Pour enrayer le problème des colonies satellites, nous avons augmenté la quantité d’antibiotique de chacun des pétris de 75μg/ml à 100μg/ml, mais cela n’a pas donné les résultats escomptés, il y avait toujours la présence des ces colonies indésirables.

Étant donné que nous avions des problèmes techniques avec la transformation par électroporation, nous avons décidé d’utiliser l’autre méthode de transformation bactérienne, soit par choc thermique malgré l’efficacité plus faible de 1x105 à 1x106 colonies. Nos résultats n’ont pas été ceux que nous aurions espérés et donc nous en sommes venus à la conclusion que ce n’est pas les méthodes de transformations bactériennes employées qui causent le problème majeur rencontré mais bien les ligations.

Notre principale hypothèse repose sur une étape particulière lors de la synthèse des fragments d’ADNc, soit la ligation des adaptateurs EcoR1 aux fragments. Cette étape n’est pas contrôlée avec la radioactivité et elle peut s’avérer limitante dans la mesure où la ligation des adaptateurs nécessite des fragments avec des extrémités aux bouts francs. Si par mégarde un adaptateur ne peut se lier de façon adéquate, notre fragment ne possède plus une extrémité EcoR1 et Xho1 et la ligation dans le vecteur pGADT7 aux extrémités EcoR1 et Xho1 est impossible. Cette hypothèse expliquerait la faible efficacité lors des transformations bactériennes.

Suite aux divers problèmes rencontrés pour la création de notre banque d’ADNc, nous avons décidé de cribler directement une librairie commerciale d’ADNc de cerveau humain embryonnaire. Les sondes utilisées étaient la partie N-terminal de la préséniline1 (1 à 132a.a) et le domaine intracellulaire d’APP.

Nous avons utilisé le système de double hybride de la levure pour cribler la librairie d’ADNc de cerveau embryonnaire humain prétransformée dans les levures Y187. Nos plasmides d’intérêt pGBKT7/PS1(1-132) et pGBKT7/AICD, ils ont été transformés dans les levures AH109. Les levures AH109 et Y187 haploïdes sont sexuellement différentes ce qui nous permet d’effectuer un «mating». Le «mating» mène à l’obtention de levures diploïdes contenant le total des plasmides contenus dans chaque type de levure utilisé pour réaliser le «mating».

Avant d’effectuer le «mating», nous nous sommes assurés que les souches de levures AH109 et Y187 avaient le phénotype approprié (tableau 16). Pour ce faire, nous avons étalé ces levures sur différents milieux sélectifs et vérifier leur croissance.

- (aucune croissance), + (croissance)

Le phénotype de la souche Y187 était adéquat comparativement à la souche AH109 qui poussait sur le milieu sélectif SD/-His, ceci étant causé par une fuite transcriptionnelle du gène histidine. Pour contrer ce problème, nous avons ajouté au milieu une concentration de 2mM d’un inhibiteur compétitif pour la protéine HIS3 de la levure, le 3-AT (3-amino-1, 2, 4-triazole, Sigma). Alors, les deux souches de levures étant adéquates, nous avons procédé à la vérification de la toxicité et de l’autoactivation de la réponse GAL-4 de nos protéines d’intérêt, AICD et PS1(1-132).

En ce qui concerne le plasmide pGBKT7/PS1(1-132), nous savions que l’expression du gène de la préséniline1 n’est pas toxique pour la levure et qu’il n’y a pas d’autoactivation de la réponse GAL-4. Par contre, pour le plasmide pGBKT7/AICD nous avons du vérifier ces deux paramètres. Étant donné que les levures transformées avec le vecteur pGBKT7/AICD poussent normalement sur un milieu sélectif SD/-T, nous sommes arrivés à la conclusion que l’expression du domaine intracellulaire d’APP n’est pas toxique pour la levure. Pour déterminer si notre plasmide pouvait causer une autoactivation de la réponse GAL-4, nous avons effectué une co-transformation dans la levure AH109. En effet, nous avons transformé la levure AH109 avec le plasmide pGBKT7/AICD mais également avec le vecteur pGADT7. Les levures co-transformées ont été vérifiées sur un pétris sélectif –TL mais également sur un pétris –TLHA. Nous avons obtenu une multitude de colonies sur le pétris –TL, ce qui nous indiquait que les levures AH109 contiennent les deux plasmides, que notre co-transformation a été efficace. Par contre, aucune colonie était présente sur le pétris –TLHA, ceci indiquant que notre plasmide pGBKT7/AICD ne cause pas l’autoactivation de la réponse GAL-4. Bref, il n’y a pas d’interactions entre AICD et le vecteur pGADT7, empêchant ainsi l’activation de la réponse de GAL-4.

En sachant que nos levures possèdent le bon phénotype, que nos protéines d’intérêt ne sont pas toxiques pour la levure et qu’il n’y a pas d’autoactivation de la réponse GAL-4, nous avons pu effectuer les contrôles du «mating». Le but premier de ces contrôles est de nous assurer que nous obtiendrons une efficacité adéquate lors du «mating» avec la librairie prétransformée de cerveau embryonnaire humain. Les résultats obtenus (tableau 17) nous ont permis de calculer l’efficacité du «mating» pour chaque contrôle.

Pour le vecteur pGBKT7/AICD, nous avons obtenu une efficacité de 7% comparativement à 6% pour le vecteur pGBKT7/PS1(1-132). En ce qui concerne pGBKT7/p53 et pGADT7, l’efficacité atteint 7,5%. D’après le protocole de Clontech, nous devions obtenir une efficacité de plus de 2% pour considérer le «mating» efficace. Dans ces cas-ci, les résultats que nous avons obtenus montrent une très bonne efficacité. Nous pouvons maintenant entreprendre l’étape du «mating» avec la librairie d’ADNc et notre plasmide pGBKT7/AICD ou pGBKT7/PS1(1-132).

En premier lieu, nous avons titré la librairie d’ADNc avant qu’elle ne soit utilisée pour chacun des «mating» et ainsi déterminer le nombre approximatif de colonies/ml contenu dans chaque tube. Nous avons obtenu 3,3x108cfu/ml pour la librairie d’ADNc qui a été utilisée pour le «mating» avec le plasmide pGBKT7/PS1(1-132) et 1,3x108cfu/ml en ce qui concerne la librairie qui a été utilisée pour effectuer le «mating» avec le plasmide pGBKT7/AICD. Il ne nous restait plus qu’à effectuer les «mating».

Nos résultats nous indiquent (tableau 18) que nous avons obtenu une efficacité de 6,40% pour le «mating» avec le plasmide pGBKT7/PS1(1-132) tandis qu’avec le plasmide pGBKT7/AICD nous avons obtenu 5,70%. En prenant en considération que nous obtenons des valeurs supérieures à 2%, nous pouvons considérer que les deux «mating» sont réussis. En plus, nous avons pu calculer le nombre approximatif de clones indépendants pour chacun des «mating», soit 5,1x106 clones indépendants pour le criblage avec pGBKT7/PS1(1-132) et 2,9x106 clones indépendants pour le criblage avec pGBKT7/AICD.

Le mélange obtenu après chacun des «mating» a été étalé sur des pétris sélectifs –TLHA. Pendant deux semaines nous avons identifié les colonies apparaissant sur chacun de ces pétris sélectifs. En ce qui concerne nos résultats (tableau 19), nous avons obtenu 14 colonies suite au criblage avec le plasmide pGBKT7/PS1(1-132) et 24 colonies lors du criblage avec pGBKT7/AICD. Nous avons suivi l’apparition des colonies.

Étant donné que les colonies ont poussé sur le milieu très stringeant –TLHA, nous considérons que pour chaque colonie obtenue, il y a une interaction entre notre protéine d’intérêt et un fragment d’ADNc de la librairie. Pour confirmer cette interaction, nous avons étalé chacune des colonies obtenues sur de nouveaux pétris sélectifs –TLHA dans le but d’effectuer un test β-Gal. La colonie AICD no.24 n’a pas poussé lorsque étalée de nouveau sur un pétris –TLHA, donc nous avons maintenant 23 colonies.

Ainsi, nous avons effectué le test β-Gal pour chacune des colonies et nos résultats (figure 14) se sont avérés positifs. En effet, toutes les colonies testées sont teintées en bleues. Pour qu’une colonie devienne bleue, il doit nécessairement avoir une interaction entre notre protéine d’intérêt et un fragment d’ADNc de la librairie. En effet, cette interaction est nécessaire à l’activation de la réponse de Gal-4 qui permet la transcription du gène rapporteur LacZ . Ce gène code pour la β-galactosidase qui dégrade le substrat chromogène X-Gal utilisé lors du test β-Gal ce qui donnera la couleur bleue caractéristique. Nous pouvons remarquer diverses variantes de bleu corrèlant avec le degré d’interaction du clone avec notre protéine d’intérêt. Nous considérons que le clone interagit fortement avec notre protéine d’intérêt lorsque la couleur se rapproche de celle obtenue pour le contrôle positif (figure 14, c). Les plasmides utilisés comme contrôle positif, pGBKT7/p53 et pGADT7/T, sont utilisés pour leur propriété d’interagir fortement ensemble. En effet p53 interagit fortement avec l’antigène T du SV40 (Simian virus 40). Nous pouvons voir une forte interaction du contrôle positif par le test β-Gal, mais également lorsque les deux plasmides sont dans la même levure et que celle-ci est étalée sur un pétris –TLHA (tableau 17).

Nous savons maintenant que pour chaque colonie il y a un clone qui interagit avec notre protéine d’intérêt, PS1(1-132) ou AICD. Les prochaines étapes consistent à isoler le clone qui permet cette interaction. En premier lieu, nous avons extrait les plasmides des levures présents dans chacune des colonies. Par la suite, nous avons utilisé les bactéries qui possèdent l’avantage, comparativement aux levures, de n’intégrer qu’un seul plasmide. À cette étape, nous avons décidé de ne pas investir avec le clone no.9 obtenu suite au criblage par le plasmide pGBKT7/AICD, car les cultures bactériennes obtenues étaient anormales. Sur la multitude de colonies obtenues sur nos pétris sélectifs après transformation bactérienne, nous avons décidé de vérifier l’ADN plasmidique de 4 colonies, c’est-à-dire de déterminer les profils de 4 clones qui proviennent de la même colonie isolée au départ après «mating».

Figure 14 Tests β-Gal effectué sur tous les clones obtenus sur pétris -TLHA après le criblage de la librairie d’ADNc de cerveau embryonnaire humain avec pGBKT7/AICD ou pGBKT7/PS1(1-132). (A) Tests β-Gal des clones 1 à 23 obtenus après criblage avec pGBKT7/AICD. (B) Tests β-Gal des clones 1 à 14 obtenus après criblage avec pGBKT7/PS1 (1-132). Le contrôle positif (c): le vecteur pGBKT7/p53 et pGADT7/T.

En sachant que les fragments d’ADNc de la librairie ont été clonés dans le vecteur pACT2 aux sites de restriction EcoR1 et Xho1, nous avons effectué une digestion enzymatique avec ces enzymes de restriction pour déterminer le profil de chacun des clones. En analysant les résultats obtenus sur gel d’agarose, nous avons conclu que pour chacune des colonies obtenues après «mating» il n’existe qu’un profil pour les 4 clones vérifiés. La seule exception est le clone no.9 obtenu suite au criblage avec pGBKT7/PS1(1-132), nous obtenons deux profils caractéristiques. Pour le profil des 23 clones obtenus suite au criblage de pGBKT7/AICD, nous obtenons pour chacun des clones (figure 15) une bande commune à 8100pb qui représente le vecteur pACT2 et des bandes de différentes hauteurs. Il est en de même pour le profil des 14 clones obtenus (figure 16) suite au criblage de pGBKT7/PS1(1-132) où nous retrouvons la bande commune à 8100pb et des bandes de différentes hauteurs.

Figure 15 Profils sur gel d’agarose des clones 1 à 23 suite au criblage avec pGBKT7/AICD. Chaque clone a été digéré avec EcoRI et XhoI. La bande à 8,1Kb représente le vecteur pACT2. (A) Profils des clones 1 à 12. (B) Profils des clones 13 à 23. Les flèches indiquent les clones qui ont été séquencés.

Figure 16 Profils sur gel d’agarose des clones 1 à 14 suite au criblage avec pGBKT7/PS1(1-132). Chaque clone a été digéré avec EcoRI et XhoI. La bande à 8,1Kb représente le vecteur pACT2. (A) Profils des clones 1 à 10. (B) Profils des clones 11 à 14. Les flèches indiquent les clones qui ont été séquencés.

Parmi les clones obtenus, nous avons décidé de séquencer certain d’entre eux (pointés par une flèche à la figure 15 et 16). Les clones qui n’ont pas été séquencés représentaient le même profil d’un clone qui a été séquencé. L’analyse sommaire des clones séquencés nous permet d’identifier des régions d’homologie entre nos clones et des gènes codant pour des protéines connues ou inconnues (tableau 20). L’analyse de la séquence du clone no.12 obtenu après le criblage avec pGBKT7/AICD, nous indique que ce clone est en fait la protéine FE-65. La protéine FE-65 est connu pour interagir avec AICD en lui permettant de transloquer au noyau (De Strooper and Annaert 2000) (Cao and Sudhof 2001). Ce résultat nous indique que le criblage a été efficace car nous avons recruté une protéine connue qui interagit avec AICD.

De tous les clones obtenus nous nous sommes particulièrement intéressés au clone no.15 dont la séquence est homologue à la séquence de la protéine KBP (KyoT Binding Protein) qui lie la protéine KyoT dans la voie de signalisation de Notch (Taniguchi, Furukawa et al. 1998). Ceci est très intéressant car nous pourrions être en mesure d’établir un lien entre la voie de signalisation de Notch et d’APP. Dès lors, nous voulons confirmer l’interaction entre le clone 15 et AICD en utilisant la méthode d’immunoprécipitation. Jusqu’à maintenant seulement 2 essais non concluants ont été effectués pour vérifier l’interaction du clone 15 avec AICD. En ce qui concerne les autres clones obtenus, il pourrait s’avérer très intéressant de poursuivre l’analyse et ainsi pouvoir émettre des hypothèses sur le rôle d’AICD au noyau ou d’élaborer sur le rôle de PS1 dans les diverses voies de signalisation.