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Le syndrome X-fragile, la première cause de retard mental héréditaire, est causé dans la majorité des cas par l’expansion d’une séquence répétée située dans la région 5’ non-traduite du gène FMR1 . Cette expansion entraîne l’inactivation du gène et l’absence des protéines FMR1 (6 isoformes) est directement responsable des phénotypes observés chez les patients. L’anticorps monoclonal 1C3, disponible depuis près d’une décennie, a permis l’étude de la protéine sous tous ses aspects ou presque. Cependant, il a été montré récemment que cet anticorps détecte aussi la protéine homologue FXR1. La contribution de cette réaction croisée au signal observé n’a pas été quantifiée mais représente probablement une proportion faible mais non négligeable selon la technique utilisée.

Nous avons utilisé deux techniques en parallèle pour obtenir de nouveaux anticorps. Tout d’abord, nous avons tenté la sélection de fragments d’anticorps par la technologie du “phage display”. Nous avons aussi entrepris la création de nouveaux hybridomes en injectant la protéine FMR1 purifiée à des souris Balb/C. Nous avons obtenu 23 lignées d’hybridomes parmi lesquelles 4 types d’anticorps différents ont été identifiés. La caractérisation de ces anticorps a débuté par l’identification de leur classe d’IgG et la chaîne lègère utilisée. Nous avons aussi vérifié leur spécificité et identifié l’épitope reconnu. L’anticorps produit par l’hybridome 14D3 est ressorti comme étant le plus intéressant compte tenu de sa spécificité et de la possibilité de le purifier. Nous avons évalué son efficacité en immunobuvardage, en immunofluorescence, en immunohistochimie, en ELISA et en immunoprécipitation. L’anticorps 14D3 s’est avéré un excellent anticorps pour toutes ces techniques à l’exception de l’immunoprécipitation. Certains de nos résultats diffèrent des travaux effectués avec l’anticorps 1C3. Cette différence est peut-être attribuable à la différence de spécificité des anticorps ou au fait que l’épitope reconnu par notre anticorps peut être absent de certaines isoformes. Nous avons aussi utilisé les anticorps 14D3 et 11F7 pour préparer un test de dosage par ELISA-sandwich. L’ELISA a été mis au point sur la protéine purifiée. Les tests effectués sont reproductibles et la précision de la courbe standard est excellente (R2 > 0.98).

Je voudrais tout d’abord remercier le Dr François Rousseau de m’avoir permis de réaliser ce projet au sein de son équipe, pour la grande latitude qu’il m’a laissée quant aux directions prises au cours de mes recherches et à l’optimisme qu’il a conservé pour nous deux malgré les nombreuses incertitudes.

J’aimerais exprimer ma gratitude à Mme Dominique Heitz pour l’aide et le support qu’elle m’a apportés au cours de ces années et la rigueur scientifique qu’elle a su m’inculquer. Je voudrais aussi la remercier sincèrement pour l’aide qu’elle a apportée à la rédaction de cette thèse.

Merci à M. Richard Réhel pour bien des services dont la liste serait trop longue pour paraître dans cette page.

J’aimerais remercier le Dr John Wilkins de l’Université du Manitoba et particulièrement son assistante Mme Patricia Jean Sauder pour la création des hybridomes et une coopération hors du commun.

Merci à M. Jean-Sébastien Côté pour les nombreuses immunohistochimies, la préparation d’extraits de tissus, et conséquemment toutes les souris euthanasiées au profit de la science.

Merci au Dr. Edouard W. Khandjian et à Mme Sandra Tremblay e surnageant 1t généreusement fournies.

Merci à M. Marc Bronsard pour son aide lors des nombreuses utilisations du microscope ainsi que pour la saisie des images.

Merci à toutes les personnes de l’Unité de Recherche en Génétique Humaine et Moléculaire qui ont fait de ce doctorat une partie de plaisir plutôt qu’une corvée. Comme quoi il est possible de faire de la recherche sans toujours se prendre au sérieux.

Finalement, je voudrais remercier le Fonds FCAR et le Dr. François Rousseau pour le soutien financier de ce doctorat.

a.a. : acides aminés

A : Alanine

D : Acide aspartique

E : Acide glutamique

G : Glycine

H : Histidine

I : Isoleucine

N : Asparagine

P : Proline

R : Arginine

S : Sérine

T : Thréonine

Bases de l’ADN:

A : Adénine

C : Cytosine

G : Guanine

T : Thymidine

N : N’importe quel nucléotide

ADN : Acide déoxyribonucléique

ADNc : ADN complémentaire

Amp : Ampicilline

ARN : Acide ribonucléique

ARNm : ARN messager

BrEt : Bromure d’éthidium

BSA : Albumine de sérum bovin

CDR : Région hypervariable (Complementary determining region)

CGDN : Réseau canadien sur les maladies génétiques

D.O. : Densité optique

DMEM : Milieu Eagle modifié de Dulbeco

DNTP : Déoxynucléotide triphosphate

EDTA : Acide éthylènediamine tétraacétique

ELISA : Immunoessais enzymatique (Enzyme Linked ImmunoSorbent Assay)

Fab : Fragment d’anticorps

Fc : Fragment constant

FITC : Isothiocyanate de fluorescéine

FMR1 : Fragile X Mental Retardation 1

Fv : Fragment variable

FXR1 : Fragile X Related 1

FXR2 : Fragile X Related 2

GAM : Anticorps anti-souris de chèvre (goat anti-mouse)

HBSS: Solution saline balancée de Hank

HCl : Acide chloridrique

IPTG : Isopropylthiogalactoside

K-0 : Knock-out

Kan : Kanamycine

KH : K Homology

LB : Milieu de culture Luria

MAb : Anticorps monoclonal

MCS : Site de clonage multiple

MNT : Mâles normaux transmetteurs

mRNP: Ribonucléoprotéine messagère

NaCl : Chlorure de sodium

NES : Signal d’exportation nucléaire (Nuclear Export Signal)

Ni : Nickel

NLS : Signal de localisation nucléaire (Nuclear Localisation Signal)

NTA : Acide nitrilotriacetique

p : Bras court du chromosome

p.c. : Post-conception

PAGE : Électrophorèse sur gel de polyacrylamide

pb : Paire de bases

PBS : Tampon phosphate salin

PCR : Réaction de polymérisation en chaîne (Polymerase Chain Reaction)

PEG : Polyéthylène glycol

PMSF: Phenyl Methyl Sulfonyl Fluoride

PSA : Persulfate d’ammonium

q : Bras long du chromosome

RBS : Site d’attachement des ribosomes

RMGA:Réseau sur les Maladies Génétiques Appliquées

RMN : Résonnace magnétique nucléaire

RNAse:Ribonucléase

RNP : Ribonuléoprotéine

RPM : Rotation par minute

RT : Transcripase inverse (reverse transcriptase)

SAM : Anticorps anti-souris de brebis (sheep anti-mouse )

ScFv: : Fragment variable sur une seule chaine (single-chain fragment variable)

SDS : Sodium dodécyl sulfate

SNC : Système nerveux central

TAE : Tampon de migration Tris-acide acétique-EDTA

TMB : Tetraméthyl benzidine

U : Uracile

UV : Ultra-violet

VH : Chaîne lourde

VL : Chaîne légère

CC : Centimètre cube = 1 millilitre

g : Constante gravitationnelle = 9.8 m/s2

S : Coefficient de sédimentation

oC : Degré Celcius

C2C4 : Lignée myoblastique de muscles murins

COS : Lignée de cellules de rein simiesque (Singe vert d’Afrique)

HeLa : Adénocarcinome humain

875 A : Lignée lymphoblastique humaine normale (Banque du RMGA)

GM 09145 : Lignée lymphoblastique humaine X-fragile (Coriell Cell Repository)

Sp2/O : Myélome de souris (non-sécréteur)

TG1 :(K12, del(lac-pro), supE, thi, hsdD5 /F' traD36, proA+B+, lacIq, lacZdelM15 )

HB2151 :(K12, ara, del(lac-pro), thi /F' proA+B+, lacIq, lacZdelM15 )

M15 :(K12, Nals, Strs, Rifs, Thi-, Lac-, Ara+, Gal+, Mtl-, F-, RecA+, Uvr+, Lon+)

XL1Blue :(F’::Tn10 proA+B+lacIq Δ(lacZ) M15/recA1, endA1, gyrA96, (Nalr) thi hsdR17 (rk-mk+)gln V44 relA1 lac )