4 DISCUSSION

Table des matières

Après la découverte du gène FMR1 en 1991, les recherches ont porté principalement sur les mécanismes mutationnels et sur la fonction de la protéine produite par le gène. Plusieurs croyaient que les secrets de cette maladie monogénique seraient mis à jour rapidement mais une décennie plus tard, la fonction exacte de la protéine FMR1 reste toujours un mystère. L’anticorps monoclonal 1C3 a été utilisé pour la majorité des études effectuées sur la protéine. En 1998, Khandjian et al ont montré que l’anticorps 1C3 détectait aussi la protéine homologue FXR1 dans les extraits de muscles squelettiques et soulevaient la possibilité que cette protéine contribuait au signal observé avec l’anticorps 1C3 dans d’autres extraits cellulaires (Khandjian et al. 1998). Lorsque ce projet de doctorat a débuté en 1999, aucun nouvel anticorps monoclonal n’était disponible. La compagnie Santa Cruz a mis en vente récemment un anticorps dirigé contre la protéine FMR1. Cependant, les résultats obtenus en immunobuvardage montrent que cet anticorps est moins spécifique que le monoclonal 1C3 (Tests effectués par l’équipe du Dr. Khandjian). L’équipe du Dr. Stephen T. Warren (Emory University, Atlanta) affirme depuis deux ans avoir en sa possession des anticorps monoclonaux spécifiques. Cependant, aucun résultat avec ces anticorps n’ont été publié jusqu’à maintenant.

La faible immunogénicité de la protéine ainsi que la forte homologie entre la séquence protéique murine et humaine sont possiblement à l’origine de la difficulté à produire de bons anticorps monoclonaux. C’est pourquoi nous avons entrepris d’utiliser la technologie du “phage display” pour contourner ce problème. La première étape du projet consistait donc à obtenir une forme purifiée de la protéine FMR1.

La production de la protéine FMR1 dans un système bactérien constituait le premier défi technique que nous avons rencontré. La principale raison est que la protéine semble être toxique lorsqu’elle est surexprimée dans les bactéries. Cette toxicité est peut-être causée par la capacité de liaison à l’ARNm et l’inhibition de la traduction qu’elle pourrait entrainer. C’est pourquoi la souche M15 d’ E.coli de Qiagen constitue un excellent système de production car il n’y a que très peu de fuite (Figure 11, puit 1, p.86). L’expression du gène est sous le contrôle du promoteur fort T5 mais l’expression est bloquée par la présence de deux opérons lac en amont du gène. Le répresseur lac I est produit de façon constitutive par le vecteur pREP4 déjà présent dans la souche M15. Seule l’induction à l’IPTG permet de lever cette inhibition. Plusieurs souches bactériennes ont été utilisées par notre équipe pour la production de la protéine FMR1 au cours des dernières années. Cependant, c’est uniquement avec ce système que nous avons réussi à produire des quantités de protéines dépassant le milligramme.

Le système ne nous a pas permis de purifier les protéines sous leur formes natives car les protéines produites se retrouvaient dans des corps d’inclusion. L’interaction entre les domaines hydrophobes lors du repliement pourrait jouer un rôle dans la formation de ces corps d’inclusion. Une autre explication est que des ponts disulfures inappropriés se sont formés lors du repliement et auraient pu entraîner la formation d’aggrégats et amener ainsi la création de corps d’inclusion. Cette hypothèse est plausible pour la protéine FMR1 puisque l’on retrouve 6 cystéines dans sa séquence protéique.

Lors de la production de la protéine, nous avons obtenu une forme mineure à 80 kDa et une forme majeure à 60 kDa. Le fait que l’anticorps 1C3 soit capable de reconnaître les deux formes était une première indication que le bout manquant se trouvait en C-terminal. Nous avons produit différents fragments pour la cartographie des épitopes et selon la grandeur des peptides exprimés, la portion manquante de la forme à 60 kDa incluerait les trois derniers exons (Figures 28 et 29). Croyant que la forme tronquée était produite par la dégradation protéolytique de la protéine de 80 kDa, nous avons abaissé la température d’incubation à 30oC espèrant ainsi réduire l’activité des protéases. Malheureusement, ceci ne fit que diminuer la quantité de protéine de 60 kDa sans augmenter la quantité de celle à 80 kDa. Nous avons aussi ajouté des mélanges d’inhibiteurs de protéases mais sans succès. Ces statégies ont fonctionné pour Laggerbauer et al (2001) qui ont effectué la production de la protéine à la température de la pièce (23 oC) en présence d’inhibiteurs de protéases mais ils ont utilisés la souche BL21 Gold cells (Stratagene).

Une explication alternative à la forme tronquée pourrait être l’utilisation des codons par certaines souches d’ Eschérichia coli . En effet, les codons arginine AGG et AGA sont les moins utilisés chez E. coli et les tRNAs les reconnaissant sont donc les moins abondants. Les codons AGG et AGA consécutifs peuvent entraîner l’arrêt de la traduction ou des changements de cadre de lecture (Rosenberg et al. 1993). Dans l’exon 15 de la protéine FMR1 se trouve une boîte RGG qui est composée d’arginine et de glycine. Parmi les codons utilisés dans la séquence codante de la boîte RGG, on retrouve trois codons AGA répartis sur 50 paires de base. Il est plausible que la présence de ces trois codons soit responsable de l’arrêt prématuré de la traduction dans la majorité des protéines. Cela expliquerait pourquoi seulement une faible proportion des protéines sont complètes. Il est possible que la souche BL21 possède les ARNt nécessaires pour traverser efficacement la région AGG/AGA riche ce qui expliquerait la réussite de Laggerbauer et al (2001). Il est aussi possible que le fait de ralentir la croissance en effectuant la culture à la température de la pièce est suffisant pour permettre aux rares ARNt d’atteindre la machinerie de traduction.

Les premiers essais de production de scFvs dirigés contre la protéine FMR1 se sont soldés par des échecs malgré l’enrichissement des phages élués après chaque tour de sélection. Nous avons tenté de vérifier la proportion de protéine restant accrochée dans le tube et celle-ci n’était même pas quantifiable. Deux peptides synthétiques dont les séquences sont uniques à la protéine FXR1 étaient disponibles dans le laboratoire du Dr. Khandjian. Nous avons donc décidé de les utiliser séparément pour effectuer des sélections avec la banque. Après quelques essais, nous avons réussi à sélectionner des scFvs que nous avons utilisés comme anticorps primaires en immunobuvardage sur des extraits de bactéries produisant la protéine FXR1. Le résultat était concluant, les scFvs produits reconnaissaient la protéine FXR1 comme le démontrait l’immunobuvardage effectué en parallèle avec l’anticorps #830 sur les mêmes extraits bactériens. Les scFvs semblaient cependant moins spécifiques que les anticorps puisque l’on pouvait apercevoir des bandes supplémentaires à celles correspondant à FXR1. Le signal obtenu était très faible, et l’attribuant à la faible quantité de scFvs, nous avons tenté d’en produire plus. Les conditions décrites dans le protocole n’ont pas permis de produire les scFvs solubles. La modification des conditions de culture et d’induction n’ont pas entrainé une augmentation de la production des fragments d’anticorps.

Malgré tout, nous avons décidé de tenter la sélection avec un peptide en faisant d’une longueur de 15 acides aminés provenant de la portion C-terminale de la protéine FMR1. Tout d’abord, nous avons ciblé les séquences protéiques possèdant peu d’homologie avec les protéines FXR1 et FXR2 ainsi qu’avec les séquences protéiques dans les banques de données informatique afin d’éviter toute réaction croisée. Ensuite, nous avons sélectionné la séquence protéique présentant la plus forte hydrophilicité augmentant ainsi les chances que l’épitope se trouve en surface de la structure adoptée par la protéine dans la cellule. Ce peptide est constitué des acides aminés 555 à 570 (DHSRTDNRPRNPREA). Encore une fois, après plusieurs essais et de multiples sélections avec le peptide, nous avons réussi à obtenir des scFvs dirigés contre la protéine FMR1 recombinante de 60 kDa. Cependant, les scFvs ne reconnaissaient ni la protéine endogène dans les cellules HeLa, ni la forme recombinante dans les extraits bactériens, mais uniquement la protéine purifiée. Les scFvs n’ont toutefois pas détecté la BSA présente en quantité similaire à la protéine FMR1. Comme précédemment, le signal était très faible comparé à ce qui est normalement obtenu avec les anticorps: 20 minutes d’exposition alors que moins de 5 secondes sont suffisant avec 1C3. Encore une fois, il semble que la faible production de scFvs était en cause. A ce moment nous avons investi beaucoup de temps pour tenter de mettre au point des conditions permettant de produire les scFvs en quantité suffisante mais aucun de nos essais n’ont permis d’augmenter de façon détectable la production de scFvs.

Au lieu d’utiliser les scFvs comme anticorps primaire, nous avons décidé d’essayer directement les phages obtenus à la suite d’un cinquième tour de sélection. Le signal obtenu était aussi très faible. Par Dot-blot, nous avons vérifié la proportion de phage exprimant les scFvs à leur surface pour nous rendre compte qu’elle ne dépassait pas 10 %. D’ailleurs, il a été rapporté que seulement 1 à 10 % des phages exprimaient les fragments d’anticorps lorsque la banque est construite avec un promoteur faible (Lowman et al. 1991). Nous avons entrepris des démarches auprès du Dr. Peter Model (Rakonjac et al. 1997) afin d’obtenir un phage auxiliaire dont la protéine g3p est délétée. Son utilisation pour la co-infection nous aurait assuré que tous les phages produits exprimeraient des scFvs à leur surface. Malgré un premier contact avec le Dr. Model, les tentatives subséquentes pour obtenir les phages sont restées vaines. Nous avons contacté deux autres équipes ayant utilisé la banque Griffin.1, et chacune est restée bloquée à l’étape de la production des fragments d’anticorps solubles. Récemment, une des équipes tentait de contourner le problème de production en sélectionnant les phages produisant les scFvs d’intérêt pour ensuite recloner les fragments variables dans un vecteur pET.

Plusieurs fois nous avons tenté de contacter le Dr. Winter et son équipe pour obtenir de l’aide mais sans succès. Après 15 mois de travail sur ce projet, nous sommes venu à la conclusion que nous devions concentrer nos efforts sur la production de nouveaux hybridomes et nous avons contacté le Dr. John Wilkins (CGDN immunoprobe core facility, Université du Manitoba) pour l’immunisation des souris. A notre grand étonnement, l’équipe du Dr. Wilkins travaillait aussi avec la banque Griffin.1 et leur essais sont aussi restés vains quand venait le moment de faire sécréter les scFvs. L’isolement de ces derniers à partir du périplasme foncionnait mais les fragments d’anticorps obtenus possèdaient une faible affinité pour les antigènes utilisés lors des sélections. En attendant l’arrivée des hybridomes nous avons continué les essais de production sans toutefois obtenir de résultats encourageants.

Finalement, au cours d’une discussion informelle avec un participant au congrès du Réseau Canadien sur les Maladies Génétiques (CGDN) de 2002, j’appris que la banque Griffin.1 lui avait aussi causé des problèmes alors qu’il travaillait en Europe. Le directeur de recherche s’est résolu à envoyer une étudiante pour parfaire la technique dans les laboratoires du Dr. Winter. Étonnament (ou non), le protocole avec lequel l’étudiante revint était complètement différent de celui publié sur le site internet auquel ils font référence lorsque l’on demande la banque. De plus, lorsque je pris connaissance de l’existence de la banque via l’internet, les auteurs mentionnaient que des protocoles seraient bientôt disponibles sur le site pour l’utilisation des scFvs. Trois ans plus tard ces protocoles ne sont toujours pas disponibles. Seulement une équipe a publié des résultats en utilisant la banque Griffin.1 et encore une fois on retrouve certaines différences lorsque l’on compare les protocoles. (De Lorenzo et al. 2002).

Tout d’abord, ils ont effectué les sélections directement sur des cellules présentant à sa surface un haut niveau de la protéine contre laquelle ils voulaient obtenir les fragments d’aticorps.

Tout comme nous, ils n’ont pas réussi à faire sécréter les scFvs alors ils les ont purifié directement à partir d’extraits de périplasmes en utilisant des colones Ni-NTA. Toutefois, ils ne mentionnet pas le rendement de la production des fragments d’anticorps.

Finalement, la souche E. coli utilisée pour la production (SF110, Meerman and Geourgiou (1994)) n’est pas celle qui était fournie avec la banque. C’est une souche dont les loci affectant la stabilité des protéines sécrétées ont été délétées du génome de la bactéries. Dans le cas de la production de scFv, cela à probablement eu pour effet d’augementer la production de façon remarquable.

En somme, la technique du phage display est pleine d’avenir mais son utilisation nécessite une connaissance que seule l’expérience peut apporter. La banque Griffin.1 n’est pas encore suffisamment au point pour permettre aux novices de l’utiliser sans le soutien d’une personne maîtrisant les différents paramètres nécessaires à son bon fonctionnement. Malgré tout, cette technique présente des aspects intéressants et son utilisation pour la sélection de plusieurs types de molécules tels des récepteurs nucléaires ou des peptides substrats fonctionne très bien. Ce n’est probablement qu’une question de temps avant que la technique soit optimisée pour la sélection de fragments dérivés d’anticorps.

À la suite de l’utilisation du “phage display”, nous avons fait injecter 4 souris avec la protéine recombinante purifiée dans l’espoir d’obtenir des anticorps monoclonaux. Une seule souris à produit des anti-FMR1 et elle fut sacrifiée pour la préparation des hybridomes. Parmi les 23 clones obtenus, nous avons détecté 4 types d’anticorps différents (Figure 15, p.93) dont un très intéressant, le monoclonal 14D3. Nous l’avons mentionné précédemment, l’anticorps le plus utilisé pour les études sur la protéine FMR1 est le monoclonal 1C3 mais tel que démontré avec les extraits de muscles de souris normales et les tissus de souris knock-out, il reconnaît les différentes formes de la protéine FXR1. Cette réaction croisée serait due au fait que l’anticorps 1C3 reconnaît un épitope dans la portion N-terminale de la protéine qui est bien conservée dans les homologues. Au contraire, le monoclonal 14D3 reconnaît un épitope se situant dans l’exon 14, une portion beaucoup moins conservé de la protéine FMR1, ce qui pourrait expliquer la meilleure spécificité de notre anticorps.

Un anticorps ne produisant pas de réaction croisée est attrayant puisqu’il peut être utilisé pour l’étude de la protéine FMR1 dans des tissus exprimant fortement les homologues. De plus, les études précédentes démontrent que la protéine FMR1 n’est pas exprimée dans les muscles et le coeur. Or, 1C3 y détecte les superformes de FXR1 ce qui peut masquer la détection de la protéine FMR1. Sur certains immunobuvardages effectués avec 14D3 pour la vérification de la spécificité nous avons observé des bandes correspondant à deux isoformes de FMR1. Les bandes observées étaient de poids moléculaires inférieurs aux superformes de FXR1 normalement retrouvées dans les muscles (Khandjian et al. 1995). Croyant que la protéine pouvait provenir du sang resté dans les extraits de muscles, nous avons effectué une autre préparation de muscles squelettiques mais les bandes étaient parfois visibles après surexposition mais pas toujours. Ces bandes n’apparaissent pas sur l’immunobuvardage effectué pour vérifier la présence de la protéine FMR1 dans les tissus (Figure 17, p.96) ni sur celui servant à vérifier la spécificité de l’anticorps 14D3 (Figure 16, p.95). Évidemment, lorsque nous surexposons le film nous pouvons voir quelques bandes non-spécifiques mais nous pouvons les éliminer en diminuant la quantité d’anticorps sans vraiment affecter le signal des protéines FMR1.

Par immunofluorescence avec l’anticorps 1C3, le patron de distribution de la protéine FMR1 apparaît homogène dans toute la cellule alors qu’avec 14D3, nous observons une localisation périnucléaire dans la plupart des cellules. Cette différence pourrait résulter de la réaction croisée entre 1C3 et les protéines FXR1. Ceci pourrait signifier qu’une partie des protéines FXR1 ne sont pas dans le même complexe que FMR1. D’un autre côté, nous pouvons émettre l’hypothèse que les protéines qui ne sont pas périnucléaires sont celles dont l’exon 14 a été épissé. Mais cela ne serait pas compatible avec le fait que les protéines ayant perdu leur NES devraient se retrouver dans le noyau.

Khandjian et al ont montré que la protéine FMR1 se trouvait dans les mRNPs associées aux polysomes et non pas libre dans la cellule ou associée aux ribosomes seuls (Corbin et al 1997). Selon les résultats obtenus avec notre anticorps, la protéine FMR1 semble située au niveau du réticulum endoplasmique, probablement dans les structures associées aux ribosomes en traduction active (Réticulum endoplasmique rugueux).

Une différence est aussi observée dans les études immunohistochimiques que nous avons effectuées sur des coupes de testicules de souris. Les études d’expression d’ARNm ont montré que le gène FMR1 est exprimé uniquement dans les spermatogonies à la périphérie des tubules séminifères. On peut retrouver dans la littérature des immunohistochimies effectuées avec l’anticorps 1C3 montrant la protéine dans ces spermatogonies. Toutefois, en aucun cas nous avons obtenu ce type de résultat avec l’anticorps 1C3. A chacun des essais, l’anticorps réagissait avec les protéines FXR1 dans les cellules au centre des tubules et un peu moins fortement avec les spermatogonies. La présence de FXR1 au centre des tubules a été confirmée par l’utilisation de l’anticorps 3FX pour lequel nous avons utilisé le même protocole qu’avec 1C3. Ces conditions sont aussi celles que nous avons utilisé avec le monoclonal 14D3 et pourtant nous détectons la protéine FMR1 uniquement dans le cytoplasme des spermatogonies. Une autre preuve éloquente de la spécificité de notre anticorps.

Nous avons tenté l’immunohistochimie sur des coupes de tissus musculaires et de coeur et la faible coloration observée semble être due au bruit de fond plus qu’à une détection de la protéine FMR1 puisque la protéine n’est pas observée dans ces tissus par immunobuvardage. Dans tous les autres tissus testés (estomac, intestin, côlon, rate, rein, foie et œsophage), nous avons observé une coloration homogène légèrement plus forte que celle des tissus musculaires. Est-ce que la coloration réflète le niveau basal d’expression observé en immunobuvardage dans les tissus autres que musculaire? Il est difficile de l’affirmer avec certitude. L’immunohistochimie est une technique moins sensible que l’immunobuvardage pour la détection d’un niveau de production protéique basal. Il est donc possible que l’immunohistochimie ne permette pas la détection de la protéine dans certains tissus et que le signal observé corresponde au bruit de fond.

La présence d’une forte expression de la protéine FMR1 dans les cellules Goblets dans les poumons, l’intestin et le côlon nous a d’abord intrigué. Nous aurions attribuée cette expression au fait que ces cellules produisent un mucus qui pourraient avoir entraîné l’adhésion des anticorps s’il n’avait pas été mentionné précédemment que les cellules de l’épithélium simple cylindrique de l’intestin (comprenant les cellules Goblets et les cellules responsables de l’absorption) exprimaient l’ARNm de FMR1 (Hinds et al. 1993).

Les cellules Goblets sont les cellules qui sécrètent le mucus qui protège et lubrifie l’intérieur du tractus intestinal. Ces sécrétions sont composées de sels inorganiques et de polymères de protéines nommées mucines. Le mucus est sécrété continuellement mais sa production augmente rapidement suite à certain stimulus. Puisque la protéine FMR1 fait partie intégrante de la machinerie de traduction, il est plausible que la production constitutive ou massive de mucus implique la présence de la protéine FMR1. On peut émettre l’hypothèse que la protéine FMR1 soit nécessaire lors de la production de base des mucines. Cependant, il est aussi envisageable que les protéines FMR1 servent à inhiber la traduction des ARNm codant pour les mucines. Elles servent ainsi de séquestrateurs d’ARNm en attendant leur traduction suite à certains stimulus tel l’attaque par des agents pathogènes. Ces hypothèses pourraient être vérifiées, par exemple, en utilisant des colonnes composées d’ADNc de la mucine afin de voir si la protéine FMR1 est associée, d’une manière ou d’une autre, à l’ARNm de la mucine.

Tel que mentionné précédemment, la cartographie des épitopes a révélé que l’anticorps 14D3 et ses semblables reconnaissent une région se situant à l’intérieur de l’exon 14. Ces anticorps présentent le patron de détection le plus spécifique puisque seules les protéines FMR1 sont reconnues. En fait, seule l’isoforme dont l’exon 14 est épissé ne peut être reconnue par ces anticorps. Ceci revêt une certaine importance car l’épissage de l’exon 14 résulte en la localisation nucléaire de la protéine et une affinité pour l’ARN qui est modifiée, ce qui pourrait impliquer un rôle différent pour cette isoforme.

Des gels préparatifs nous ont permis de séparer les différentes isoformes à un point tel que nous détections 7 bandes par immunobuvardage au lieu des 6 précédemment publiées. Le doublet observé à 80 kDa est en fait un triplet et ceci est appuyé par le gel en deux dimensions effectués par Khandjian et al (1995) qui a détecté 10 isoformes distinctes. La comparaison des immunobuvardages effectués avec les anticorps 1C3 et 14D3 sur des extraits de lignées lymphoblastiques suggère que la forme sans l’exon 14 est soit très peu ou pas exprimée dans la lignée utilisée. Il est possible que cette isoforme, bien qu’exprimée de façon quasi-ubiquiste au niveau de l’ARNm, ne soit traduite que dans certains tissus.

L’anticorps 12B10 fait cavalier seul dans sa catégorie. Il reconnaît un épitope dans l’exon 14 mais nos données suggèrent que ce n’est pas le même que les anticorps tels 14D3. En effet, en immunobuvardage, 12B10 reconnaît une protéine supplémentaire dans les lignées lymphoblastiques en plus de reconnaître les différentes isoformes de la protéine FMR1 (Figure 15, p.93). Cet anticorps présente une meilleure spécificité que 11F7 mais la proximité de son épitope par rapport à celui de 14D3 écarte son utilisation en ELISA-sandwich.

L’anticorps 11F7 et ses semblables détectent un épitope dans le domaine KH2 ou en N-terminal de ce dernier. Les domaines KH sont très conservés et cela pourrait expliquer pourquoi ces anticorps présentent tant de réactions croisées (7-8 protéines reconnues de façon non-spécifiques). Le monoclonal 11F7 peut être purifié par colonne de protéine–L ce qui a permis de le coupler par la suite à la biotine (et éventuellement à un autre marqueur). Puisque son épitope est suffisament éloigné de celui de 14D3, nous pouvons utiliser ces deux anticorps simultanément pour détecter la protéine FMR1 dans le contexte d’un ELISA-sandwich.

Les anticorps tels 1C10, ne reconnaissent pas ou peu la protéine FMR1 endogène, ce qui limite leur utilité. Cependant, puisque l’anticorps reconnaît la jonction entre FMR1 et le tag histidine, il pourrait servir à détecter la protéine recombinante dans un contexte cellulaire tout en évitant un réaction croisée avec la protéine endogène. Il agit comme le ferait un anticorps dirigé directement contre le tag.

Finalement, nous avons caractérisé l’épitope de l’anticorps 1C3 comme contrôle et nous avons restreint la région de reconnaissance aux 60 premiers acides aminés. Cet anticorps pourrait aussi constituer un excellent candidat potentiel comme anticorps secondaire dans un ELISA-sandwich. Nous avons tenté de le purifier sur colonne de protéine-L mais nous n’avons pas obtenu un bon enrichissement malgré le fait qu’il soit composé d’une chaîne légère kappa. Cependant, il est mentionné dans le feuillet de la compagnie Actigen que la protéine-L lie moins fortement la chaîne κ V et pas du tout la chaîne κ II. L’anticorps 1C3 pourrait bien être constitué de l’une de ces deux chaînes, logiquement de la chaîne V puisqu’une petite partie des anticorps s’accroche à la colonne de protéine-L.

Le principe de l’ELISA-sandwich consite à capturer un antigène entre deux anticorps pour le quantifier. Afin d’éviter toute interférence et obtenir la mesure la plus précise possible, l’un des deux anticorps doit être parfaitement spécifique. Lors de l’ELISA, une courbe standard est effectuée avec l’antigène purifié de façon concomitante permettant de quantifier l’antigène dans l’inconnu.

Le syndrome X-fragile est actuellement diagnostiqué par buvardage Southern, une technique longue et onéreuse. Des techniques se basant sur la détection de la protéine ont été mises au point au cours des dernières années et un laboratoire dans les Pays-Bas les utilise présentement pour le diagnostic du syndrome X-fragile (Eramus Laboratory: www.eur.nl/fgg/ch1/fragx/). Selon les données recueillies, la quantification de la protéine FMR1 pourrait être une excellente méthode diagnostique pour la maladie.

Le problème avec les tests de détection présentement utilisés, c’est qu’ils sont qualitatifs ou semi-quantitatifs. Or, les femmes atteintes du syndrome X-fragile produisent une certaine quantité de protéine FMR1 tout comme les hommes mosaïques (de taille ou de méthylation). Leur taux de production est probablement inférieur à celui des personnes normales mais les test de dépistage publiés récemment ne font pas la distinction entre certaines femmes X-fragile et les normales. Ces tests ne permettaient pas non plus de diagnostiquer avec certitude les mâles mosaïques.

De récentes études mentionnent que les porteurs(euses) de prémutations auraient une expression réduite de la protéine (Tassone et al. 2000a; Tassone et al. 2000b). Ainsi, un test de dépistage quantitatif aurait l’avantage de pouvoir détecter les hommes et les femmes atteints du syndrome en plus, dans certains cas, de permettre le dépistage de porteurs de prémutation. La confirmation de ces porteurs pourrait ensuite s’effectuer par PCR.

La cartographie des épitopes reconnus et l’obtention d’anticorps purifiés couplés à la biotine a été fastidieuse ce qui fait que les premiers tests de quantification de la protéine n’ont débuté que tout récemment. Puisqu’une courbe standard était nécessaire à la réalisation du projet, nous avons débuté nos essais avec la protéine purifiée. Une fois les conditions mises au point, nous avons obtenu des courbes standards suffisamment précises (R2> 0.98) pour être utilisées dans la quantification de la protéine FMR1 dans des extraits de leucocytes Figure 30, p.115). Le test permet de détecter la protéine purifiée à des quantités aussi infime que 250 pg (7.5 fmol) par puit.

Nous avons extrait les leucocytes d’un prélèvement de sang puis mesuré leur nombre à l’aide d’un compteur de cellules (Coulter). En comparant l’intensité obtenue par immunobuvardage sur des extraits de leucocytes et la protéine purifiée, nous avons évalué la quantité de protéines FMR1 à 5.6 pg par cellule. À raison de 26 millions de leucocytes dans 20 mL de sang, il ne faudrait qu’un peu de sang pour détecter la protéine FMR1 chez une personne normale. La sensibilité du test serait peut-être suffisante pour détecter les variations entre les individus normaux et les personnes atteintes ou mosaïques.

Un des problèmes rencontrés dans la mise au point de ce système de détection est que nos anticorps ne reconnaissent que la forme dénaturée de la protéine FMR1. Il nous faut donc utiliser des tampons de lyse fortement dénaturants pour dissocier le complexe dans lequel se retrouve la protéine et pour dénaturer la protéine complètement. Nous avons utilisé divers agents dénaturants, dont le DTT et le déoxycholate, qui ne convenaient pas. Ils ont été utilisés à des doses aussi faibles que 10 mM et 1 % respectivement mais leur pouvoir dénaturant affectait les anticorps fixés au puit. Le SDS et l’urée peuvent être utilisés jusqu’à des concentration de 1 % et 8 % respectivement.

Nous avons donc débuté des tests préliminaires sur des extraits de leucocytes fraichement extraits de sang ainsi qu’avec des extraits de lignées cellulaires normale (875 A) et X-fragile (GM 09145). Cependant, les tests sont présentement bloqués à ce stade car il semble que nous ayons une réaction non-spécifique entre le conjugué streptavidine-HRP et une protéine de l’extrait cellulaire. Nous avons confirmé cette réaction par immunobuvardage effectué sur les extraits cellulaires mentionnés ci-dessus. En utilisant uniquement la streptavidine-HRP comme moyen de détection, nous avons observé une bande.(Résultats non montré) Ceci démontre bien qu’une protéine cellulaire, dans sa forme dénaturée, est en mesure de lier la streptavidine ou la peroxydase. Nous étudions présentement la possibilité de passer le lysat sur des colonnes de streptavidine afin de vérifier si le signal parasite sera éliminé. Une alternative serait d’ajouter une solution de streptavidine dans le puit aprés l’ajout du lysat de cellules afin de bloquer les sites liant la streptavidine.

Les données de la littérature soulèvent la possibilité que les protéines de la famille FMR/FXR se retrouvent dans les mêmes complexes ribonucléoprotéiques. Cependant, leur association n’est pas toujours nécessaire à leur fonction puisque dans certains types cellulaires tels les muscles on ne retrouve qu’une des trois protéines. Il est probable que ces protéines ne soient pas toujours dans les mêmes structures et des études de co-localisation avec 14D3 permettraient de résoudre la question. Ces études pourraient être menées avec l’anticorps 1C3 mais la réaction croisée avec la protéine FXR1 pourrait mener à la conclusion que la protéine FXR1 co-localise toujours avec FMR1. Les résultats que nous avons obtenus en immunofluorescence avec 1C3 et 14D3 sur les cellules HeLa étant légèrement différents, cela suggère que la réaction croisée est peut-être observable en immunofluorescence.

Il serait donc intéressant de faire des études de co-localisation avec l’anticorps 14D3 et les anticorps polyclonaux #830 afin de voir si les protéines FMR1 et FXR1 se situent dans les mêmes structures dans la cellule. D’un autre côté, nous pourrions effectuer des études d’expression différentielle sur plusieurs types cellulaires avec les anticorps 14D3 et α1076 (ou α734: anticorps polyclonaux, voir Figure 3, p.33). L’absence du signal de 14D3 suggèrerait que la forme sans l’exon 14 est présente dans ces cellules.

Des tests avec la leptomycine B, une drogue qui bloquerait l’exportation de la protéine FMR1 vers le noyau, pourrait aussi permettre de démontrer si les isoformes restant prises dans le noyau sont réellement celles dont l’exon 14 est épissé ou si même celles possèdant le NES peuvent réintégrer le noyau.

Une autre façon de déterminer si l’isoforme sans l’exon 14 est traduite serait d’effectuer une série de gels en 2 dimensions sur différents tissus et de faire des immunobuvardages avec les anticorps 1C3 et 14D3. En comparant les deux immunobuvardages, il serait possible d’identifier la forme sans l’exon 14 puisque le signal serait absent de l’immunobuvardage effectué avec l’anticorps 14D3.

Les anticorps obtenus ne sont pas tous spécifiques ce qui signifie que certaines protéines partagent des séquences communes avec la protéine FMR1. Dans le cas de l’anticorps 12B10, une autre protéine de poids moléculaire supérieur à 80 kDa est détectée. Puisque 12B10 reconnaît un épitope dans l’exon 14, il serait intéressant de purifier et séquencer cette protéine afin de vérifier si elle partage d’autres séquences avec la protéine FMR1. Cet exercice pourrait aussi être appliqué aux autres protéines reconnues par l’anticorps 11F7. Parmi celles-ci se retrouvent très certainement les protéines homologues FXR1 et FXR2 puisque la région comprenant l’épitope de 11F7 est très conservée chez ces protéines surtout dans le domaine KH ou le taux d’homologie atteint plus de 80 %. Il est possible que les autres protéines reconnues possèdent elles aussi un domaine KH.

Dans les perspectives au niveau du test de quantification de la protéine FMR1, nous espérons pouvoir mettre au point le test sur les extraits de lignées cellulaires (normale et X-fragile) et sur les leucocytes purifiés d’ici la fin du printemps 2003. Cette étape franchie, il ne resterait qu’à valider le test sur les leucocytes extraits du sang de personnes normales et X-fragiles.

Dans la mesure ou le test serait suffisamment sensible, il serait finalement possible de répondre à la question portant sur le taux de production de la protéine par les hommes porteurs d’une prémutation. Il serait aussi possible de vérifier la corrélation entre le taux de production de la protéine et la sévérité du phénotype observé et principalement le degré de retard mental.