2 Matériels et méthodes

Table des matières

La banque Griffin.1 a été construite par l’équipe du Dr Greg Winter en combinant les portions codant pour les régions variables des immunoglobulines humaines dont les gènes ont été clonées antérieurement par d’autres équipes. La variabilité des répertoires a été augmentée en insérant des codons aléatoires dans la séquence codant pour la région hypervariable 3 (CDR3: Complementary Determining Region). Tout d’abord, le répertoire de chaînes lourdes a été construit à partir des 49 segments VH clonés par (Tomlinson et al. 1992; Nissim et al. 1994) et 4 à 12 codons aléatoires ont été insérés à la place de la région hypervariable 3 (> 108 clones différents) (Fig 7A). Le répertoire de chaînes légères κ a été préparé à partir des 26 segments Vκ clonés par Cox et al. (1994) et le CDR 3 a été remplacé par 2 codons aléatoires ou moins (9 x 104 clones) (Fig 7B). Finalement, le répertoire de chaînes légères λ a été construit à partir des 21 segments Vλ clonés par Williams and Winter (1993) en introduisant une boucle CDR3 comprenant de 0 à 3 résidus aléatoires (7.4 x 105 clones) (Fig 7C).

Les différentes chaînes légères (kappa et lambda) ont été clonées par la suite dans le vecteur “accepteur” fdDOG2loxVκDel comprenant le gène de résistance à la tétracycline (Fig 7D). Le répertoire de chaînes lourdes a été cloné dans le vecteur “donneur” pUC19-2loxVHDel (Fig 7E) comprenant un gène de résistance à l’ampicilline. Les répertoires de chaînes lourdes (> 108) et légères (> 105) ont été combinés en infectant une souche d ’E. coli ayant le vecteur “donneur” (VH) avec des phages fd ayant le vecteur “accepteur” (VL). La culture a ensuite été coinfectée avec le phage P1 (résistance chloramphénicol) fournissant la recombinase Cre (recombinaison lox) (Waterhouse et al. 1993). Sur une possibilité de 8 x 1013 clones différents, 6.5 x 1010 colonies ont poussé sur un milieu comprenant les trois antibiotiques, certaines combinaisons n’ont donc pas eu lieu. Les répertoires VH -VL ont ensuite été clonés dans le phagemide pUC119HismycXba (Fig 7F). Avec cette banque, les auteurs ont obtenu des Fabs de haute affinité dirigés contre des haptènes, des antigènes étrangers mais aussi contre des protéines humaines (Griffiths et al. 1994). Pour la création de la banque Griffin.1, les portions VH -VL du répertoire de Fab ont été clonées dans le vecteur pHEN2 (Figure 8) pour la production de scFvs.

Figure 7 : Construction du répertoire de chaînes lourdes et légères et vecteurs utilisés pour leur clonage.

(A) Construction du répertoire de chaînes lourdes. (B) Construction du répertoire de chaînes kappa. (C) Construction du répertoire de chaînes lambda. (D) Vecteur “accepteur” du phage fd dans lequel les répertoires de chaînes légères ont été clonés. (E) Vecteur plasmidique “donneur” dans lequel a été cloné le répertoire de chaînes lourdes. (F) Phagemide dans lequel les répertoires de chaînes lourdes et légères codant pour des Fabs ont été insérés en fragments XbaI-NotI. (Tiré de (Griffiths et al. 1994).)

L’ADNc du gène FMR1 , amplifié par RT-PCR antérieurement au début de ce projet, a été cloné dans le vecteur pQE31. (Figure 9) Dans ce vecteur, le gène inséré est sous le contrôle du promoteur T5. En aval de ce dernier, on retrouve deux opérons lac où se lient les répresseurs qui inhibent la transcription de l’ARN diminuant ainsi les fuites. La production de la protéine s’induit en ajoutant de l’IPTG au milieu de culture. L’IPTG est un analogue du lactose qui se fixe irréversiblement aux répresseurs, permettant ainsi la liaison de l’ARN polymérase au promoteur T5 et la production de la protéine recombinante. Nous avons tranformé la souche XL1Blue avec le vecteur pQE31/FMR1 afin d’en produire une quantité suffisante pour le recloner dans la souche M15 d ’E.coli . (The Qiaexpressionnist kit de Qiagen) Nous avons aussi fait synthétiser un peptide de la portion carboxy-terminale (a.a. 550-570: DHSRTDNRPRNPREA) par le service de synthèse de l’Université Laval. Cette sequence peptidique a été sélectionnée car elle absente dans les homologues et présente une forte hydrophilicité.

Figure 9: Vecteur pQE31

Ce vecteur a été utilisé pour la production de peptides de fusion pour l’expression dans la souche E. coli M15. En amont du site de clonage multiple (MCS) on retrouve un tag hexa-histidine pour la purification des peptides, un site d’attachement des ribosomes, deux opérons lac et le promoteur T5. En aval on retrouve des codons stop dans les 3 cadres de lecture. Sur le plasmide est aussi présent un gène de résistance à l’ampicilline.

Dans la majorité des clonages que nous avons effectués nous avons utilisé une seule enzyme de restriction pour digérer le vecteur et le produit PCR. La produite PCR pouvait donc se lier au vecteur dans les deux orientations. Ainsi, une fois les cellules transformées, elles sont étalées sur une boîte de Pétri à une dilution permettant d’obtenir des colonies isolées, c’est–à-dire issues d’une seule bactérie théoriquement. En effectuant une PCR sur l’ADN de ces colonies, nous pouvions déterminer l’orientation de l’insert. Pour cela, nous avons utilisés une amorce dans le plasmide et une amorce dans le gène. Si l’insert n’est pas dans la bonne orientation, les amorces se retrouvent sur le même brin, et il n’y a pas d’amplification.

Nous avons piqué des colonies isolées et les avons diluées dans 50 μL d’eau ultrapure. Nous avons ensuite préparé un mélange pour une réaction PCR contenant 10 μL de colonies diluées, 1,25 μM de l’oligo PBF (sur le vecteur), 1,25 μM d’un oligo dans le gène FMR1 (par exemple Pst XIII, voir tableau 2 p. 78), 200 μM de dNTPs, la solution Q, le tampon PCR et 2 unités de Taq de Qiagen dans un volume final de 40 μL.

L’amplification PCR a été effectuée dans un thermocycleur MJ-research PTC-200 selon les conditions suivantes:

Les produits PCR ont ensuite été déposés sur un gel d’agarose 1 % et la migration effectuée à 100 Volts (10 V/cm) pendant 1 heure. Le gel est coloré au bromure d’éthidium (BrET) et les produits visualisés sur une plaque UV. En utilisant un oligo dans le vecteur et un autre à l’intérieur de l’insert, nous pouvions ainsi vérifier simultanément la présence, la taille et l’orientation de l’insert.

Une colonie isolée est utilisée pour inoculer une mini-culture de 10 mL de milieu de culture LB contenant de l’ampicilline (100 μg/mL) et de la kanamycine (25 μg/mL). La culture est incubée à 37 oC toute la nuit en agitant. La mini-culture (2.5 mL) est utilisée pour inoculer 50 ml de milieu LB (ampicilline et kanamycine) préchauffé à 37oC et la croissance s’effectue jusqu’à la phase de croissance exponentielle (D.O. entre 0.5 et 0.7). Nous avons prélevé 1 mL de la mini-culture pour analyse. Cet aliquot est centrifugé à 12 000 RPM pendant 5 minutes, le culot est repris dans 50 μL de tampon Laemmli 3X et chauffé à 100oC pendant 10 minutes. L’échantillon est conservé à -20oC jusqu’à son analyse par SDS-PAGE. (Contrôle non-induit)

La production de la protéine recombinante est induite en ajoutant de l’IPTG à une concentration finale de 1 mM à la culture. Un millilitre est prélevé à chaque 60 minutes afin de mesurer l’expression de la protéine en fonction du temps (cinétique d’expression). Les échantillons recueillis sont traités tel que décrit précédemment pour le contrôle non-induit.

Après 6 heures d’induction, les cellules sont récupérées par centrifugationn et nous avons vérifié la solubilité de la protéine. Trois échantillons de 1 ml ont été recueillis dans des tubes coniques 1.7 mL et centrifugés à 12 000 RPM pendant 5 minutes. Les culots sont repris dans trois différents tampons de lyse: un tampon permettant de conserver les protéines dans leur état natif et deux tampons dénaturants.

Les échantillons sont centrifugés pendant 5 minutes à 12 000 RPM. Les surnageants sont conservés et les culots repris dans 50 μL de tampon Laemmli 3X pour l’analyse. Le tampon Laemmli 3X est ajouté au surnageant pour avoir une concentration finale de 1X et les échantillons sont conservés à –20oC jusqu’à leur analyse sur gel d’acrylamide dénaturant (SDS-PAGE).

(Les mêmes concentrations ont été utilisées pour les gels préparatifs.)

L’électrophorèse sur gel d’acrylamide permet de séparer des protéines selon leur poids moléculaire. La matrice est crée par la polymérisation d’acrylamide et de bis-acrylamide. La grosseur des pores formés est fonction de la concentration d’acrylamide. Plus la concentration est élevée, plus les pores seront petits et les molécules les mieux séparées seront celles de petits poids moléculaires. Dans un gel dénaturant, on retrouve du SDS qui se lie aux protéines selon un ratio constant (1 molécule de SDS par 2 acides aminés). En se liant à la protéine, le SDS empêche son repliement et lui confère une charge nette négative. Ceci permet sa migration dans la matrice à l’aide d’un courant électrique et la séparation des protéines s’effectue uniquement en fonction de leurs poids moléculaires.

Gel d’entassement:

126 mM mM Tris pH 6.9, 8% Acrylamide 38:2, 0.1 % SDS, APS et TEMED

Gel de séparation:

375 mM Tris pH 8.8, 8% Acrylamide 38:2, 0.1 % SDS, APS et TEMED.

La migration du gel est effectuée à 90 Volts pendant 1h45 dans le tampon tris-glycine-SDS. Le gel d’entassement sert, comme son nom l’indique, à regrouper les protéines ensembles. Durant l’électrophorèse, dans le gel à pH 6.9, les ions de chlores migrent plus rapidement que les protéines et la glycine, et cette dernière se déplace plus lentement que les protéines. La migration rapide des ions crée un gradient de faible voltage en avant des protéines alors que la lente migration de la glycine crée un gradient de haut voltage à l’arrière des protéines. Ceci a pour effet d’entasser les protéines entre les glycines et les ions de chlores avant leur séparation dans le gel à pH 8.8.

Lorsque les protéines ont été séparées, leur visualisation peut être effectuée en les colorant directement (Bleu de Coomassie ou nitrate d’argent). Cette coloration permet de visualiser toutes les protéines dans l’échantillon dont la concentration dépasse la limite de détection de la coloration. Cependant, il est possible de détecter spécifiquement certaines protéines par la technique de l’immunobuvardage.

Cette technique consiste à transférer les protéines séparées par électrophorèse sur un support solide tel la nitrocellulose à l’aide d’un courant électrique. On utilise ensuite un anticorps qui reconnaît spécifiquement la protéine à étudier et à l’aide d’un substrat chromogénique ou chemiluminescent, la position et la quantité de la protéine sont déterminées.

Après le transfert, le blocage des sites de liaison restant de la membrane de nitrocellulose s’effectue dans le Blotto 5 % (5 grammes de lait en poudre dans 100 ml de PBS) contenant 0.1 % Tween-20 pendant 1 heure en remuant à température de la pièce.

L’anticorps primaire (surnageant d’hybridome ou anticorps purifiés dilués avec Blotto 5 %) est ajouté et incubé pendant 1 heure en remuant à température ambiante. Les anticorps qui ne se sont pas fixés spécifiquement sont éliminés par 2 lavages consécutifs de 15 minutes avec du PBS/Tween-20 0.1 %.

L’anticorps secondaire GAM-HRP (Goat Anti-Mouse couplé à la Peroxydase de raifort de Jackson Laboratories), dilué 1:10 000 dans le Blotto 5%/Tween-20 0.1%, est incubé pendant 1 heure en remuant à température ambiante. Les anticorps qui ne se sont pas fixés sont éliminés par 3 lavages consécutifs de 15 minutes avec du PBS/Tween-20 0.1 %.

La révélation est effectuée en recouvrant la membrane avec le substrat chemiluminescent ECL (Enhance ChemiLuminescence) pendant 1 minute puis en exposant la membrane sur film Biomax MR (temps variables selon l’intensité du signal).

Tel que mentionné précédemment, la production de la protéine recombinante s’induit par l’ajout d’IPTG. Lorsque le maximum de production est atteint, les cellules sont récoltées par centrifugation puis lysées, dans un tampon où la protéine recombinante est soluble, afin de la purifier avec la matrice Ni-NTA de Qiagen. L’acide nitriloacétique (NTA) est un agent chélatant les ions nickel (dans ce cas) laissant deux protons libres sur l’ion. Le tampon de lyse étant à pH 8.7, les histidines sont déprotonnées, donc chargées négativement (au niveau de l’azote de l’imidazole: pKa à 6.5). Ainsi, un atome de nickel chélaté par la NTA peut former des liens avec 2 histidines adjacentes.

Des cultures de 200 mL ont servi à la production de la protéine FRM1 recombinantes. Quatre heures après l’induction à l’IPTG, les cellules ont été récupérées par centrifugation à 4000 g pendant 20 minutes. Le culot a été repris dans un volume de 20 mL de tampon de lyse “natif”. Trois cycles de gel dans une solution de glace sèche et de méthanol puis de dégel dans l’eau froide ont permis de compléter la lyse.

Le lysat est ensuite centrifugé à 4000 g pendant 20 minutes afin de récupérer la fraction insoluble contenant la protéine FMR1. Cette étape permet d’éliminer une bonne quantité de protéines bactériennes s’attachant à la résine Ni-NTA de façon non-spécifique. Le culot est repris dans le tampon dénaturant “urée” et une fois bien solubilisé, le tout est re-centrifugé à 4000 g afin d’éliminer les débris cellulaires insolubles.

L’étape de purification débute par l’ajout de la matrice Ni-NTA-agarose au surnageant dans un ratio 1:30 (format “batch”). Le tout est agité lentement toute la nuit à la température ambiante. Le lendemain, le mélange est centrifugé à 800 g, le surnageant est éliminé et les billes Ni-NTA reprises dans 2 mL de tampon d’élution (PBS/500 mM imidazole). L’imidazole entre en compétition avec l’histidine pour la liaison aux atomes de nickel et les protéines recombinantes sont éluées.

Après une heure d’agitation, le surnageant est récupéré à la suite d’une centrifugation à 4000 g pendant 20 minutes et un aliquot du surnageant est déposé sur gel d’acrylamide afin de vérifier la présence de la protéine FMR1.

Le reste du surnageant contenant la protéine FMR1 est déposé sur un gel d’acrylamide préparatif pour sa purification. La migration dans le gel d’entassement est effectuée à 20 mA pendant 90 minutes et celle dans le gel de séparation à 40 mA pendant 3h30-4h00.

À la suite de la migration, le gel est coloré dans une solution de sulfate de cuivre 0.3 M pendant 5 minutes puis déposé sur une vitre (afin de visualiser la bande car c’est une coloration négative) et la bande correspondant à FMR1 est excisée. Le sulfate de cuivre est éliminé de la bande avec 3 lavages successifs de 15 minutes dans une solution 0.25 M EDTA/0.25 M Tris, l’EDTA servant d’agent chélatant les ions de cuivre. Une fois la bande lavée, elle est découpée en petit fragments qui seront insérés dans les carottes servant à l’électroélution. (Figure 10) Dans le tampon d’électroélution, on retrouve du SDS qui jouera le même rôle que dans les gels de polyacrylamide.

L’électroélution s’effectue dans un montage permettant au courant de passer à travers des morceaux de gel contenant la protéine à purifier. Le gel est retenu par une grille au bas de la carotte et les protéines sont entraînées par le courant électrique jusqu’à une membrane empêchant les molécules de plus de 5 kDa de passer.

À la fin de l’électroélution, la majorité des protéines éluées se retrouvent dans le bouchon où la membrane se situe. Les différentes fractions de la carotte sont récupérées et analysées par SDS-PAGE.

Figure 10: Montage pour l’électroélution de protéines à la suite d’une électrophorèse sur gel d’acrylamide préparatif.

En passant du compartiement supérieur à celui du bas, le courant électrique entraine les protéines (chargées négativement) hors des morceaux d’acrylamide jusqu’à ce qu’elles soient arrêtées par une membrane poreuse qui laisse passer les molécules de poids moléculaire inférieur à 5000 Da. Le triangle représente le gradient de concentration en protéine qui se crée pendant l’électroélution.

Les manipulations décrites ci-dessous sont celles que nous avons effectuées avec la banque Griffin.1. Elles sont tirées du protocole complet disponible sur le site internet .

1- La banque Griffin.1 est un stock bactérien d’environ 1010 clones différents. La première étape consiste à l’utiliser pour inoculer 500 mL de milieu 2XTY contenant de l’ampicilline (100 μg/mL) et 1 % de glucose.

2- Laisser croître à 37oC en brassant jusqu’à l’obtention d’une densité optique (D.O.) de 0.5 (90 à 120 minutes). (Les D.O. sont toujours prises à 600 nm.)

3- Infecter 25 mL (1010 clones) de cette culture avec le phage auxiliaire M13K07 (Pharmacia) dans un ratio 1:20 (cellules bactériennes:phages) selon la règle de 1 unité D.O. = 8X108 bactéries/mL. Le reste des 475 mL de culture servira à faire les stocks de banques secondaires.

4- Incuber les bactéries et les phages à 37oC sans agiter afin de permettre l’infection.

5- Centrifuger les bactéries infectées à 3300g pendant 10 minutes. Resuspendre le culot doucement dans 30 mL de milieu 2XTY contenant de l’ampicilline (100 μg/mL) et de la kanamycine (25 μg/mL). (Les quantités d’antibiotique sont identiques dans tous les protocoles.)

6- Ajouter 470 mL de milieu 2XTY (amp + kan) préchauffé et incuber à 30oC toute la nuit avec agitation à 300 RPM.

7- Le lendemain, centrifuger la culture à 10 800 g pendant 10 minutes et récupérer le surnageant.

8- Ajouter 1/5 volume de PEG/NaCl (20 % Polyéthylène glycol, 2.5 M NaCl) au surnageant. Bien mélanger et laisser une heure ou plus à 4oC.

9- Centrifuger à 10 800 g pendant 30 minutes, resuspendre le culot dans 40 mL d’eau et ajouter 8 mL de PEG/NaCl. Mélanger et conserver à 4oC pendant au moins 20 minutes.

10-Centrifuger à 10 800 g pendant 10 minutes et aspirer le surnageant.

11-Recentrifuger brièvement et aspirer les restes de PEG/NaCl.

12-Resuspendre le culot dans 5 mL de PBS et centrifuger à 11 600 g pendant 10 minutes dans une micro-centrifugeuse pour éliminer les débris cellulaires restant.

13-Conserver le surnageant de phages à 4oC à court terme ou ajouter 15 % de glycérol au PBS pour la conservation à long terme.

14-Pour titrer le stock de phages, diluer 1 μL dans 1 mL de PBS et prendre 1 μL pour infecter 1 mL d’une culture de la souche TG1 (non-suppressive) à une D.O. de 0.4-0.6. Étaler 50 μL de cette culture ainsi que 50 μL des dilutions 1/100 et 1/10 000 sur des boîte de Pétri contenant du milieu TYE-agar, de l’ampicilline et 1 % glucose et incuber toute la nuit à 37oC.

Nous avons choisi d’effectuer nos sélections dans des immunotubes™ (Nunc), des tubes en polypropylène sur lesquels peuvent être accrochés des antigènes à l’aide de liens non-covalents.

1- Fixer l’antigène à l’immunotube en remplissant ce dernier de tampon carbonate à pH 9.6 contenant l’antigène (50 μg de protéines FMR1 recombinante/mL) et en le laissant à température ambiante toute la nuit.

2- Le jour suivant, rincer le tube 3 fois avec du PBS.

3- Remplir le tube jusqu’au bord avec du Blotto 2 %. Couvrir et incuber à 37oC pour 2 heures afin de bloquer les sites de liaison restés disponibles.

4- Laver le tube 3 fois avec du PBS.

5- Additionner 4 mL de Blotto 2 % contenant 1013 phages (100 μL ) obtenus à l’étape 13 de la section 2.3.1. Incuber 30 minutes à la température de la pièce, en rotation continue, et ensuite laisser reposer pendant 90 minutes. Jeter les phages qui ne se sont pas liés.

6- Pour le premier tour de sélection, laver le tube 10 fois avec du PBS-Tween-20 0.1 % puis 10 fois avec du PBS pour éliminer le détergent. Pour les autres tours de sélections, 20 lavages avec puis sans détergent seront effectués.

7- Éliminer l’excès de PBS du tube et éluer les phages en ajoutant 1 mL d’une solution de triéthylamine 100 mM et mettre en rotation continue pendant 10 minutes.

8- Lors du décrochage des phages, préparer un tube contenant 0.5 mL de Tris 1 M pH 7.4 afin de neutraliser la solution contenant les phages de l’étape précédente. Les phages peuvent être conservés à 4 oC ou utlisés pour l’infection à la sélection suivante.

9- Après l’élution, ajouter un autre 200 μL de Tris 1M dans l’immunotube pour neutraliser le triéthylamine contenant les phages restants.

10-Prendre 9.25 mL d’une culture TG1 en phase exponentielle et ajouter 0.75 mL de phages élués. Ajouter un autre 4 ml de la même culture dans l’immunotube et incuber à 37 oC pendant 30 minutes sans brasser.

11- Rassembler le 10 mL et le 4 mL de bactéries TG1 infectées et prendre 100 μL pour effectuer 5 dilutions 1/100 en séries. Étaler ces dilutions sur des Pétris TYE contenant de l’ampicilline et 1 % de glucose.

12-Prendre le reste de la culture TG1 infectée et la centrifuger à 3300g pendant 10 minutes. Resuspendre le culot de bactéries dans 1 mL de milieu 2XTY et étaler sur un pétri Nunc Bio-Assay (30 cm X 30 cm) de TYE contenant ampicilline et 1 % glucose.

13-Laisser le tout croître à 30 oC toute la nuit.

1- Ajouter 5 mL de milieu 2XTY (ampicilline-1 % glucose) sur le Pétris Bio-Assay et ramasser les bactéries stérilement à l’aide d’un râteau de verre. Utiliser 50-100 μL de bactéries pour inoculer 100 mL de milieu 2XTY (ampicilline-1 % glucose). Ranger le reste des bactéries à -80 oC. S’assurer que la D.O. des 100 mL de culture est inférieure à 0.1.

2- Laisser croître les bactéries jusqu’à l’obtention d’une D.O. de 0.5.

3- Infecter 10 mL de cette culture avec M13K07 en utilisant le même ratio que mentionné précédemment.

4- Incuber à 37 oC pendant 30 minutes sans agiter (bain).

5- Centrifuger les bactéries infectées à 3300 g pendant 10 minutes. Resuspendre doucement le culot dans 50 mL de milieu 2XTY (ampicilline et kanamycine) et incuber toute la nuit à 30 oC sous agitation.

6- Prendre 40 mL de cette culture et la centrifuger à 10 800 g pendant 10 minutes.

7- Ajouter 1/5 volume (8 mL) de PEG/NaCl au surnageant, bien mélanger et laisser au moins 1 heure à 4 oC.

8- Centrifuger à 10 800 g pendant 10 minutes et aspirer le surnageant.

9- Recentrifuger brièvement et aspirer les restes de PEG/NaCl.

10- Resuspendre le culot dans 2 mL de PBS et centrifuger à 11 600 g dans une micro-centrifugeuse pour éliminer les débris cellulaires restants.

11- 1 mL de ces phages peut être conservé à 4 oC et l’autre millilitre peut être utilisé pour le tour de sélection suivant.

12- Répéter 2 à 3 autres sélections. (sections 2.3.2 et 2.3.3)

1- Prendre 10 μL de phages élués à chaque sélection (environ 105 phages) et infecter 200 μL d’une culture de la souche HB2151 (non-supressive) en phase de croissance exponentielle (D.O. 0.5-0.7) à 37 oC pendant 30 minutes sans brasser. Étaler 1, 10 et 100 μL et une dilution 1:10 sur des boîtes de Pétri contenant ampicilline et 1 % glucose. Incuber à 37 oC toute la nuit.

2- Inoculer une plaque de 96 puits contenant 100 μL de milieu 2XTY (ampicilline-1 % glucose) à partir de colonies isolées et faire croître toute la nuit à 37 oC sous agitation.

3- Transférer un inoculum (2 μL) à chaque puits d’une seconde plaque de 96 puits contenant 200 μL de milieu 2XTY frais (ampicilline/glucose 0.1 %). Croître à 37 oC jusqu’à une D.O. de 0.9.

4- Une fois cette densité optique atteinte, ajouter 25 μL de milieu 2XTY contenant de l’ampicilline et 9 mM d’IPTG (final 1 mM). Continuer à agiter en incubant à 30 oC pendant 16 à 24 heures.

5- Pendant cette incubation, tapisser une plaque ELISA 96 puits avec 100 μL d’une solution d’antigène (50 μg/mL) toute la nuit à température ambiante dans un tampon carbonate pH 9.6.

6- Le jour suivant, rincer la plaque ELISA 3 fois avec du PBS et bloquer la plaque avec une solution PBS-BSA 3 % pendant 2 heures à 37 oC.

7- Centrifuger les plaques contenant les cultures bactériennes à 1800 g pendant 10 minutes, prendre 100 μL du surnageant (contenant les scFvs), l’ajouter à la plaque ELISA et laisser incuber à température ambiante pendant 1 heure.

8- Éliminer le surnageant de la plaque ELISA et laver 3 fois avec du PBS.

9- Ajouter 50 μL d’anticorps 9E10 à une concentration de 4 μg/mL dans une solution de PBS-BSA 1 %. Incuber 60 minutes à température de la pièce et laver 3 fois avec une solution de PBS-Tween-20 0.05 % puis 3 fois avec du PBS seul.

10-Développer avec le substrat TMB (100 mg TMB/mL dans une solution d’acétate de sodium pH 6.0. Ajouter 10 μL de peroxyde d’hydrogène 30 % par 50 mL de solution TMB juste avant son utilisation.

11-Ajouter 100 μL de substrat à tous les puits et attendre 10 minutes. Une coloration bleue va se développer.

12-Arrêter la réaction par l’ajout de 50 μL d’acide sulfurique 1M.

13-Lire la D.O. à 650 nm et à 450 nm. Soustraire la D.O. à 650 nm de celle à 450 nm.

Le dot-blot consiste à déposer des protéines sur une membrane de nitrocellulose sous forme de points puis à effectuer les étapes d’un immunobuvardage classique. Dans notre cas, nous avons utilisé le système de Life Technologies (The convertible® filtration manifold system) qui permet de transférer les protéines sur la membrane à travers de petites fentes à l’aide d’une succion. Nous avons effectué le dot-blot sur 2 échantillons de 10 μL de phages élués lors de la dernière sélection avec le peptide de la portion C-terminale de la protéine FMR1. L’anticorps primaire utilisé pour l’un des échantillons était l’anti-M13 (Amersham Biosciences) et l’autre était l’anticorps 9E10 (anti-cmyc, Santa Cruz Biotechnology). L’anticorps secondaire utilisé est SAM-HRP (Anti-souris chez la brebis, Amersham) et la détection est faite telle que décrit dans la section immunobuvardage. Cette expérience nous a permis d’évaluer la proportion de phages exprimant les scFvs à leur surface.

L’immunisation des souris et la fusion ont été effectuées par Patricia John Sauder de l’équipe du Dr. John Wilkins. (CGDN Immunoprobe core facility, Université du Manitoba)

Pour la production d’anticorps, nous avons cultivé les hybridomes dans le RPMI 1640 enrichi avec 10 % de sérum de veau foetal à 37oC dans un atmosphère de 5% CO2. Une fois la “confluence” atteinte, une ou deux boîtes de culture sont diluées 1:10 avec du milieu frais et remises en culture. Les autres boîtes servant à la production d’anticorps sont conservées en culture pour deux semaines supplémentaires jusqu’à la mort cellulaire complète. Le surnageant contenant les anticorps est récupéré à la suite de la centrifugation de la culture. Nous avons déterminé la classe et la sous-classe des anticorps avec le kit IsoStrip Mouse Monoclonal Isotyping kit (Roche) qui permet aussi de déterminer la chaîne légère de l’anticorps (λ ou κ).

Le principe de l’immunoprécipitation repose sur la création d’un réseau protéique en utilisant des anticorps spécifiques comme agent de liaison. Le premier anticorps se lie aux protéines à précipiter et un anticorps secondaire (tel un anti-souris de chèvre) permet de relier les anticorps primaires en réseau. Il en résulte un complexe de poids moléculaire élevé qui peut être précipité par centrifugation. Une autre stratégie consiste à utiliser un composé reconnaissant l’anticorps primaire (ou secondaire) et qui est suffisamment lourd à lui seul (tel la protéine L-agarose) pour permettre la précipitation du complexe par centrifugation.

Nous avons tenté l’isolement de la protéine FMR1 endogène par immunoprécipitation à partir de lysats de cellules HeLa et de cellules de la lignée lymphoblastique normale 875 A. Quatre tampons de lyse différents ont été utilisés soient les tampons RIPA avec et sans SDS, le TBS/1% SDS et le TBS/1% Triton X-100. Nous avons testé le surnageant d’hybridome de 14D3 et l’anticorps sous sa forme purifiée.

Pour la préparation des homogénats, environ 106 cellules ont été lysées dans 2 mL des différents tampons puis laissées 1 heure (ou toute la nuit) à 4 oC. Le lysat a ensuite été centrifugé à 13000 RPM pendant 5 minutes et le surnageant récupéré. Nous avons éliminé les protéines se liant de façon non-spécifique à la protéine-L ou à l’agarose. Pour cela nous avons ajouté la matrice protéine-L agarose à raison de 25 μL (1-2 mg/mL) par mL de lysat et incubé à 4 oC en rotation continue pendant 1 heure. La matrice est récupérée suite à une centrifugation de 5 minutes à 3000 RPM puis conservée pour son analyse.

En plus des différents tampons de lyse utilisés, nous avons testé les points suivants afin de vérifier leur influence sur la quantité de protéine FMR1 immunoprécipitées:

- La quantité de lysat utilisé (dilué avec du PBS ou du TBS lorsque nécessaire). Si on augmente le volume de lysat pour l’immunoprécipitation, on augmente la quantité de protéine FMR1 et de protéines contaminantes. Il faut donc trouver un équilibre entre ces deux paramètres.

- La quantité de surnageant d’hybridome 14D3 ou d’anticorps purifiés. Lors de l’immunoprécipitation, il faut s’assurer d’utiliser une quantité adéquate d’anticorps. S’il y a un excès d’anticorps, ceux qui sont libres se lieront de façon non-spécifique et des protéines contaminantes seront précipitées.

- L’incubation de l’anticorps seul dans le lysat avant l’ajout de la protéine-L, l’incubation des deux simultanément dans le lysat ou les deux simultanément mais ayant été incubés ensemble avant leur ajout au lysat .

- La quantité de protéine-L agarose utilisé peut aussi jouer un rôle. Cette matrice peut lier d’autres protéines que les IgG, c’est pourquoi il est nécessaire de faire une immunoprécipitation non-spécifique (clear up) avec la protéine L-agarose avant. Cependant, si cette dernière est en excès lors de l’immunoprécipitation proprement dite, il est possible qu’elle précipite des protéines contaminantes.

- Le temps d’incubation: soit une heure ou toute la nuit à 4 oC.

Suite à l’incubation, le complexe a été récupéré par centrifugation à 3000 RPM pendant 5 minutes. Le surnageant est conservé pour analyse et le culot est lavé avec le tampon de lyse ou du PBS. Le culot est ensuite repris dans 100 μL de tampon Laemmli 1X. Les lavages sont aussi conservés pour analyse. Un échantillon de chaque étape est dénaturé à 100 oC, séparé par SDS-PAGE et analysé par immunobuvardage avec l’anticorps 1C3.

L’immunofluorescence est une technique permettant de visualiser la position intracellulaire d’une protéine en utilisant un anticorps primaire spécifique et un anticorps secondaire couplé à un fluorophore tel le FITC ou la rhodamine. Le fluorophore est excité à une longueur d’onde distincte et la réémission est observé avec un microscope à fluorescence. Puisque les cellules sont fixées au support solide, il est possible de prendre un “instantané” de la position des protéines dans la cellule. Cette technique permet aussi d’étudier la colocalisation de plusieurs protéines en utilisant différents fluorophores.

Pour l’immunofluorescence que nous avons effectué, des cellules HeLa ont été cultivées dans des plaques 6-puits au fond desquelles nous avions préalablement déposé une lamelle. Deux millilitres de milieu DMEM (Dulbeco Modified Eagle Medium) contenant 3x105 cellules HeLa ont été déposés dans les puits. Les cellules ont été mises en culture à 37oC jusqu’à ce qu’elles atteignent la confluence (24-48 heures). Pour fixer les cellules, les lamelles ont été immergées dans une solution 4% paraformaldéhyde/0.1 % Triton X-100 pendant 10 minutes puis lavées 3 fois avec du PBS.

La perméabilisation des cellules a été effectuée dans une solution 0.1 % citrate de sodium/0.1 % Triton X-100 pendant 2 minutes sur la glace. Nous avons lavé les lamelles 2 fois avec du PBS. Une fois le PBS aspiré, 500 μL des surnageants d’hybridomes 1C3 et 14D3 ont été déposés sur les cellules puis incubés toute la nuit à 4 oC dans une boîte de Pétri contenant du coton mouillé afin d’éviter l’assèchement des cellules. Le lendemain, les cellules ont été lavées 2 fois avec une solution de PBS/Tween-20 0.1 % pendant 10 minutes.

Dans le noir, 500 μL d’anticorps secondaire GAM-FITC (Jackson lab.) dilué 1:100 dans le PBS/BSA 1 % ont été déposé sur les lamelles et laissée pendant 30 minutes à la température de la pièce. Le tout a été aspiré et les cellules lavées 2 fois 10 minutes avec du PBS/Tween-20–0.1 %. Nous avons ensuite couvert les lamelles d’une solution empêchant l’atténuation du signal fluorescent (DAKO fluorescent mounting medium) et permettant de fixer les lamelles sur des lames. Les images ont observées sur un microscope Olympus BX60 à 40X et 100X et leur saisie effectuée à l’aide du logiciel Isis (In Situ Imaging System) de Metasystem.

L’immunohistochimie est un procédé permettant de visualiser la distribution tissulaire d’une protéine sur des coupes de tissu fixées à un support solide. Cette technique permet aussi de déterminer si la protéine est cytoplasmique ou nucléaire. La détection se fait habituellement avec un substrat chromogénique mais la fluorescence peut aussi être utilisé si le bruit de fond n’est pas trop élevé. Nous avons utilisé un substrat chromogénique.

Des sections de tissus (5 μm) scellées dans la paraffine ont été déposées sur des lames prétraitées (VWR Superfrost®plus) et laissées à sécher pendant 24 heures à 37 oC. Après la dissolution de la paraffine dans le toluène, les tissus ont été réhydratés graduellement dans des solutions d’éthanol (100 %, 95 %, 75 % et 50 %) puis dans l’eau uniquement. L’élimination de l’activité des peroxydases endogènes a été effectuée en trempant les lames pendant 30 minutes dans une solution PBS-0.3% H2O2. Les déterminants antigéniques des protéines sont exposés en chauffant les coupes 3 fois 5 minutes au micro-onde dans une solution de citrate 10 mM pH 6.0. Le blocage des anticorps endogènes s’effectue avec la solution de blocage du kit Histomouse™ (Zymed) en suivant les instructions du manufacturier. Les anticorps primaires ont été incubés toute la nuit à 4 oC. Le lendemain, les lames ont été nettoyées (3 lavages de 2 minutes) avec du PBS 1X. La détection des monoclonaux est effectuée à l’aide d’un anti-IgG de souris biotinylé qui est déposé sur les coupes et incubé pendant 30 minutes à la température de la pièce. Les lames ont été nettoyées tel que décrit précédemment. Un conjugué streptavidine-peroxydase (HRP) a été laissé sur les coupes pendant 30 minutes. L’excédant a été rincé puis nous avons ajouté le substrat AEC provenant du kit et l’avons laissé sur les lames pendant 10 minutes. Lors de la détection des protéines, le substrat devient rouge. Le tout est rincé à l’eau. Certaines lames ont été contre-colorées avec l’hematoxylin (permet de visualiser le noyau en colorant l’ADN(bleu)) pendant 30 secondes avant le montage final avec les lamelles. Les images ont été prises avec un appareil Orthomate sur un microscope Leica DMRB à 40X et 100X.

Une des étapes importantes de la caractérisation d’un anticorps consiste à identifier la portion de la protéine qui est reconnue par celui-ci. Pour la cartographie des épitopes de nos anticorps, nous avons amplifié par PCR des portions du gène FMR1 à partir du vecteur pQE31/FMR1 (ayant servi à la production de la protéine tronquée). Ces produits PCR ont été cloné dans le vecteur pQE31 et les peptides produits tel que décrit à la section 2.2.8 (p. 60).

Le mélange pour l’amplification PCR des fragments contenait 5 ng de vecteur pQE31/ FMR1 , 1,25 μM de chaques amorces (Tableau 2 p.79), 200 μM de dNTPs, la solution Q, le tampon PCR et 2 unités de la polymérase Taq de Qiagen dans un volume final de 40 μL. Pour chacun des fragments amplifiés, 5 tubes ayant 40 μL de mélange PCR ont été préparés. L’amplification a été vérifiée en déposant 30 μL sur un gel d’agarose 1 % et la migration a été effectuée à 100 volts pendant 1 heure dans le TAE. Le gel était ensuite coloré au BrEt et le produit PCR visualisé sur un transilluminateur UV.

Nous avons inséré un site de restriction Pst I ou Hind III dans chacune des amorces de manière à pouvoir cloner le fragment PCR dans le vecteur pQE31 digéré par l’enzyme correspondant. À la suite de l’amplification, le produit PCR restant (170 µL) a été digéré toute la nuit à 37 oC dans un mélange contenant 100 unités de PstI ou HindIII (New England Biolabs), le tampon suggéré par le manufacturier et de la BSA à 100 μg/mL (PstI). Le lendemain, 100 unités supplémentaires d’enzyme ont été ajoutées au mélange et la digestion prolongée de quelques heures.

La concentration en sel de la phase aqueuse a été augmentée à 0.25 M afin d’augmenter la force inonique. Ceci a pour effet de diminuer la solubilité de l’ADN. Par la suite, 2 volumes d’éthanol absolu froid ont été ajoutés. Le mélange est laissé à –20 oC pendant 1 heure puis centrifugé pendant 30 minutes à 14 000 RPM à 4 oC. Le surnageant a été éliminé par décantation et le culot lavé à l’éthanol 70 % froid. À la suite d’une centrifugation à 14 000 RPM, l’éthanol a été décanté et le culot laissé à sécher. Le culot d’ADN a été repris dans 30 μL d’eau ultrapure et laissé à 37 oC pendant 20 minutes pour permettre sa dissolution.

La ligation du produit PCR digéré est effectuée dans un mélange contenant le vecteur pQE31 digéré avec l’enzyme correspondante (puis déphosphorylé avec la phosphatase d’intestin de veau), 3 μL de fragments PCR, le tampon de ligation recommandé par le manufacturier (NEB) et 400 unités de T4 ligase dans un volume final de 20 μL. Le mélange est incubé toute la nuit à 16 oC dans un thermocycleur Perkin-Elmer. Le lendemain, les ligations ont été purifiées sur microcon-100 (Amicon) selon les instructions du manufacturier.

La transformation de cellules XL1Blue avec les vecteurs contenant les inserts a été effectuée tel que décrit précédemment dans la section “Transformation par électroporation”. L’orientation et la taille de l’insert ont été vérifiées par PCR en utilisant l’amorce PBF (dans le vecteur) et l’amorce inverse utilisée lors de l’amplification PCR du fragment à partir du vecteur (Tableau 2). Le mélange et les conditions de PCR sont identiques à ce qui a été décrit précédemment dans cette section. Les plasmides ont ensuite été produits, purifiés et reclonés dans la souche M15 pour la production des fragments peptidiques (Figure 28 et 29 p.111-112).

Les différents fragments peptidiques ont été produits tel que décrit dans la section 2.2.8 (p. 60). Cependant, les peptides n’ont pas été purifiés, le culot de cellules ayant été repris directement dans le tampon Laemmli puis séparé par SDS-PAGE. Les échantillons ont été transférés sur une membrane de nitrocellulose tel que décrit précédemment. Un immunobuvardage a été effectué pour chacun des 22 hybridome conservés. Le surnageant constituait la source d’anticorps primaires.

Tableau 2: Amorces utilisées pour l’amplification de fragments PCR pour la production de peptides servant à la cartographie des épitopes. Les sites de restriction Pst I et Hind III ont été ajoutés aux amorces pour le clonage des fragments dans pQE31.

Une fois les épitopes identifiés, nous avons sélectionné deux anticorps reconnaissant des régions ne se chevauchant pas afin de mettre au point un ELISA-sandwich. Cette technique consiste à fixer un anticorps spécifique aux puits d’une plaque ELISA, de bloquer les sites de liaison restants et d’incuber l’antigène (purifié ou dans un homogénat cellulaire) que l’on désire détecter. Ensuite, le second anticorps (couplé à une enzyme, à la biotine ou marqué radioactivement) est déposé dans les puits et la présence de la protéine est détectée (par un changement de couleur ou par l’émission de radioactivité). Puisque le premier anticorps (le plus spécifique) est en excès, le signal obtenu est proportionel à la quantité d’antigène. Ainsi, en effectuant une courbe standard avec l’antigène purifié, il est possible de quantifier simultanément l’antigène dans des échantillons où sa concentration est inconnue.

Comme premier anticorps, nous avons choisi 14D3 puisqu’il est celui présentant la plus grande spécificité. Celui-ci est adsorbé à la paroi des puits en l’incubant toute la nuit à 4 oC dans un tampon carbonate pH 9.6 à une concentration de 4 μg/mL. Le lendemain, les puits sont nettoyés avec du PBS/Tween-20 0.1 % (3 lavages). Les puits sont ensuite bloqués avec du Superblock™ dans le PBS (Pierce) pendant 1 heure à 37oC. Les puits sont lavés tel que décrit plus haut avant l’ajout de l’inconnu et de la protéine FMR1 tronquée (quantité variant entre 0 et 8 ng). Celle-ci est incubée à la température de la pièce pendant une heure en agitant à 200 RPM et les protéines libres sont lavées. L’anticorps secondaire (11F7-biotine, biotinylé avec le kit EZ-Link™ Sulfo-NHS-Biotin de Pierce) est ajouté à une concentration de 1 μg/mL à raison de 100 μL par puits. Il est incubé à la température de la pièce pendant 1 heure en agitant suivi de 3 lavages. Finalement, le conjugué streptavidine-HRP (100 ng/puit) est incubé pour 30 minutes à la température de la pièce et les conjugués non-liés sont éliminés au cours des lavages. Le substrat TMB (TMB peroxydase de Bio-Rad) est ajouté (100 μL par puits) et nous laissons la coloration se développer pendant 5 minutes (plus ou moins selon l’intensité de la coloration) avant d’arrêter la réaction en ajoutant 50 μL d’acide sulphurique 1M (H2SO4). La coloration passe du bleu au jaune et la densité optique est lue à 450 nm sur un lecteur de plaque Bio-Rad. Une correction à 650 nm peut être effectuée.

Tampon TAE

40 mM. Tris-base, 25 mM EDTA (Acide éthylenediamine tetraacétique)

20 mM acide acétique.