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L’utilisation de la banque de scFvs Griffin.1 nécessite l’antigène sous une forme pure ou presque. Nous avons donc produit, dans un système bactérien, la protéine FMR1 fusionnée à un tag hexa-histidine. Ce dernier permet, dans un premier temps, de détecter si la protéine est produite à l’aide d’un anticorps anti-hexa histidine, et permet aussi de purifier la protéine à l’aide d’une matrice Ni-NTA.

Une fois le gène cloné dans la souche d ’E. coli , la première étape consistait à étudier l’expression de la protéine en fonction du temps. Tel que démontré sur le gel à la figure 11, le maximum d’expression est atteint 4 heures après l’induction à l’IPTG (Échantillons 6). On retrouve une forme mineure à 80 kDa et une forme majeure à 60 kDa qui pourrait résulter de la dégradation de celle de 80 kDa.

L’étape suivante consistait à déterminer dans quel tampon de lyse la protéine était soluble puisque ce n’est que sous cette forme qu’elle peut être purifié sur la matrice Ni-NTA. Nous avons donc vérifié les trois tampons recommandés par le manufacturier soit le tampon “natif”, qui permet de purifier la protéine tout en conservant la structure adoptée dans la cellule, et les tampons “urée” et “guanidine” qui sont tous deux dénaturants. Dans le tampon natif, seule une faible proportion de la protéine FMR1 était soluble (Figure 11, échantillon 9) alors que le reste se retrouvait dans le culot à la suite de la centrifugation (Échantillon 10). Cela est probablement dû au fait que la protéine est séquestrée dans des corps d’inclusion lors de sa production dans le contexte cellulaire bactérien. Par contre, la protéine FMR1 recombinante était soluble dans les deux tampons dénaturants et la totalité ou presque se retrouvait dans les surnageants (Échantillons 11 et 13).

Figure 11: Cinétique de la production de la protéine FMR1 dans la souche M15 sur une période de 6 heures suivant l’induction à l’IPTG et test de solubilité dans différents tampons de lyse.

Échantillons séparés par SDS-PAGE 8%. Gel coloré au bleu de Coomassie. 1: Échantillon non-induit, 2: 30 minutes après induction (a.i.), 3: 60 min. a.i., 4: 120 min. a.i., 5: 180 min. a.i., 6: 240 min. a.i., 7: 300 min. a.i., 8: 360 min. a.i., M: marqueur de poids moléculaire (Flèches rouges: 205 kDa, 115 kDa, 97 kDa, 66 kDa, 45 kDa) 9: Surnageant et 10: culot récupérés à la suite de la lyse des cellules produisant FMRP dans le tampon “natif”, 11: Surnageant et 12: culot récupérés à la suite de la lyse des cellules produisant FMRP dans le tampon “urée” , 13: Surnageant et 14: culot récupérés à la suite de la lyse des cellules produisant FMRP dans le tampon “guanidine”. Les flèches noires à la gauche de la figure représentent la forme complète et la forme tronquée de la protéine FMR1 qui sont produites.

La production de la protéine étant fonctionnelle, nous devions nous assurer que celle-ci était bien FMR1. Nous avons donc effectué un immunobuvardage (avec l’anticorps 1C3 comme anticorps primaire) sur l’extrait bactérien obtenu 6 heures après l’induction. Nous avons déposé différentes dilutions de cet extrait (Figure 12, échantillons 2 à 5) et nous avons comparé l’intensité du signal avec celui de l’extrait avant l’induction (Figure 12, échantillon 1) afin de vérifier l’efficacité de la production protéique.

Figure 12: Immunobuvardage avec l’anticorps 1C3 sur différentes dilutions d’un lysat de cellules produisant la protéine FMR1 recombinante.

Échantillons séparés par SDS-PAGE 8%. Puit 1: Échantillon non-induit, 2: Éch. Induit, 3: Éch. induit dilué 10X, 4: Éch. induit dilué 100X, 5: Éch. induit dilué 1000X, 6: Éch. induit dilué 10 000X. La position des marqueurs est indiquée à la gauche de la figure.

En comparant l’échantillon non-induit aux dilutions de l”échantillon induit, nous avons évalué que l’induction augmentait la production de deux à trois ordres de grandeur. On peut voir que la forme à 60 kDa est majoritaire et est peut-être un produit de dégradation de la forme à 80 kDa. Des tests de production dans des milieux de culture contenant des inhibiteurs de protéase n’ont pas permis d’obtenir une plus grande proportion de protéines de 80 kDa ni de diminuer les produits de dégradation de moins de 60 kDa. Ces résultats démontrent que les deux formes produites (à 80 kDa et 60 kDa) sont effectivement des protéines FMR1.

Le tag hexa-histidine permet de purifier la protéine en utilisant une matrice Ni-NTA. Compte tenu du volume nécessaire pour produire plusieurs milligrammes de la protéine, nous avons décidé d’utiliser la résine agarose-Ni-NTA qui permet d’extraire les protéines produites à plus grande échelle. L’élution des protéines est effectuée en mélangeant la matrice Ni-NTA à un tampon à pH acide ou un tampon contenant de l’imidazole. Cette molécule fait compétition à l’histidine pour la liaison aux ions de nickel.

Lors de nos expérimentations, nous avons remarqué que l’élution à pH acide affectait l’intégrité de la protéine. Nous avons décidé d’utiliser un tampon PBS contenant 500 mM d’imidazole (au lieu des 250 mM recommandés) permettant ainsi d’éluer les protéines dans un plus petit volume. Cependant, plusieurs autres protéines s’accrochent à la matrice Ni-NTA et sont éluées avec les protéines FMR1. Une partie de ces protéines ont été éliminées de différentes manières:

Tout d’abord, une bonne proportion des protéines bactériennes sont solubles dans le tampon natif. En lysant les cellules dans ce tampon, ces protéines se retrouvaient dans le surnageant (Voir Figure 11, échantillon 9, p. 86). Les protéines insolubles (dont la protéine FMR1) se retrouvaient dans le culot après la centrifugation puis étaient solubilisées dans le tampon “urée”.

En second lieu, nous avons ajusté la quantité de résine Ni-NTA de manière à ce qu’il n’y en aie que très peu de libre une fois toutes les protéines FMR1 accrochées. Cela permettait de limiter la quantité de protéines se liant à la matrice de façon non-spécifique.

Finalement, nous avons éliminé une partie des protéines contaminante en ajustant la quantité d’imidazole lors des lavages. En ajoutant 20 mM d’imidazole lors des lavages, les protéines contaminantes fixées faiblement décrochaient alors que les protéines ayant le tag histidine restaient liées.

Malgré tout, il restait toujours des protéines contaminantes (Échantillon 1 de la Figure 13). Une partie de ces contaminations sont des produits de dégradation de la protéine FMR1 ayant le tag hexa-histidine. La manière la plus simple de purifier presque complètement la protéine majeure (60 kDa) consistait à séparer l’élution sur un gel d’acrylamide préparatif puis de découper la bande correspondant à la protéine. Nous avons ensuite électroélué les protéines du gel, obtenant ainsi une forme très enrichie de la protéine FMR1 tronquée. (Figure 13, échantillons 2 à 5) La mise au point des conditions de production de la protéine FMR1 recombinante tronquée et de sa purification ont pris près de 6 mois à réaliser.

Figure 13: Résultat de la purification des protéines recombinantes par électroélution.

Échantillons séparés sur SDS-PAGE 8%. Gel coloré au bleu de Coomassie. Échantillon 1: Protéines éluées à la suite de la purification sur matrice Ni-NTA. Échantillons 2 à 5: Fractions recueillies dans le bas des carottes après l’électroélution (Figure 10).

Avec la forme purifiée de la protéine FMR1 tronquée, nous avions tout le nécessaire pour débuter l’utilisation de la banque Griffin.1. Après l’amplification de la banque, nous avons mesuré le titre et celui-ci était de 1.2 x 1014 phages dans un millilitre. La diversité de la banque étant de 1010 clones cela signifie que si chacun des clones s’est reproduit de manière équivalente, nous avons près de 10 000 copies de chaque phage. Le protocole indique qu’il faut utiliser 1012-1013 phages, impliquant que nous pouvions faire au moins 10 sélections en utilisant 1013 phages. Plusieurs essais de sélection ont été effectués avec la protéine purifiée et bien que nous observions une augmentation du nombre de phages élués après chaque tour de sélection, aucun scFv ou phage spécifique à la protéine FMR1 n’a pu être isolé.

Nous avons envisagé que l’adsorption de la protéine tronquée au support solide (immunotube) pouvait être limitée par l’encombrement stérique. C’est pourquoi nous avons décidé d’utilisé un peptide pour les sélections. Cela nous permettait de mettre beaucoup plus de peptides dans l’immunotube et la région reconnue parles scFvs était restreinte. Nous avons d’abord tenté une sélection sur des peptides uniques à la protéine homologue FXR1 afin de vérifier si les sélections fonctionnaient avec des antigènes de moins de 20 acides aminés. Ceux-ci ont été généreusement fournis par le Dr. Edouard W. Khandjian qui s’en était préalablement servi pour immuniser des lapins et des souris (Khandjian et al. 1998). Bien que nous obtenions un enrichissement similaire aux sélections effectuées avec la protéine FMR1 tronquée, dans ce cas-ci nous avons réussi à obtenir des scFvs qui reconnaissaient la protéine FXR1 en immunobuvardage (Figure 14 A). Le signal obtenu était très faible et nous avons tenté de produire une plus grande quantité de scFvs afin d’augmenter le signal. Malheureusement, nous n’avons pas réussi à faire produire les fragments d’anticorps solubles par les bactéries non-suppressives lors des cultures subséquentes. Nous n’avons pas été en mesure de reproduire les résultats exposés dans la figure 14A.

Puisque la sélection avec des peptides avait donné des résultats encourageants, nous avons décidé d’utiliser un peptide de 15 acides aminés se situant en C-terminal de la protéine FMR1. Encore une fois, nous avons obtenu un certain enrichissement lors des sélections et nous avons infecté la souche non-suppressive (HB2151) avec les phages issus de la 4e sélection. Une faible quantité de scFvs ont été produits et ceux-ci ont été testés par immunobuvardage. Le résultat est présenté en B de la Figure 14. Nous avons obtenu un signal très faible uniquement avec la protéine FMR1 recombinante purifiée (forme de 60 kDa). Encore une fois la production de fragments solubles était en cause et nous n’avons pas réussi à obtenir une production satisfaisante pour détecter la protéine endogène. Nous avons effectué un cinquième tour de sélection puis avons infecté la même souche avec les phages élués mais sans obtenir de scFvs. Ces phages ont aussi été utilisés pour infecter une souche TG1. La production de ces phages a permis de mesurer la proportion de phage ayant à leur surface des scFvs. Cette proportion atteint au maximum 10 %.

Pour obtenir les résultats de la figure 14B, il nous fallait exposer plus de 20 minutes afin d’observer un signal comparativement à une dizaine de secondes avec l’anticorps #830. Les fragments d’anticorps ne pouvant être produits de façon soluble en grande quantité, nous avons décidé de concentrer nos efforts sur la production d’anticorps monoclonaux malgré le fait que près de 16 mois aient été consacrés à la technique du “phage display”.

Nous avons utilisé une des ressources du Réseau Canadien des Maladies Génétiques pour créer de nouvelles lignées d’hybridomes. Cette partie du projet a débuté par la production et la purification de près de 10 mg de protéine FMR1 recombinante sous sa forme tronquée. Le processus d’immunisation a nécessité près de 5 mois et dans l’intervalle nous avons continuer à travailler sur la sélection de nouveaux scFvs avec la banque Griffin.1 mais sans obtenir de meilleurs résultats.

Figure 14: Immunobuvardages avec les scFvs obtenus après la sélection avec les peptides issus des protéines FXR1 et FMR1.

A: Ac anti-FXR1P (#830 dilués 1:2000 avec du Blotto 5%) B: ScFvs anti-FXR1P (dilués 1:2 avec du Blotto 10%) Puits 1: Protéines FMR1 purifiées, 2: Lysat de bactéries produisant FXR1 recombinant 3: Lysat dilué 1:10, 4: Lysat dilué 1:100, 5: Lysat de bactéries non-induites. C: ScFvs anti-FMRP (dilués 1:2 avec du Blotto 10%) Puits 1: BSA (1 μg), 2: Lysat de cellules HeLa, 3: Protéine FMR1 tronquée enrichie (1 μg), 4: Lysat de bactéries produisant FMR1. Les temps d’exposition sont inscrits à la gauche des figures.

Les souris ont été immunisées avec la protéine FMR1 recombinante tronquée en présence d’un adjuvant. Après la troisième injection, nous avons testé les liquides péritonéaux des souris par immunobuvardage sur des homogénats de lignées lymphoblastiques normale et X-fragile et seulement une des quatre souris produisait des anticorps dirigés contre la protéine FMR1. À la suite d’une réinjection, cette souris à été sacrifiée et les cellules de sa rate ont servi à la production des hybridomes. Lors du premier criblage, 59 clones positifs ont été identifiés par ELISA. De ce nombre, 22 reconnaissaient la protéine endogène et des clones ont été obtenus par dilution limite puis testés à nouveau par immunobuvardage sur les lignées mentionnées ci-haut. Ceci nous a permis de vérifier si les anticorps monoclonaux reconnaissaient toujours la protéine endogène et nous a donné une idée de leur spécificité (Figure 15). Seulement quatre lignées produisaient des anticorps spécifiques à la protéine FMR1 et l’anticorps 14D3 est ressorti comme étant le plus intéressant.

Tous les surnageants d’hybridomes ont été testés sur des homogénats totaux des deux mêmes lignées cellulaires. Nous avons obtenu 4 patrons de détection différents mais 12B10 est le seul représentant de sa catégorie. Ainsi, lorsque nous parlerons d’anticorps tels 14D3, 11F7 ou 1C10, nous ferons référence aux patrons de détections observés sur les immunobuvardages de la figure 15. Aucun anticorps ne semble être différent des 4 types mentionnés ci-dessus et la cartographie des épitopes permettra d’appuyer cette hypothèse.

Figure 15: Résultats du criblage des anticorps sur des extraits de lignées de cellules normales et X-fragile effectué par immunobuvardage.

Échantillons séprarés par SDS-PAGE 8%. Lignées lymphoblastiques utilisées: N (Normale) = 875 A et X (X-fragile) = GM 09145. Anticorps: A: Surnageant d’hybridome 14D3 dilué 1:2 avec du Blotto 10%, B: Surnageant d’hybridome 12B10 dilué 1:2 avec du Blotto 10%, C: Surnageant d’hybridome 11F7 dilué 1:2 avec du Blotto 10%, D: Surnageant d’hybridome 1C10 dilué 1:2 avec du Blotto 10%. Les flèches en C et D indiquent la position des protéines FMR1 endogènes. Les positions des marqueurs de poids moléculaires (en kDa) sont indiqués par les tirets.

Le test de spécificité pour 14D3 a été effectué sur des homogénats totaux de cerveau, de testicules, de muscles squelettiques et de coeur de souris normale et knock-out. Ce test a été effectué avec l’anticorps 14D3 qui est le seul à présenter une bonne spécificité ainsi qu’avec l’anticorps 1C3 pour montrer la réaction croisée avec la protéine FXR1.

Dans la Figure 16 A (Échantillons 1 et 2) on peut voir que l’anticorps 14D3 détecte uniquement la protéine FMR1 dans le cerveau et les testicules de souris normales alors que pour les muscles squelettiques, le coeur et les tissus k-o il n’y a aucun signal observé. Les échantillons présentent un peu de dégradation mais les résultats montrent bien que cet anticorps est spécifique. L’anticorps 1C3 reconnaît bien la protéine FMR1 dans le cerveau et les testicules (Figure 16 B échantillons 1 et 2) mais on peut voir qu’il détecte simultanément la protéine FXR1. Ceci est en accord avec l’hypothèse que la protéine FXR1 pourrait contribuer au signal de FMR1 en immunobuvardage. On observe aussi cette réaction croisée dans les extraits de cerveau et de testicules de la souris knock-out. Lorsque l’on surexpose le film (Fig. 16 C), on peut aussi voir que l’anticorps 1C3 détecte les superformes de la protéine FXR1 (81-83 kDa) dans les échantillons de muscle et de coeur (de souris normale et knock-out). Évidemment, lorsque la protéine FMR1 est absente ou en faible quantité il est plus aisé d’observer la réaction croisée.

Figure 16: Immunobuvardage démontrant la spécificité des anticorps monoclonaux 14D3 et 1C3.

Les échantillons ont été séparés par SDS-PAGE 8% A: Anticorps 14D3 purifié dilué 1:100 dans le Blotto 5%, B: Surnageant d’hybridome 1C3 dilué 1:2 dans le Blotto 10%, C: Surexposition d’un blot équivalent à celui en B mais sans le contrôle d’actine. Les échantillons sont des homogénats totaux lysés dans le tampon Laemlli, triturés physiquement, soniqués puis chauffés pendant 10 minutes à 100oC. 1: Cerveau de souris sauvage, 2: Testicules de souris sauvage, 3: Muscles squelettiques de souris sauvage, 4: Coeur de souris sauvage, 5: Cerveau de souris k-o, 6: Testicules de souris k-o, 7: Muscles squelettiques de souris k-o, 8: Coeur de souris k-o. La position des marqueurs de poids moléculaire est inscrite à la droite des figures. Les flèches en A et B indiquent la position du contrôle d’actine. Anti-actine: Ac JLA20 (Developmental Studies Hybridoma Bank at the University of Iowa).

Nous avons effectué un immunobuvardage avec des homogénats de tissus totaux afin de vérifier lesquels produisaient la protéine FMR1. L’expérience démontre bien que la protéine FMR1 n’est pas exprimée dans les mucles et le coeur (puits 1 et 2). On retrouve un certain niveau d’expression dans tous les organes à l’exception du foie (puit 5) qui produit peu de protéines FMR1. Les extraits de cerveau et de testicules ont été dilué (10X et 5X respectivement) pour cet immunobuvardage afin de ne pas masquer les signaux environnants.

Figure 17: Immunobuvardage sur des extraits de tissus murins sauvages.

Les extraits ont été séparés par SDS-PAGE 8% et le temps d’exposition de la membrane est de 15 minutes. L’anticorps utilisés est le mAc 14D3 purifié dilué 1:100 dans le Blotto 5%. Les échantillons sont des homogénats totaux de différents tissus d’une souris normale préparés tels que décrit à la figure 16. 1: Muscles squeletttiques, 2: Coeur, 3: Cerveau, 4: Testicules, 5: Foie, 6: Rate, 7: Estomac, 8: Intestin, 9: Rein, 10: Poumon, 11: Marqueur de poids moléculaires (82 kDa, 63 kDa, 42.5 kDa et 32.5 kDa) 12: Extrait de cellules HeLa. La quantité de protéines totales de chaque échantillons a été vérifiée par coloration au bleu de Coomassie d’un gel équivalent à celui transféré pour l’immunobuvardage. La quantité de protéines totales est similaire pour tous les tissus à l’exception du cerveau et des testicules qui ont été dilué 10X et 5X respectivement.

Théoriquement, tous les anticorps énumérés dans le tableau 3 pouvaient être purifiés avec la protéine-L puisqu’ils ont tous une chaîne légère kappa. Nous avons donc préparé des colonnes d’affinité avec l’agarose protéine-L et nous y avons passé les surnageants des hybridomes mentionné dans le tableau 3. La purification n’a pas très bien fonctionné pour l’anticorps 1C3. Cependant, celles des anticorps 14D3, 12B10 et 11F7 ont donné d’excellents résultats alors que la purification de l’anticorps 15G9 n’a pas fonctionné. Le résultat de la purification de 14D3 est montré à la figure 18.

Figure 18: Résultat de la purification des anticorps 14D3 sur colonne de protéine-L agarose.

Les échantillons ont été séparés par SDS-PAGE 8%. A: Gel coloré au bleu de Coomassie. B: Immunobuvardage effectué avec l’anticorps GAM-HRP dilution 1:1000. M: Marqueurs de poids moléculaires (173 kDa, 83 kDa, 62 kDa, 48 kDa et 33 kDa) Puits 1: Sunageant d’hybridomes avant purification, 2: Éluat, 3: Lavage #1, 4: Lavage #6, 5: Élution (premier mL), 6: Élution (deuxième mL), 7: Élution (troisième mL). Tampon d’élution: 0.1 M Glycine-HCl pH 2.0.

On peut voir à la Figure 18A que la purification est fonctionnelle. Le peu de contaminants se trouvant dans la colonne sont éliminés lors des deux premiers lavages comme le confirme l’absence de protéines dans le dernier lavage (Fig. 18A, échantillon 4). Compte tenu que la presque totalité des anticorps des 50 ml de surnageant se retrouvent dans environ 1 mL, nous évaluons le facteur de concentration à au moins 40X si l’on compte les pertes encourues lors des lavages et le peu qui se retrouve dans la deuxième et troisième élutions (Figure 18 B, échantillons 6 et 7).

L’isolement de la protéine FMR1 endogène a été tenté par immunoprécipitation à partir de lysats de cellules HeLa et de cellules de la lignée lymphoblastique 875A. Différents tampons de lyse ont été utilisés et une multitude de paramètres ont été modifiés afin d’améliorer les résultats obtenus. Tel que montré dans la Figure 19D (échantillon 2), nous avons réussi à précipiter une faible proportion des protéines FMR1 endogènes en utilisant 500 μL de lysat de cellules 875A dans le tampon TBS-1% Triton X-100. On ne retrouve aucune protéine FMR1 endogène dans les culots obtenus lors des immunoprécipitations non-spécifiques (Fig. 19A, IPNS) et nous n’avons observé que très peu de perte lors des lavages (Fig. 19B). Avec les autres conditions utilisées, la quantité de protéines FMR1 récupérées était de beaucoup inférieure à ce qui est obtenu avec les 500 μL de lysat dans le tampon TBS-1% Triton X-100. Ce résultat a pu être reproduit mais jamais nous n’avons réussi à récupérer autant de protéine FMR1 endogène en une seule immunoprécipitation.

Figure 19: Immunoprécipitation de la protéine FMR1 endogène avec l’anticorps 14D3.

Les échantillons ont été séparé par SDS-PAGE 8%. La source d’anticorps primaires pour les immunobuvardages était le surnageant d’hybridome 1C3 dilué 1:2 avec du Blotto 10%. Deux tampons Tris-NaCl ont été utilisés pour la lyse des cellules 875A, soient un tampon salin avec 1% Triton X-100 (TBS) et l’autre avec 1% SDS (SDS). Les lysats ont été centrifugés avant leur utilisation afin d’éliminer les débris cellulaires restant. Différentes quantités de lysats ont été utilisé lors de l’immunoprécipitation. Le volume de lysat utilisé (en μL) est indiqué entre parenthèse. Le volume total pour l’immunoprécipitaion était de 500 μL. 50 μL de protéine L-agarose ont été utilisés (1-2 mg/ml). A: Surnageants et IPNS (immunoprécipitation non-spécifique). Échantillons 1: Surnageant TBS avant immunoprécipitation (IP), 2: IP non-spécifique TBS (100), 3: IP non-spécifique TBS (500), 4: Surnageant SDS avant IP, 5: IP non-spécifique SDS (100), 6: IP non-spécifique SDS (200), 7: IP non-spécifique SDS (300), 8: IP non-spécifique SDS (400), 9: IP non-spécifique SDS (500). B: Lavages des billes avant IP. Échantillons 1: TBS (100), 2: TBS (500), 3: SDS (100), 4: SDS (200), 5: SDS (300), 6: SDS (400), 7: SDS (500). C: Surnageants après IP. Échantillons 1: TBS (100), 2: TBS (200), 3: Marqueurs de poids moléculaire (69 kDa et 45 kDa) 4: SDS (100), 5: SDS (400), 6: SDS (200), 7: SDS (300) 8: SDS (500). D: Immunoprécipitations. Échantillons 1: TBS (100), 2: TBS (500), 3: SDS (100), 4: SDS (200), 5: SDS (300), 6: SDS (400) 7: SDS (500). Les bandes dans le bas du gel sont les anticorps 14D3 utilisés pour l’immunoprécipitation. La position du marqueur de 80 kDa (position de la protéine FMR1 endogène) est inscrit du côté extérieur de chaque figure.

La caractérisation de l’anticorps 14D3 comme outil cellullaire a débuté avec son utilisation en immunofluorescence sur des cultures de cellules HeLa. Nous avons utilisé le surnageant d’hybridome 14D3 et les anticorps purifiés dans des conditions identiques et il n’y avait pas de différences entre les résultats observés. Les images obtenues, en utilisant le surnageant de 14D3 comme source d’anticorps primaires, sont exposées à la Figure 20. Nous avons aussi tenté l’immunofluorescence avec les autres surnageants d’hybridomes. Cependant, leur plus faible spécificité résultait en une augmentation du bruit de fond et une diminution du signal spécifique.

Figure 20: Immunofluorescence sur des cellules HeLa.

Toutes les images sont prises à un grossissement de 400X. A: Anticorps 14D3 purifiés dilués 1:100 dans le PBS-1% BSA et contre-coloration au DAPI. B: Anticorps 14D3 purifiés dilués 1:100 dans le PBS-1% BSA. C: Surnageant 1C3 dilué 1:2 dans le PBS-1% BSA et contre-coloration au DAPI. D: Contrôle négatif, coloration au DAPI. Anticorps secondaire : GAM-FITC (Jackson lab.) Vert = FITC, Bleu = DAPI.

Les résultats présentés à la figure 20 montrent que l’anticorps 14D3 convient à l’étude des cellules en immunofluorescence. On peut très bien voir que la protéine FMR1 se trouve au niveau périnucléaire dans le cytoplasme des cellules HeLa (Figure 20, A et B) et ceci est observé sur la majorité des cellules que nous avons étudiées (> 90%). La détection de la protéine FMR1 avec l’anticorps 1C3 dans les cellules HeLa montre plutôt une répartition cellulaire plus homogène (Figure 20 C). Il est possible que cela soit dû au fait que l’anticorps reconnaît la protéine FXR1 aussi présente dans les cellules HeLa. Comme le démontre le contrôle, le signal obtenu est bien le fait des anticorps utilisés et non pas une liaison non-spécifique de l’anticorps couplé la fluorescéine (FITC).

Nous avons vérifié l’efficacité de cet anticorps en immunohistochimie sur des coupes de différents tissus de souris normales. Le cerveau étant le tissus produisant le plus de protéines FMR1, nous avons débuté par celui-ci. Puisque les testicules produisent aussi la protéine FMR1 en grande quantité, ainsi que les deux protéines homologues FXR1P et FXR2P, ils constituaient un tissu de choix pour confirmer l’efficacité et la spécificité de l’anticorps 14D3 en immunohistochimie.

Comme il a été montré précédemment dans les publications, la protéine FMR1 se retrouve dans le cytoplasme des neurones du cortex et de l’hippocampe (Figure 21, A et B). Dans le cervelet, la protéine est exprimée dans les cellules de Purkinje à la jonction de la couche granulaire et moléculaire. (Figure 21, C et D) L’anticorps 14D3 est un outil immunohistochimique qui semble répondre aux attentes tant sous forme de surnageant d’hybridome que sous sa forme purifiée. Les immunohistochimies présentées dans les figures 21 à 26 ont été effectuées avec les anticorps purifiés.

Figure 21: Immunohistochimies sur des coupes de cerveau de souris sauvages avec l’anticorps 14D3 purifié.

A: Cortex (C) et hippocampe (H) à un grossissement de 100X, B: Neurones du cortex à un grossissement de 400X, C: Cervelet (Ce) à un grossissement de 100X et D: Cellules de Purkinje (P) dans le cervelet à un grossissement de 400X. La coloration correspondant à la protéine FMR1 est rouge. Les lames ont été contre-colorées à l’hématoxiline (mauve) (Figures 21 à 27). Dilution utilisée 1:100.

Figure 22: Immunohistochimies sur des coupes de testicules de souris normales.

A: Anticorps 14D3 purifiés (dil. 1:100 dans PBS-1% BSA), grossissement 100X, B: Anticorps 14D3 purifiés (dil. 1:100), grossissement 400X, C: Surnageant 1C3 (dil. 1:2), grossissement 400X et D: Anticorps 3FX (dil. 1:2000), grossissement 400X. Les lames ont été contre-colorées à l’hématoxiline. (S=spermatogonies)

Figure 23: Immunohistochimies sur des coupes d’intestin, de colon et de poumon de souris normales.

Détection effectuée avec l’anticorps 14D3 purifié (dil. 1:100 dans PBS-1% BSA). A: Intestin à un grossissement de 100X, B: Intestin à un grossissement de 400X, C: Côlon à un grossissement de 100X, D: Côlon à un grossissement de 400X, E: Poumon à un grossissement de 100X et F: Poumon à un grossissement de 100X. Les lames ont été contre-colorées à l’hématoxiline. (G= cellules Goblets)

Figure 24: Immunohistochimies sur des coupes de rein, de foie et de rate de souris normales.

Détection effectuée avec l’anticorps 14D3 purifié (dil. 1:100 dans PBS-1% BSA). A: Rein à un grossissement de 100X, B: Rein à un grossissement de 400X, C: Foie à un grossissement de 100X, D: Foie à un grossissement de 400X, E: Rate à un grossissement de 100X et F: Rate à un grossissement de 400X. Les lames ont été contre-colorées à l’hématoxiline.

Figure 25: Immunohistochimies sur des coupes d’œsophage et d’estomac de souris normales.

Détection effectuée avec l’anticorps 14D3 purifié (dil. 1:100 dans PBS-1% BSA) A: Œsophage à un grossissement de 100X, B: Œsophage à un grossissement de 400X, C: Estomac à un grossissement de 100X et D: Estomac à un grossissement de 400X. Les lames ont été contre-colorées à l’hématoxiline.

Figure 26: Immunohistochimies sur des coupes de coeur et de muscles squelettiques de souris normales.

Détection effectuée avec l’anticorps 14D3 purifié (dil. 1:100 dans PBS-1% BSA). A: Coeur à un grossissement de 100X, B: Coeur à un grossissement de 400X, C: Muscles squelettiques à un grossissement de 100X et D: Muscles squelettiques à un grossissement de 400X. Les lames ont été contre-colorées à l’hématoxiline.

Figure 27: Contrôles négatifs des immunohistochimies sur des tissus de souris normales.

Anticorps GAM-biotine du kit HistoMouse™. A: Cervelet, B: Côlon, C: Foie et D: Poumon. Toutes les images ont été prises à 100X. Les lames ont été contre-colorées à l’hématoxiline.

Dans les testicules, on peut voir que l’anticorps reconnaît bien la protéine FMR1 qui est exprimée uniquement à la périphérie des tubules séminifères dans le cytoplasme des spermatogonies (Figures 22, A et B, p.104). Cependant, en utilisant les mêmes conditions, nous n’avons pas été en mesure de reproduire ce résultat avec l’anticorps 1C3. Tel que démontré en C de la Figure 22 ci-dessus, 1C3 détecte la protéine dans les cellules en périphérie mais reconnaît aussi les cellules plus matures au centre des tubules. Plusieurs essais ont été effectués mais tous donnaient le même résultat. Ce dernier est probablement du à la réaction croisée entre l’anticorps 1C3 et la protéine FXR1. Une immunohistochimie avec l’anticorps 3FX, dirigé contre la protéine FXR1, montre que cette protéine est exprimée uniquement dans les cellules plus matures au centre des tubules séminifères (Figure 22 D).

Les immunohistochimies sur l’intestin (Figures 23, A et B, p.105), le côlon (Figures 23, C et D) et le poumon (Figures 23, E et F) ont permis de montrer que la protéine FMR1 est fortement exprimée dans des structures s’apparentant aux cellules Goblets. Au niveau du tractus intestinal, ces cellules se retrouvent dans les villosités alors que dans les poumons nous observons une coloration de la paroi des bronchioles.

Dans le rein (Figures 24 A et B, p.106), le foie (Figures 24, C et D), la rate (Figures 24, E et F), l’ œsophage (Figures 25, A et B, p.107) et l’estomac (Figures 25, C et D) nous retrouvons une coloration homogène des tissus. Les taches rouges observées à la Figure 24E sont des artéfacts. Aucune cellule de ces tissus exprime fortement la protéine FMR1. Cependant, nous ne pouvons exclure que cette coloration corresponde au bruit de fond de la réaction tel qu’observé dans le coeur (Figures 26, A et B, p.108) et le muscle (Figures 26, C et D) ou dans les contrôles négatifs (Figures 27, A à D, p.109).

Afin de cartographier les épitopes reconnus par nos anticorps, nous avons amplifié des portions du gène FMR1 à partir du vecteur pQE31/FMR1 en utilisant les paires d’amorces énumérées dans le tableau 2 (p. 78). Les produits PCR ont été clonés dans le vecteur pQE31 (Figure 9, p. 53) pour la production de peptides recombinants (tag hexa-histidine). Ce tag nous permettait d’observer si le peptide était produit par immunobuvardage avant de tester nos anticorps sur ces extraits. Les fragments utilisés pour la cartographie des épitopes sont schématisés à la figure 28, et les résultats des immunobuvardages sont présentés à la figure 29.

Figure 28: Représentation schématique des fragments utilisés pour la cartographie des épitopes.

Les boîtes avec les chiffres représentent les exons et les domaines fonctionnels pour lesquels ils codent sont représentés dessous. Les encadrés de couleur représentent les portions reconnues par les 22 anticorps monoclonaux vérifiés. Les flèches représentent les fragments peptidiques. Le poids moéculaire des fragments, en kDa, est inscrit entre parenthèses.

Figure 29: Résultats de la cartographie des épitopes par immunobuvardage.

Les différents fragments ont été séparés par SDS-PAGE 8%. A: Anticorps anti-hexa-histidine (dil 1:1000 avec du Blotto 5%). B: Surnageant 14D3 (dil. 1:2 avec du Blotto 10%). C: Surnageant 11F7 (dil. 1:2 avec du Blotto 10%). D: Surnageant 1C10 (dil. 1:2 avec du Blotto 5%). Fragments: 1: 3.5, 2: 31R1, 3: 10.8, 4: D1.6, 5: 13B. 5, 6: 14.1, 7: D4.5, 8: PB et 9: Vecteur pQE31 vide, (Voir la figure 28 pour la position des fragments).

Nous avons identifié 3 épitopes et les anticorps les reconnaissant sont énumérés dans le tableau 4. Il y a les anticorps comme 14D3 qui sont très spécifiques et qui reconnaissent un épitope localisé dans l’exon 14. Cependant, il y a un autre anticorps, 12B10, qui détecte un épitope dans l’exon 14 mais qui est nécessairement différent de celui reconnu par les anticorps tel 14D3 (Résultat identique à 14D3 (Figure 29 B). En effet, 12B10 détecte une protéine supplémentaire dans les lignées lymphobloastoïdes (Figure 15, p.93). La seconde catégorie, les anticorps tel 11F7 (la majorité), reconnaissent un épitope situé près ou à l’intérieur du domaine KH2. Finalement, il y a les anticorps comme 1C10 qui semblent reconnaître un épitope chevauchant la portion amino-terminale du tag et le début de la protéine (voir Figures 28 et 29) car ils reconnaissent peu la protéine endogène et pas du tout les fragments 3.5 et D1.6 mais détectent pourtant toutes les constructions comprenant le tag et le début de la protéine.

Tableau 4: Résultats de la cartographie des épitopes des 22 hybridomes.

Une fois les épitopes caractérisés, nous avons choisi deux anticorps dont les épitopes ne se chevauchaient pas afin de mettre au point un test de quantification de la protéine FMR1 par ELISA-sandwich. En utilisant le monoclonal 14D3 comme anticorps “capturant”, nous voulions nous assurer que seules les protéines FMR1 (contenant l’exon 14) seraient retenues dans les puits. Ensuite, nous avons utilisé l’anticorps 11F7 couplé à la biotine pour fermer le sandwich puis un conjugué streptavidine-HRP pour la détection et qui permet une amplification du signal.

Nous avons mis au point le test ELISA avec la protéine tronquée (purifiée) puisqu’elle sera utilisée pour la courbe standard. Après la mise au point des conditions, nous avons effectué une dizaine d’essais avec la protéine purifiée et nous obtenions une bonne reproductibilité. Le coefficient de régression linéaire (R2) a toujours été supérieur à 0.98 ce qui est suffisamment précis pour être utilisé comme outil de quantification. La Figure 30 est un exemple d’une courbe standard constituée de quatre expérimentations effectuées indépendamment. Le coefficient de régression linéraire est excellent (0.9878). Cependant, l’écart-type au niveau des ratios obtenus avec les quantités de protéines FMR1 de 4 et 8 ng est assez grand ce qui suggère que nous devrons peut-être restreindre la courbe à des quantités de protéines variant entre 250 pg et 2 ng par puit.

Nous avons débuté des essais préliminaires tout d’abord avec des homogénats de leucocytes extraits de sang puis à partir de lysat de cellules lymphoblastiques normales et X-fragile. Il semble qu’il y ait une reconnaissance non-spécifique dans ces lysats et un test par immunobuvardage a révélé qu’il y avait une protéine dans les homogénats de lymphoblastes (normal et X-fragile) qui lie la streptavidine et pourrait être responsable de ce signal parasite. Quelques essais ont été effectués pour éliminer ce signal parasite mais au moment du dépôt de cette thèse nous tentions toujours de régler ce problème.

Figure 30: Courbe standard pour la quantification de la protéine FMR1 tronquée par ELISA-sandwich.

La courbe standard a été construite à partir des résultats compilés dans les sections moyenne et écart-type du tableau 5. La forme tronquée de la protéine FMR1 a été utilisée.