1 INTRODUCTION

Table des matières

De façon à replacer la protéine PARL dans un contexte biologique plus large, la première partie de ce chapitre est consacrée à une revue de littérature synthétisant l‘état actuel des recherches portant sur la protéolyse intramembranaire régulée (RIP). Ce paradigme émergent en matière de transduction du signal qu’est la RIP sera ensuite abordé à travers l’exemple des trois grandes familles de RIP-protéases caractérisées jusqu’à aujourd’hui. La quatrième partie développe plus particulièrement l’implication de la RIP dans la voie de signalisation des récepteurs aux EGF (Epidermic Growth Factor) chez les Vertébrés et chez Drosophila melanogaster. Cette partie décrit la famille de RIP-protéases Rhomboid caractérisée chez la Drosophile, à laquelle PARL est liée évolutivement. La cinquième partie insiste sur les caractéristiques de PARL, un homologue de Rhomboid chez les Vertébrés, auquel j’ai consacré l’ensemble de mes travaux de doctorat. Enfin, la sixième et dernière partie aborde les objectifs de recherche et la méthodologie utilisée pour caractériser la protéine PARL.

Les protéases ou peptidases, c’est-à-dire les enzymes assurant l’hydrolyse d’autres protéines jouent un rôle critique dans de nombreux processus cellulaires. Par exemple, la dégradation régulée des cyclines à des moments précis de la division cellulaire est essentielle pour la progression du cycle cellulaire (King et al. , 1996). Durant l’apoptose, la cascade protéolytique de la famille des Caspases assure des fonctions clés dans l’activation de la machinerie apoptotique accompagnant le clivage de substrats cellulaires spécifiques (Cryns et Yuan, 1998). Il existe quatre grandes classes de protéases classifiées suivant le résidu d’acide aminé qui assure l’hydrolyse de la liaison peptidique : les sérine/thréonine-protéases, les cystéine-protéases, les métalloprotéases et enfin les aspartyl-protéases. Au sein de ces quatre classes figurent de nombreux exemples de protéases solubles ainsi que de protéases membranaires dont le site actif est situé dans les compartiments aqueux de la cellule. Pendant de nombreuses années, il a été couramment accepté que la bicouche lipidique très hydrophobe de la membrane constitue un environnement hautement défavorable pour qu’une enzyme puisse y assurer l’hydrolyse d’une liaison peptidique (Wolfe et Selkoe, 2002). Cependant, des développements récents dans ce domaine montrent que plusieurs familles d’enzymes hydrolytiques présentent la particularité biologique d’assurer le clivage de leur substrat à l’intérieur de la membrane. Cette forme très particulière de protéolyse a été baptisée Protéolyse Intramembranaire Régulée (RIP ou Regulated Intramembrane Proteolysis ) et est assurée par les RIP-protéases (Brown et al. , 2000).

Les RIP-protéases sont des protéines membranaires : certaines possèdent même de multiples segments transmembranaires et traversent ainsi la membrane à plusieurs reprises. Leurs substrats sont également des protéines transmembranaires synthétisées initialement à l’état de précurseurs inactifs (Figure 1-1). La protéolyse du substrat séquestré dans une membrane biologique permet la libération de domaines cytosoliques, luminaux ou extracellulaires. Ces domaines peuvent alors être transloqués vers une nouvelle destination cellulaire (noyau, autre compartiment cellulaire ou milieu extracellulaire) où leur effet biologique final sera déclenché. Ainsi, le maintien dans un état inactif des substrats de la RIP tient essentiellement à leur séquestration physique loin de leur site d’action. Puisque la protéolyse intramembranaire est l’élément déclencheur du processus de signalisation, ce mécanisme est très régulé, ce qui a mené au terme de protéolyse intramembranaire régulée (Brown et al. , 2000).

L’activité de la RIP-protéase dépend de la disponibilité du substrat qui peut être régie par deux mécanismes alternes. Le premier requiert un clivage extramembranaire préalable du précurseur, souvent déclenché par la liaison d’un ligand au substrat. Ce clivage résulte en un changement conformationnel qui déclenche un deuxième clivage, cette fois-ci intramembranaire (Ebinu et Yankner, 2002). Le deuxième mécanisme implique une relocalisation du précurseur, chapeautée par une protéine chaperonne, d’un compartiment subcellulaire où il est normalement séquestré vers un autre compartiment où se trouve la RIP-protéase (Rawson et al. , 1997). Ainsi, la RIP est un moyen de contrôler des processus physiologiques par la libération régulée de domaines protéiques normalement séquestrés dans une membrane qui deviennent alors capables d’agir à distance. La RIP conduit à l’activation rapide et directe de voies de signalisation en aval en réponse à un stimulus, en évitant les protéines adaptatrices ou les cascades de signalisation impliquant des kinases.

Figure 1- 1 : Schéma général de la protéolyse intramembranaire régulée.

La RIP-protéase assure le clivage de son substrat membranaire normalement séquestré dans la membrane à l’état de précurseur inactif. Ce clivage a lieu à l’intérieur de la bicouche lipidique et conduit à la libération de fragments actifs matures qui pourront accomplir leur effet biologique final.

Jusqu’à aujourd’hui, trois grandes familles de protéases assurant la protéolyse intramembranaire régulée ont été identifiées (Figure 1-2). La première, la famille des Site 2-Protéases (S2P), est impliquée dans le contrôle de l’homéostasie du cholestérol cellulaire via le clivage de SREBP ( Sterol Responsive Element Binding Protein ) (Rawson et al. , 1997; Rudner et al. , 1999). La deuxième, la famille des Présénilines (PS), assure le clivage de nombreux substrats, et notamment de Notch, un récepteur régulant le développement des Vertébrés (Wolfe et al. , 1999a; Wolfe et al. , 1999b). Ces deux familles de RIP-protéases ont été décrites chez les mammifères, alors que la dernière, la famille des Rhomboids a été caractérisée plus récemment chez Drosophila melanogaster (Urban et al. , 2001). Rhomboid-1 assure le clivage de Spitz, un important régulateur du développement chez la Drosophile (Lee et al. , 2001; Urban et al. , 2001).

Malgré leur apparente diversité, ces protéases inhabituelles possèdent des traits communs. Tout d’abord, les résidus catalytiques de ces enzymes sont situés dans la membrane. Ces résidus s’associent au sein de la bicouche lipidique pour former le site actif protéolytique (Rawson et al. , 1997; Wolfe et al. , 1999b; Urban et al. , 2001). Ensuite, bien qu’elles ne présentent aucune homologie avec d’autres protéases connues, elles possèdent toutes des motifs entourant leurs résidus catalytiques qui sont caractéristiques de protéases plus traditionnelles appartenant à la même classe mécanistique (Rawson et al. , 1997; Steiner et al. , 2000; Urban et al. , 2001; Weihofen et al. , 2002). Ceci reflète probablement la convergence évolutive au niveau des différents sites catalytiques vers une fonction protéolytique optimale. Enfin, toutes ces protéases appartiennent à de larges familles de protéines qui sont présentes à tous les niveaux évolutifs : des Archæbactéries aux humains, en passant par les Bactéries (Rawson et al. , 1997; Rudner et al. , 1999; Wasserman et al. , 2000; Ponting et al. , 2002; Urban et al. , 2002a; Weihofen et al. , 2002).

La remarquable diversité et la conservation évolutive de la RIP suggèrent qu’il s’agit d’un ancien mécanisme régulateur apparu précocement au cours de l’évolution. Ce mécanisme aurait ensuite connu des adaptations dans différents organismes pour réguler des processus biologiques distincts (Rawson et al. , 1997; Brown et al. , 2000). La fonction prédominante de cette forme de protéolyse semble être le contrôle de voies de signalisation cellulaire. La RIP a été originellement décrite comme un mécanisme permettant l’activation de facteurs de transcription en réponse à divers signaux (Brown et al. , 2000; Kopan et Goate, 2000). Des études plus récentes, concernant notamment la famille des Rhomboids, montrent que la RIP est impliquée de manière plus générale dans la régulation de l’activation de facteurs impliqués dans la communication intra- ou intercellulaire. La RIP est impliquée dans la transduction ou bien l’émission de signaux essentiels pour le contrôle de la survie et/ou de la différenciation cellulaire (Urban et Freeman, 2002), comme nous allons le voir dans les prochains paragraphes consacrés aux familles de RIP-protéases eucaryotes caractérisées jusqu’à maintenant.

Figure 1- 2 : Les trois grandes familles de RIP-protéases caractérisées.

Les résidus catalytiques sont en rouge et les motifs conservés typiques de chaque classe mécanistique sont en noir. Les sites de clivage du substrat sont montrés, la flèche verte indique la direction de la libération du domaine actif. Les présénilines sont des aspartyl-protéases qui utilisent deux résidus aspartate pour cliver leurs substrats. Les site-2-protéases sont des métalloprotéases qui chélatent un ion zinc en utilisant deux résidus histidines conservés et un résidu aspartate. Les Rhomboids sont des sérine-protéases qui utilisent une triade catalytique pour cliver leurs substrats. Les liaisons hydrogène de la triade sont figurées en pointillé [d’après Urban et al. , 2002].

La découverte de la RIP remonte à des études portant sur la régulation transcriptionnelle du métabolisme du cholestérol dans les cellules eucaryotes (Rawson et al. , 1997). La protéine SREBP ( Sterol Responsive Element Binding Protein ) est une protéine de la membrane du réticulum endoplasmique (RE) de type II existant sous trois isoformes qui partagent la même structure (Hua et al. , 1993; Yokoyama et al. , 1993). Elle est formée de deux domaines transmembranaires organisés dans une conformation d’épingle à cheveux (Hua et al. , 1995). Suite à une diminution du cholestérol intracellulaire, SREBP est transloquée du réticulum endoplasmique (RE) vers l’appareil de Golgi par la protéine activatrice de SREBP (SCAP ou SREBP Activating Protein ). Cette protéine agit en fait comme un capteur sensible au cholestérol de la membrane du RE (Wang et al. , 1994) (Figure 1-3). Après sa translocation vers le Golgi, SREBP est clivée une première fois au niveau de sa boucle extramembranaire par une protéase du lumen du Golgi appelée Site 1-protéase (S1P). Ce clivage brise la liaison covalente entre les deux domaines transmembranaires mais ne suffit pas à libérer la partie N-terminale de SREBP. SREBP subit alors un deuxième clivage au niveau de son premier domaine transmembranaire qui est assurée par la Site 2-Protéase (S2P), une protéase enchâssée dans la membrane du RE. S2P est une protéine de 519 acides aminés contenant un motif consensus de type HEXXH, caractéristique des métalloprotéases liant le zinc (Rawson et al. , 1997). S2P diffère cependant des autres métalloprotéases par son importante hydrophobicité qui suggère la présence de nombreux domaines transmembranaires (Rawson et al. , 1997). S2P est le prototype d’une nouvelle famille de métalloprotéases hautement conservée évolutivement des Archæbactéries aux mammifères. Toutes ces protéines contiennent le motif HEXXH, semblant confirmer l’activité métalloprotéase de S2P (Lewis et Thomas, 1999).

Le clivage assuré par S2P conduit à la libération cytoplasmique du fragment N-terminal de SREBP qui appartient à la famille des facteurs de transcription de type hélice-boucle-hélice basique (bHLH ou basic Helix Loop Helix ). Ce fragment est transloqué vers le noyau où il active la transcription de gènes munis d’éléments de réponse aux stérols (SRE ou Sterol Responsive Elements ).

Figure 1- 3 : Clivage de SREBP par S2P

SREBP est synthétisée à l’état de précurseur inactif muni de deux domaines transmembranaires, d’un domaine régulateur (R) et d’un domaine bHLH. En cas de déplétion en cholestérol, SREBP chaperonnée par SCAP est transloquée du RE vers le Golgi (non montré), où elle va subir deux clivages. Le premier clivage assuré par la Site 1-protéase (S1P) a lieu dans le domaine extramembranaire (a) et laisse une portion résiduelle de SREBP munie de son seul domaine transmembranaire C-terminal. Ce précurseur intermédiaire est le substrat direct de la Site 2-protéase (S2P) qui clive SREBP à l’intérieur de son domaine transmembranaire résiduel (b) . Ceci libère la portion C-terminale munie du domaine bHLH de SREBP (c) . Ce fragment est adressé au noyau où il va directement activer la transcription de gènes munis de SRE et contrôlant le métabolisme du cholestérol. Le cholestérol contrôle la translocation de SREBP du RE vers le Golgi par le domaine R sensible aux stérols de SREBP ainsi que la transcription de S1P, permettant une régulation de la disponibilité en substrat pour S2P.

Les cellules eucaryotes doivent réguler leurs voies de biosynthèse de manière très précise, pour produire les quantités nécessaires de produits terminaux sans surproduction. Un tel contrôle s’avère essentiel particulièrement pour le métabolisme du cholestérol et des acides gras (Brown et Goldstein, 1997). En effet, ces lipides participent à de nombreux processus cellulaires. D’autre part, un dysfonctionnement de leur métabolisme conduit à des états pathologiques. Ainsi, l’excès de cholestérol dans les membranes entraîne la formation de cristaux qui provoquent la mort cellulaire. L’excès de cholestérol dans le sang se déposant sur la paroi des artères est aussi à l’origine d’athérosclérose (Small et Shipley, 1974). Le métabolisme du cholestérol et des acides gras dépend du contrôle transcriptionnel de l’expression des gènes de leur biosynthèse. Ces gènes sont placés sous le contrôle de SRE dont l’activation dépend de la liaison du fragment N-terminal de SREBP agissant comme facteur de transcription (Goldstein et Brown, 1990). Les stérols régulent la maturation de SREBP et assurent ainsi la répression de ces gènes (Figure 1-3) (Rawson et al. , 1997). En particulier, l’inhibition de l’expression de SCAP par les stérols conduit à la séquestration de SREBP dans le RE et empêche son clivage par les deux protéases du Golgi S1P et S2P. Un deuxième niveau de régulation existe puisque l’expression de la protéase S1P est aussi régulée par la disponibilité cellulaire en stérols. Or, S2P ne peut agir sans le clivage préalable de son substrat SREBP par S1P, ce qui permet un contrôle du clivage de SREBP et donc un contrôle direct de l’expression des gènes régulés par les SRE (Wang et al. , 1994; Sakai et al. , 1996; Brown et Goldstein, 1997).

Le cholestérol est un composant majeur des membranes biologiques et sa présence influence dramatiquement la fluidité membranaire. Dans les membranes, le ratio entre le cholestérol et les phospholipides ainsi que le ratio entre les acides gras saturés et insaturés incorporés dans les phospholipides détermine la fluidité membranaire. Ces ratios sont déterminés par la régulation de la biosynthèse du cholestérol et de l’oléate, contrôlée par un mécanisme transcriptionnel commun dépendant de la maturation des facteurs de transcription SREBP (Thewke et al. , 2000). Le cholestérol joue également un rôle essentiel dans la modification de protéines impliquées dans la signalisation au cours du développement embryonnaire (Porter et al. , 1996a). Par exemple, la liaison covalente d’une molécule de cholestérol sur le régulateur du développement SonicHedgeHog (SHH) permet de restreindre spatialement la diffusion de SHH (Ho et Scott, 2002). SHH est une molécule-signal sécrétée qui assure de nombreuses fonctions au cours du développement des vertébrés, et particulièrement du système nerveux. Dans le tube neural, SHH est secrété à partir de la notochorde et contrôle la détermination du destin cellulaire d’une manière dose-dépendante. Lorsque SHH est secrété, le profil du gradient de concentration formé dans les différents tissus dépend de la liaison du cholestérol (Porter et al. , 1996b)

Récemment, S2P a aussi été impliquée dans le clivage de ATF6, un facteur de transcription séquestré dans le RE. La libération du fragment N-terminal de ATF6 conduit à l’activation de gènes spécifiques contrôlant l’accumulation de protéines non repliées dans le RE au cours d’une réponse cellulaire appelée UPR ( Unfolded Protein Response ) (Ye et al. , 2000; Lee et al. , 2002b). Ceci laisse suggérer l’implication de la protéolyse intramembranaire régulée assurée par la famille des S2P dans d’autres processus cellulaires essentiels pour la survie cellulaire.

La RIP assurée par S2P assure la libération d’un facteur de transcription qui contrôle l’expression des gènes impliqués dans le métabolisme du cholestérol et des acides gras. S2P est donc au cœur d’un processus essentiel pour la survie cellulaire.

La protéine APP est une protéine transmembranaire de type I munie d’un large domaine extracellulaire et d’un court segment intracellulaire. APP possède plusieurs sites de clivage extramembranaires, les sites α et β, ainsi qu’un site de clivage intramembranaire, le site γ. Les protéases agissant au niveau de ces sites portent le nom de secrétases, puisque les différents clivages conduisent à la sécrétion de différents fragments de APP. APP peut être d’abord clivée suivant deux voies qui utilisent chacune un site de clivage distinct, les sites α et β. Le clivage en α et β entraîne la libération de dérivés solubles de la protéine (APPs-α et APPs-β) et la rétention au niveau de la membrane de fragments C-terminaux de 83 ou 99 acides aminés (C83 et C99) (Selkoe, 1999; Annaert et al., 2000; Steiner et Haass, 2000) (Figure 1-4). Le peptide C83 peut ensuite être clivé en position γ par le complexe γ -secrétase, donnant naissance à p3 (le fragment C-terminal de 3 kDa de Aβ) et à AID ( APP Intracellular Domain ). Quant au peptide C99, son clivage en γ conduit à la formation de AID, et du peptide Aβ, secrété dans l’espace intercellulaire et composant majeur des plaques amyloïdes, observées chez les patients atteints de la maladie d’Alzheimer (Selkoe, 1999; Annaert et al. , 2000; Steiner et Haass, 2000).

De nombreuses études ont montré que l’aspartyl-protéase membranaire BACE était la β-secrétase (Hussain et al. , 1999; Sinha et al. , 1999; Vassar et al. , 1999; Yan et al. , 1999; Lin et al. , 2000). Un groupe de métalloprotéases incluant TACE ( Tumor necrosis factor α−Converting Enzyme ) serait quant à lui responsable d’une fraction significative de l’activité α -secrétase (Buxbaum et al. , 1998; Skovronsky et al. , 2000).

L’activité γ-secrétase est assurée par un large complexe protéique multimérique appelé complexe γ-secrétase. De multiples protéines membranaires participent à sa formation, parmi lesquelles la nicastrine (Yu et al. , 2000), APH-1 (Francis et al. , 2002), PEN-2 (Goutte et al. , 2002) et finalement les présénilines-1 et -2 (Li et al. , 2000). La protéine assurant l’activité protéolytique du complexe est longtemps restée inconnue. Cependant, des mutations autosomales dominantes sur les gènes des présénilines-1 et -2 (PS-1 et PS-2) ou de APP déplacent l’équilibre de formation Aβ42/Aβ40, favorisant ainsi la production de Aβ42 et accélérant l’apparition des plaques amyloïdes dans les tissus cérébraux (Citron et al. , 1992; Cai et al. , 1993; Borchelt et al. , 1997). L’effet des mutations sur les gènes des présénilines sur le clivage de APP en position γ suggère que les présénilines peuvent elles-mêmes assurer la fonction protéolytique du complexe γ-secrétase (Borchelt et al. , 1997). De plus, l’invalidation du gène PS-1 conduit à un clivage réduit de APP (De Strooper et al. , 1998). Cependant, ce ne sont que des travaux plus récents qui ont consacré l’activité protéolytique de PS-1.

Figure 1- 4 : Clivages multiples de APP

Figure 1-4 (voir légende page suivante)

(A) APP est clivé par de multiples secrétases. Selon la voie pathogénique (produisant le peptide Aβ), APP est d'abord clivé par la β-secrétase. Ce clivage génère un fragment C99, le substrat immédiat pour le clivage par le complexe γ-secrétase dont l’activité protéolytique est assurée par les présénilines. D’autre part, APPs-β, le domaine N-terminal tronqué de APP est libéré. C99 est ensuite clivé dans son domaine transmembranaire par le complexe γ-secrétase. Ce clivage génère Aβ, qui est secrété dans l’espace inter-cellulaire. En parallèle, le fragment AID est généré et libéré dans le cytoplasme. Suivant la voie non-pathogénique, APP est clivée par la α-secrétase (TACE) dans son domaine Aβ. Ce clivage conduit à C83 et APPs-α. APPs-α est alors secrété dans l’espace intercellulaire. C83 peut être clivé par le complexe γ-secrétase, donnant naissance à p3 (le fragment C-terminal de 3 kDa de Aβ) et à AID

(B) Protéolyse intramembranaire régulée de APP par les présénilines Aβ est d’abord clivé par la β-secrétase (BACE) pour générer le substrat pour le complexe γ-secrétase/présénilines. Deux résidus aspartates situés dans les TMH6 et TMH7 de PS forment le site actif de PS. Le clivage conduit à la sécrétion de Aβ et à la libération de AID. D’une part, AID est proapoptotique, et d’autre part AID est capable d’activer la transcription de gènes spécifiques (d’après Haass et Steiner, 2002).

En effet, PS-1 porte des résidus aspartiques conservés au niveau des domaines transmembranaires 6 et 7, positions qui s’aligneraient avec le site de clivage γ de APP. La mutagenèse dirigée de ces deux résidus aspartates de PS-1 empêche le clivage de APP (Wolfe et al. , 1999b; Kimberly et al. , 2000). PS-1 assure donc la RIP de APP, les autres membres du complexe γ-secrétase auraient un rôle régulateur de cette activité de protéolyse (Yu et al. , 2000; Francis et al. , 2002).

Les présénilines adoptent une topologie membranaire particulière puisqu’elles traversent la membrane à de multiples reprises, via leurs huit domaines transmembranaires, les domaines C- et N-terminaux seraient cytosoliques (Doan et al. , 1996; Li et Greenwald, 1996). Entre les domaines transmembranaires 6 et 7, une large bouche hydrophile cytosolique est le siège d’une endoprotéolyse (Li et Greenwald, 1998). En effet, les présénilines sont synthétisées à l’état d’holoprotéine intacte de 50 kDa. Cependant, les formes matures et fonctionnelles de PS-1 et PS-2 consistent en un hétérodimère formée des fragments N- et C-terminaux de ~30 et ~20 kDa issus de cette endoprotéolyse (Thinakaran et al. , 1996; Podlisny et al. , 1997; Ratovitski et al. , 1997).

Une recherche d’homologues des PS sur les bases de données a conduit à l’identification d’un motif conservé chez les membres de la famille des PS, motif qui présente des similarités avec un court segment d’acides aminés présent chez une aspartyl-protéase membranaire bactérienne (Steiner et al. , 2000). L’ensemble de ces résultats suggère que les protéines de la famille des PS forment une nouvelle classe d’aspartyl-protéases qui existent au sein de larges complexes macromoléculaires membranaires et assurent le clivage intramembranaire de APP et d’autres substrats (Fortini, 2001).

La protéine Notch est une protéine membranaire intégrale de type I, munie d’un large domaine extracellulaire composé de répétitions en tandem de motifs EGF-like ( Epidermal Growth Factor-Like ), d’un domaine transmembranaire et d’un domaine intracellulaire muni de six domaines ankyrine répétés (Wharton et al. , 1985; Blaumueller et Artavanis-Tsakonas, 1997). Ce récepteur est synthétisé sous forme d’un précurseur de 300 kDa, qui est clivé constitutivement dans le Golgi par une furine (Figure 1-5) (Logeat et al. , 1998). Ce clivage conduit à la formation de deux sous-unités : une sous-unité extracellulaire et une sous-unité transmembranaire qui restent associées de manière non-covalente sous forme d’hétérodimère (Annaert et De Strooper, 1999). L’hétérodimère est adressé à la surface cellulaire et reste inactif jusqu’à ce qu’il lie un de ses ligands résidant à la surface d’une autre cellule et appartenant à la famille des Delta/Jagged/Serrate/LAG-2. La liaison du ligand entraîne un changement de conformation de l’hétérodimère qui permet le clivage de la sous-unité transmembranaire par TACE (Brou et al. , 2000). Cette enzyme assure également le clivage de APP en position α (Buxbaum et al. , 1998). La portion extracellulaire de la sous-unité transmembranaire de Notch est ainsi libérée mais reste associée à sa sous-unité extracellulaire. Ce nouveau changement conformationel entraîne la RIP de la sous-unité transmembranaire tronquée au niveau d’un résidu valine conservé de son hélice transmembranaire, libérant un fragment cytosolique. Ce fragment appelé NICD ( Notch IntraCellular Domain ) est ensuite adressé au noyau où il active la transcription de gènes spécifiques impliqués dans le développement (Schroeter et al. , 1998; Fortini, 2002).

Des altérations des voies de signalisation contrôlées par la RIP des présénilines entraînent de graves troubles pathogéniques et développementaux. Tout d’abord, la maladie d’Alzheimer est souvent causée par des mutations sur les gènes des présénilines (cf. 1.3.1). Cette maladie est caractérisée par une dystrophie des neurites, une perte des synapses et une dégénération neuronale progressive (Selkoe, 2001). Le clivage de APP par les présénilines libère deux types de peptides Aβ42 et Aβ40, les composants majeurs des plaques amyloïdes observées dans le cerveau de patients atteints de la maladie d’Alzheimer. Ce clivage libère également les fragments C-terminaux de 57 ou 59 aa (AID). Bien que la fonction biologique de APP soit encore mal connue, il a été montré que le fragment AID possède des vertus proapoptotiques (Passer et al. , 2000). AID forme également un complexe multimérique avec la protéine adaptatrice nucléaire Fe65 et l’histone-acétyltranférase Tip60 qui possède une activité transcriptionnelle potentielle sur des gènes encore non définis (Cao et Sudhof, 2001).

Les présénilines sont exprimées de manière ubiquitaire, mais à des niveaux différents suivant les tissus (Rogaev et al. , 1995; Sherrington et al. , 1995). Au cours du développement, PS-1 est exprimée dans une grande variété de tissus et types cellulaires, mais de manière prédominante dans le SNC (Lee et al. , 1996; Moreno-Flores et al. , 1999). À la fin de l’embryogenèse, le profil d’expression de PS-1 recouvre celui de son substrat Notch. Au cours du développement postnatal, l’expression de PS-1 est maximale au cours de la deuxième semaine de vie postnatale, puis décroît progressivement pour ne rester détectable chez l’adulte que dans l’hippocampe et le cervelet (Moreno-Flores et al. , 1999). De façon intéressante, un rapport récent montre l’expression de PS-1 dans les cellules progénitrices neurales de l’hippocampe adulte (Wen et al. , 2002). Les présénilines contrôleraient donc la différenciation neuronale en association avec une régulation de la voie de signalisation Notch. Chez la souris, l’invalidation totale ou partielle du gène de PS-1 est létale à la naissance (Shen et al. , 1997). L’embryon montre de sévères malformations du squelette. La zone ventriculaire du cerveau des souris PS-1 -/- est réduite par rapport aux animaux contrôles, indiquant une neurogenèse réduite. Par ailleurs, une mort neuronale massive est observée dans des régions spécifiques du cerveau. PS-1 semble donc requise pour la formation du squelette, la neurogenèse au cours du développement et la survie neuronale, vraisemblablement via le contrôle de la voie de signalisation Notch (Shen et al. , 1997).

En modulant des interactions locales entre cellules, la voie de signalisation de Notch participe à la détermination de la destinée cellulaire chez tous les organismes pluricellulaires étudiés jusqu’à maintenant, des nématodes aux humains (Weinmaster, 1997; Egan et al. , 1998; Artavanis-Tsakonas et al. , 1999). Notch agit en assurant qu’une cellule unique ou une population restreinte de cellules précurseurs adopte une destinée cellulaire particulière, différant des cellules adjacentes (Artavanis-Tsakonas et al. , 1999). Le rôle de Notch a été particulièrement étudié au cours du développement du système nerveux des Vertébrés. Chez l’embryon précoce, l’activation de Notch maintient la pluripotence des cellules souches neurales. À des stades plus avancés du développement correspondant à l’initiation de la gliogenèse, Notch induit la différenciation des cellules gliales. Dans de nombreuses régions du système nerveux, Notch fonctionne comme un interrupteur moléculaire qui termine la phase proliférative de la neurogenèse et induit la différenciation gliale (Lundkvist et Lendahl, 2001; Morrison, 2001).

La transduction du signal Notch est assurée par son fragment N-terminal (NICD) libéré par la RIP des présénilines. NICD est muni d’un domaine activateur de la transcription mais ne lie pas directement l’ADN. Dans le noyau, NICD s’associe avec les facteurs de transcription de la famille CSL qui agissent normalement comme répresseurs de la transcription. La liaison de NICD lève l’effet répresseur de CSL et active la transcription des gènes cibles comme les facteurs de transcription de la famille HES (Chen et al. , 1997; Egan et al. , 1998; Artavanis-Tsakonas et al. , 1999) (Figure 1-5). HES appartient à une famille de répresseurs transcriptionnels qui régulent négativement l’expression de facteurs de transcription tissus-spécifiques (Ohsako et al. , 1994; Iso et al. , 2003). L’expression de HES1 et HES5 est favorisée par la présence de Notch et empêche ainsi la différenciation des cellules souches neurales d’embryons de souris. Les cellules progénitrices sont maintenues à l’état prolifératif, et la neurogenèse et la différenciation des oligodendrocytes sont inhibées (Ohtsuka et al. , 1999).

Figure 1-5 (voir légende page suivante)

Figure 1-5 : Régulation de la maturation et de l’activation du récepteur Notch par des protéolyses successives.

Notch est synthétisé à l’état de précurseur inactif de 300 kDa qui subit trois clivages consécutifs. Dans l’appareil de Golgi, le précurseur de Notch est clivé au niveau luminal par une furine pour générer deux domaines séparés : un domaine intracellulaire et un domaine transmembranaire/ intracellulaire. Ces deux domaines sont liés par une liaison non-covalente pour créer une forme hétérodimérique de Notch, constituant la principale forme de Notch détectée à la surface cellulaire. La liaison de ligands de Notch de la famille Delta/Jagged/Serrate déclenche un clivage extracellulaire assuré par la protéase TACE qui supprime un ectodomaine. Le fragment C-terminal résiduel est ensuite lui-même clivé par le complexe γ secrétase dont l’activité protéolytique est assurée par les présénilines. Ce clivage intramembranaire libère le domaine intracellulaire de Notch (NICD) qui est transloqué vers le noyau où il régule l’expression de gènes cible comme Enhancer of Split ( E(spl) ), en association avec d’autres facteurs nucléaires comme les membres de la famille CSL ( C promoter binding factor/Suppressor of hairless/Lag-1 transcription factor ) [d’après Fortini, 2002].

Plus récemment, des travaux ont montré l’existence d’un dialogue croisé entre la voie de Notch et de APP. En effet, la protéine membranaire APP est capable lier Numb, un inhibiteur cytosolique de Notch. D’autre part, Numb lie aussi AID et réprime l’activation de Notch après clivage. Ainsi, les présénilines pourraient avoir des effets opposés sur la voie de signalisation Notch : positif lors du clivage de Notch et de la génération de NICD, et négatif lors du clivage de APP et de la libération de AID qui inhibe la fonction de NICD (Roncarati et al. , 2002). L’inhibition de la fonction de Notch pourrait ainsi accélérer le processus neurodégénératif de la maladie d’Alzheimer.

En plus du clivage de APP et Notch, le complexe γ−secrétase dont l’activité protéolytique est assurée par les présénilines est maintenant impliqué dans le clivage d’un nombre croissant de substrats cellulaires contrôlant des voies de signalisation essentielles. Parmi ces substrats activés par la RIP se retrouvent le facteur de transcription Ire1 (Niwa et al. , 1999), le récepteur CD44 (Lammich et al. , 2002), la protéine d’adhésion E-cadherin (Lammich et al. , 2002) et le récepteur aux EGF ErbB4.

La RIP assurée par les présénilines est donc au centre de processus cellulaires essentiels pour le développement et la survie cellulaire. Des altérations de la RIP assurée par les présénilines conduisent à des troubles pathologiques et développementaux importants.

Chez les vertébrés, les récepteurs au facteur de croissance épidermique ( Epidermic Growth Factor Receptor ou EGFR) appartiennent à la famille des récepteurs de surface à activité tyrosine kinase. Quatre membres de la famille des EGFR sont connus : ErbB1 (aussi appelé EGFR ou HER1) (Ullrich et al. , 1984), ErbB2 (Neu ou HER2) (Coussens et al. , 1985), ErbB3 (HER3) (Kraus et al. , 1989) et ErbB4 (HER4) (Plowman et al. , 1993). ErbB1-4 sont des protéines transmembranaires de type I composées d’un domaine de liaison du ligand extracellulaire, d’un unique domaine transmembranaire et d’un domaine à activité tyrosine-kinase cytosolique. Le récepteur ErbB3 possède ce domaine, mais il est inactif. In vivo , les quatre récepteurs Erb peuvent former des homo- ou hétérodimères qui permettent le contrôle d’un large répertoire de processus cellulaires distincts (Olayioye et al. , 2000).

Le nombre de ligands activateurs des récepteurs ErbB a augmenté au cours de l’évolution : C. elegans possède un unique ligand, la Drosophile en compte quatre et chez les mammifères, plus d’une douzaine de ligands possédant un motif EGF dans leur domaine extracellulaire ont été identifiés jusqu’à aujourd’hui (Bogdan et Klambt, 2001). Leur affinité et leur spécificité respectives envers les différents ErbB entraînent un large répertoire de signalisation. L’EGF, le TGFα ( Transforming Growth Factor ) et les amphirégulines se lient spécifiquement à ErbB1, alors que la betacelluline et l’épiréguline lient ErbB1 et ErbB4. Les neurégulines (aussi appellées ARIA, GGF, hérégulines ou NDF) lient spécifiquement ErbB3 et ErbB4 (Shinoda et al. , 1997). L’épissage alternatif de l’ARNm des NRG génère une grande diversité de protéines membranaires, intracellulaires ou sécrétées, dont l’expression différentielle à l’échelle tissulaire permet le contrôle sélectif de l’activation des récepteurs ErbB3 et ErbB4 (Shinoda et al. , 1997). La majorité de ces ligands sont synthétisés à l’état de précurseurs transmembranaires inactifs nécessitant une activation par un clivage protéolytique pour pouvoir lier et activer les récepteurs ErbB (Massague et Pandiella, 1993). Par exemple, le clivage des précurseurs membranaires des NRG est assuré par TACE, l’enzyme qui clive aussi le précurseur de Notch (Montero et al. , 2000) (cf. 1.3.2.1).

Au niveau de la membrane, la molécule d’ErbB est présente en tant que monomère inactif. Après liaison de son ligand extracellulaire, ErbB subit une dimérisation qui entraîne une transautophosphorylation de ses domaines cytosoliques (Figure 1-6). Dans cette conformation active, le récepteur déclenche les voies de signalisation en aval (Bogdan et Klambt, 2001). Ses résidus tyrosine phosphorylés recrutent de nombreux effecteurs cytosoliques ou membranaires comme la phosphoinositide 3-kinase (PI3K), la phospholipase C (PLC) et la molécule adaptatrice Grb2. Toutes ces molécules sont munies de domaines de liaisons des phosphotyrosines SH2 ( Src Homology domain 2 ) ou PTB ( PhosphoTyrosine Binding ) (Figure 1-6) (Shoelson, 1997). L’assemblage de ces protéines cibles sur la face interne de la membrane plasmique culmine lors de la formation de seconds messagers comme les polyphosphoinositides et les inositol polyphosphates, entraînant l’activation de la cascade mitogène des Ras/Raf/MAP kinases (Yamauchi et al. , 1998). Parmi les cibles finales de ces voies de signalisation se retrouvent des facteurs de transcription qui sont transloqués du cytosol vers le noyau après activation par leurs kinases ou phosphorylases respectives.

Figure 1- 6 : La voie de signalisation des récepteurs aux EGF (ErbB).

La fixation du ligand induit la dimérisation du récepteur et une transautophosphorylation de résidus tyrosine, créant des sites de liaison pour les domaines SH2 ou PTB des protéines effectrices. L’activation subséquente des protéines effectrices comme PI3K ou Grb2 initie de nombreux processus cellulaires contrôlés notamment par la cascade des Raf/Ras/Map kinases (d’après Prenzel et al. , 2001).

Des développements récents dans le domaine de la transduction du signal des EGFR permettent d’envisager un rôle direct de ces molécules activées dans le contrôle de la transcription. Par exemple, le récepteur membranaire aux EGF ErbB1 activé par son ligand TGFα est détectable dans le noyau où il est capable d’activer la transcription de gènes spécifiques comme le gène de la cycline D1 qui participe au contrôle du cycle cellulaire (Lin et al. , 2001). De même, en réponse à la liaison du facteur de croissance Heregulin (une isoforme de NRG), une isoforme particulière d’un autre membre de la famille des EGFR, ErbB4, subit deux clivages subséquents dont la séquence ressemble étrangement à celle subie par APP ou Noch (cf. 1.3) (Elenius et al. , 1997). En effet, un premier clivage requiert la métalloprotéase TACE et libère un fragment extracellulaire N-terminal de ErbB4. Le fragment résiduel contenant les domaines cytoplasmique et membranaire de ErbB4 reste enchâssé dans la membrane (Vecchi et Carpenter, 1997; Rio et al. , 2000; Zhou et Carpenter, 2000). Il subit alors un second clivage au niveau du domaine transmembranaire. Ainsi, tout comme APP et Notch, ErbB4 subit une protéolyse intramembranaire régulée entraînant la libération de son domaine intracellulaire C-terminal qui est adressé au noyau où il manifeste une activité transcriptionnelle sur des gènes encore non caractérisés (Figure 1-7). Ce clivage est là-aussi assuré par les présénilines (Ni et al. , 2001; Lee et al. , 2002a). Cette voie de transduction alterne utilisant la RIP permet de contourner les cascades de phosphorylation essentielles à la transduction des stimuli mitogènes. La possibilité que tous les récepteurs aux EGF soient par eux-mêmes des facteurs de transcription dont l’activation est régulée par la RIP est envisageable.

Chez les Vertébrés, l’activation des EGFR contrôle des voies de signalisation essentielles impliquées de multiples processus cellulaires via la cascade des Ras/Raf/MAP kinases. Une voie d’activation alterne utilise la RIP assurée par les présénilines, ce qui permet d’activer directement la transcription de gènes spécifiques. Chez la Drosophile nous verrons que la RIP assure directement l’activation de la voie des EGFR.

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Figure 1- 7 : Voie alterne de transduction du signal par la RIP de ErbB4.

Suite à la liaison de son ligand héréguline, le récepteur ErbB4 est clivé au niveau de son domaine transmembranaire par le complexe γ-secrétase/préséniline. Ce clivage conduit à la libération du fragment C-terminal cytosolique de ErbB4 (ErbB-4/CTF) qui est adressé au noyau où il active la transcription de gènes encore inconnus. Cette voie alterne permet de contourner la cascade de signalisation des Ras/Raf/Map kinases (adapté de Fortini, 2001).

D. melanogaster possède un seul récepteur aux EGF, similaire aux quatre récepteurs ErbB des mammifères, et qui représente probablement leur prototype évolutif. Comme ses homologues chez les mammifères, le récepteur aux EGF de D. melanogaster (DER) possède de multiples fonctions, incluant le contrôle de la différenciation, de la prolifération et de la survie cellulaire (Schweitzer et Shilo, 1997; Dominguez et al. , 1998). La cascade de signalisation via les Ras/Raf/MAP kinases en aval de la voie des récepteurs aux EGF est évolutivement conservée entre la Drosophile et les mammifères et détaillée dans les paragraphes précédents (cf. 1.4.1) (Casci et Freeman, 1999). La voie d’activation du DER a été extensivement caractérisée chez la Drosophile. Le principal ligand activateur du DER est la protéine Spitz, une protéine très similaire au TGFα humain. Spitz est synthétisée sous forme de précurseur inactif, comprenant un domaine transmembranaire et un domaine extracellulaire EGF-like. Spitz est normalement confiné dans la membrane du RE de la cellule émettant le signal EGF (Rutledge et al. , 1992). Avant de pouvoir lier et activer le DER situé sur la membrane plasmique de la cellule réceptrice du signal EGF, Spitz doit être activé dans la cellule émettrice (Figure 1-8). Deux molécules ont été impliquées dans l’activation de Spitz: Rhomboid-1 et Star, qui sont considérées comme régulateurs premiers de l’activation de la voie des EGF chez D. Melanogaster (Guichard et al. , 1999; Bang et Kintner, 2000). Star est une protéine chaperonne nécessaire pour l’export de Spitz du RE vers l’appareil de Golgi (Tsruya et al. , 2002), où il va être clivé par Rhomboid-1 au niveau de son domaine transmembranaire pour générer sa forme active (Urban et al. , 2001). Ainsi, Rhomboid-1 assure la protéolyse intramembranaire régulée de Spitz qui permet la libération d’un fragment N-terminal actif. Ce fragment soluble est alors sécrété hors de la cellule émettrice du signal dans le milieu extracellulaire pour activer le DER d’une cellule adjacente. Bien que DER et Spitz soient largement exprimés au cours du développement, l’activité Rhomboid est limitante. La présence ou l’absence de Rhomboid restreint spatialement et temporellement l’activation de la voie du DER, en contrôlant la disponibilité en Spitz actif (Figure 1-8) (Sturtevant et al. , 1993).

Figure 1- 8 : Libération régulée par la RIP de Spitz

Spitz est normalement séquestré dans le réticulum endoplasmique (RE) (a) jusqu’à ce que Star provoque sa relocalisation (b) vers l’appareil de Golgi. Rhomboid est une protéine de la membrane du Golgi qui va assurer son clivage (c) , libérant un fragment soluble luminal libéré dans le cytosol (d ), puis secrété dans le milieu intercellulaire (e) . Ce fragment va se lier au récepteur aux EGF de la drosophile (DER) d’une cellule-cible voisine (f) et activer la voie de signalisation développementales des EGF, via la cascade des Ras/Raf/MAP kinases (adapté de Fortini, 2001(Fortini, 2001)).

Les quatre ligands activateurs du récepteur aux EGF de D. melanogaster  sont Spitz, Gurken (Shmueli et al. , 2002), Keren (Reich et Shilo, 2002) et Vein (Schnepp et al. , 1996). Tous ces ligands seraient activés par le même mécanisme de RIP (Urban et al. , 2002b; Urban et al. , 2002a). L’utilisation de la RIP chez la Drosophile pour l’activation de facteurs de croissance contraste avec les autres modes d’activation connus chez les Vertébrés, qui utilisent en général des métalloprotéases de la surface cellulaire pour libérer le fragment actif par un clivage extramembranaire (Arribas et al. , 1996; Black et White, 1998). Par exemple, les neurégulines, ligands du récepteur aux EGF des Vertébrés, sont clivées par la protéase TACE (Montero et al. , 2000) (cf. 1.4.1). Chez la Drosophile, au moins quatre des sept homologues de Rhomboid-1 sont impliqués dans l’activation des EGF. En effet, l’activité protéolytique des Rhomboid-1 à -4 a été démontrée récemment (Urban et al. , 2002b). Les ADNc correspondant aux trois derniers membres de la famille ne sont pas encore entièrement clonés, ce qui empêche leur étude pour le moment. Tous les membres de la famille Rhomboid possèdent sept domaines transmembranaires (Urban et al. , 2002b). Des expériences de mutagenèse dirigée menées sur Rhomboid-1 ont conduit à l’identification des acides aminés constituant un motif catalytique consensus de type GASGG. Ce motif contient les acides aminés G215 et S217, essentiels à l’activité protéolytique de Rhomboid. La glycine (G215) stabilise l’oxygène de la liaison peptidique pendant le clivage et la sérine centrale forme le site actif responsable du clivage du substrat Spitz (Urban et al. , 2001). D’autres enzymes utilisant des sérines activées possèdent également un motif conservé du type GxSxG (Brenner, 1988). La particularité de Rhomboid-1 est que son site actif se situé au milieu d’un domaine transmembranaire ce qui en fait la première sérine-protéase assurant la protéolyse intramembranaire régulée à avoir été caractérisée jusqu’à maintenant (Urban et al. , 2002b).

1.4.2.3 La famille des Rhomboids est présente à tous les niveaux évolutifs

Rhomboid-1 appartient à une grande famille de gènes conservée chez les archæbactéries, les bactéries, les Levures, les plantes et les animaux, jusqu’aux humains (Wasserman et al. , 2000; Lee et al. , 2001). Malgré cette étonnante conservation évolutive qui laisse suggérer des fonctions cellulaires essentielles pour tous les membres de la famille Rhomboid, seuls quelques membres ont été étudiés en dehors de D. Melanogaster , mais leur mode d’action reste encore mal connu. Le premier a été identifié chez la bactérie pathogène Providencia stuartii qui contrôle la taille de sa population en secrétant un peptide-signal qui s’accumule dans le milieu à des densités cellulaires élevées, activant des gènes de virulence (Rather et al. , 1999). Ce mode de communication intercellulaire appelé " quorum sensing " est utilisé par la majorité des populations bactériennes (Bassler, 1999). De manière remarquable, l’homologue de Rhomboid chez P. stuartii , appellé AarA, est nécessaire pour la génération du signal de quorum sensing (Rather et al. , 1997; Rather et al. , 1999). Bien que le mécanisme précis de cette signalisation ne soit pas encore défini, le parallèle est frappant entre la fonction de AarA et celle de Rhomboid chez D. melanogaster (Bassler, 1999). Fait encore plus intéressant à noter, AarA et de nombreuses autres Rhomboids bactériennes peuvent cliver trois ligands du récepteur aux EGF de D. melanogaster (Urban et Freeman, 2002). La RIP assurée par les Rhomboid pourrait donc être une des premières stratégies à avoir évolué vers la communication intercellulaire.

Chez les Vertébrés, seuls trois homologues de Rhomboid ont été étudiés. Le premier, baptisé RRP ( Rhomboid Related Protein ), présente des similarités significatives avec Rhomboid-1. Une unique étude lui est consacrée et montre que son ARNm est détecté à de forts niveaux dans le cerveau et les reins humains (Pascall et Brown, 1998). Le deuxième homologue, baptisé Ventrhoid, a été caractérisé récemment chez les mammifères (Jaszai et Brand, 2002). Une unique étude lui est également consacrée et montre que, chez la souris, Ventrhoid a un profil d’expression dynamique restreint à la zone ventrale du tube neural de l’embryon (Jaszai et Brand, 2002). Ceci laisse suggérer que, tout comme Rhomboid chez la Drosophile, Ventrhoid soit impliquée dans la régionalisation du SNC le long de l’axe dorso-ventral. La présence du motif catalytique GASGA dans un domaine transmembranaire de Ventrhoid prédit un rôle de protéase, en revanche, son substrat reste inconnu. Récemment, une troisième protéine présentant des similarités certaines avec Rhomboid a été identifié chez l’humain dans notre laboratoire, il s’agit de la protéine PARL ( Presenilin Associated rhomboid like protein ) (Pellegrini et al. , 2001).

De par son implication dans des processus très divers incluant la division cellulaire, la détermination du destin cellulaire et la différenciation, la voie de signalisation des EGFR joue un rôle essentiel au cours du développement des vertébrés et des invertébrés (Schweitzer et Shilo, 1997). Après activation par un ligand extracellulaire, l’EGFR subit une dimérisation et une autophosphorylation conduisant, via la voie conservée des Ras/Raf/MAP kinases, à la modulation de l’activité de facteurs de transcription (cf. 1.4.1.1). La complexité des fonctions cellulaires gouvernées par l’EGFR implique que son activité soit précisément régulée au cours du développement (Klambt, 2000). Des dysfonctionnements de ce système très finement régulé induits par la surexpression, l’amplification ou la mutation d’éléments de cette voie, particulièrement des récepteurs ErbB1 et ErbB2, entraînent fréquemment la transformation de cellules et le développement de cancer (Olayioye et al. , 2000).

L’importance des récepteurs ErbB dans le développement a été montrée par des études sur des souris modifiées génétiquement. Ainsi, l’invalidation du gène ErbB1 est létale au stade embryonnaire ou périnatal, les souris montrant de nombreuses anomalies au niveau du cerveau, de la peau, des poumons et du tractus gastro-intestinal (Miettinen et al. , 1995). Les souris ErbB2 -/- meurent au milieu de la gestation en raison de malformations cardiaques, un phénotype aussi observé chez les souris ErbB4 -/- (Gassmann et al. , 1995; Lee et al. , 1995). Une rôle additionnel de ErbB2 dans le développement du système nerveux périphérique a été montré (Miettinen et al. , 1995). Les souris ErbB3 -/- meurent également de malformations cardiaques et montrent un défaut de formation de la crête neurale et une absence de précurseurs des cellules de Schwann (Riethmacher et al. , 1995).

Ces études démontrent clairement le rôle essentiel de la voie des récepteurs ErbB dans l’embryogenèse et le développement des Vertébrés. L’expression différentielle des récepteurs ErbB1-4 et de leurs différents ligands permet le contrôle sélectif de multiples processus incluant la détermination du destin cellulaire, la prolifération, la motilité et la survie cellulaire (Schlessinger, 2000). Ainsi, chez l’embryon, les NRG-1 sont exprimées dans l’endocarde alors que les NRG-2 sont présentes dans le muscle squelettique embryonnaire, et que les NRG-3 se retrouvent dans les neurones sensoriels, sympathiques et moteurs (Burden et Yarden, 1997). Le principal site d’expression des NRG-3 est le système nerveux en développement (Holmes et al. , 1992), et leur expression est restreinte aux neurones (Chen et al. , 1994; Corfas et al. , 1995; Zhang et al. , 1997), où leur disponibilité détermine la différenciation de certains types cellulaires via des interactions cellule-cellule locales (Buonanno et Fischbach, 2001). Leur champ d’action est relativement peu étendu : les cellules synthétisant les NRG et le tissu récepteur sont juxtaposés ou situés à quelques couches cellulaires de distance. Les neurégulines secrétées par les neurones favorisent la survie des cellules gliales, leur prolifération et leur différenciation en se liant aux récepteurs ErbB exposés à la surface cellulaire des cellules gliales (Garratt et al. , 2000). Notamment, les NRG produites par les neurones induisent la prolifération et la survie des cellules de Schwann (Morrissey et al. , 1995). D’autre part, l’interaction entre les NRG et leurs récepteurs contrôle la migration des neurones le long des cellules radiales gliales. Ainsi NRG est exprimée dans les cellules granulaires du cervelet et ErbB4 dans les cellules gliales de Bergmann, maintenant le phénotype radial nécessaire à la continuation de la migration (Rio et al. , 1997). Lorsque la migration s’achève, la sécrétion de NRG cesse et les cellules gliales radiales adoptent un phénotype astrocytaire (Rio et al. , 1997).

Tout comme chez les Vertébrés, la voie des EGFR est nécessaire à de nombreuses étapes du développement de la Drosophile, notamment pour l’établissement de l’axe antéro-postérieur de l’embryon, pour le contrôle du destin cellulaire durant le développement des disques embryonnaires et imaginaux, ainsi que durant l’oogenèse (Klambt, 2000). Comme nous l’avons montré dans les paragraphes précédents, l’activation de la voie du DER dépend du clivage par RIP des précurseurs de ses ligands transmembranaires du DER : Spitz, Keren, Gurken et Vein (cf. 1.4.2). Cette activation par RIP est assurée par la famille des Rhomboids. L’expression différentielle des différentes Rhomboids et des ligands permet de restreindre spatialement et temporellement l’activation de la voie des EGFR dans l’embryon. Dans l’oocyte, le ligand Gurken dont le clivage est assuré par Rhomboid-2 régule l’établissement de l’axe antéro-postérieur et dorso-ventral de l’oocyte (Ghiglione et al. , 2002). Ensuite, après la gastrulation, l’activation de Spitz par RIP est restreinte aux cellules de la ligne médiane de l’axe dorso-ventral qui expriment Rhomboid-1, induisant la formation de l’ectoderme ventral (Golembo et al. , 1996). L’activation de la voie des EGFR est aussi cruciale pour le développement de deux tissus post-embryonnaires : les disques imaginaux alaires et oculaires. La phase proliférative initiale est initiée dans tout le disque alaire et oculaire par une large activation de la voie des EGFR. La phase suivante implique la formation des veines dans l’aile et des ommatidies dans l’œil. Ainsi, Rhomboid-1 et Rhomboid-3 coopèrent dans les disques oculaire et alaire pour induire d’une part la formation des ommatidies et d’autre part la formation des veines alaires (Sturtevant et al. , 1993). Récemment, il a été montré qu’au cours du développement du système nerveux, Spitz et Vein agissent comme des facteurs trophiques secrétés, maintenant respectivement la survie d’une sous-population de cellules gliales de la ligne médiane et d’une sous-population de cellules longitudinales (Hidalgo et al. , 2001; Bergmann et al. , 2002). Dans les deux cas, les facteurs trophiques sont secrétés par les axones adjacents à des concentrations suffisantes pour la survie sélective de la sous-population gliale cible (Hidalgo et al. , 2001; Bergmann et al. , 2002). Le parallèle est frappant avec le rôle trophique des neurégulines des Vertébrés dans le contrôle de la survie des cellules gliales radiales au cours de la migration neuronale (cf. paragraphe précédent).

Chez les Vertébrés et les Invertébrés, l’activation de la voie des EGFR contrôle de multiples processus cellulaires via la cascade des Ras/Raf/MAP kinases impliquées notamment dans le développement. Chez la Drosophile, la RIP-protéase Rhomboid est nécessaire pour l’activation de la voie des EGFR en clivant les ligands du DER. Des homologues de Rhomboid ont été clonés chez les Vertébrés, mais leur rôle cellulaire n’est pas encore connu. Parmi ces homologues se retrouve la protéine PARL. L’étude de nouveaux éléments régulateurs de la voie des EGFR des Vertébrés permettrait de mieux comprendre cette voie de signalisation essentielle.

La protéine PARL ( Presenilins-AssociatedRhomboid-Like protein ) a été récemment découverte lors d’un criblage d’une librairie d’ADNc de cerveau adulte humain. Le but de ce criblage était l’identification de protéines interagissant avec les extrémités C-terminales des présénilines PS-1 et PS-2, par le biais d’un système de double-hybride en Levure (Pellegrini et al. , 2001). Le fragment d’ADNc isolé a servi de sonde pour isoler l’ADNc pleine longueur de PARL, à partir d’une librairie d’ADNc de foie humain (Pellegrini et al. , 2001). La protéine PARL humaine est un polypeptide de 379 aa correspondant à un poids moléculaire estimé de 42 kDa. Par transcription in vitro , l’ADNc de PARL génère une unique protéine d’environ 40 kDa. Le domaine d’interaction avec les présénilines est situé en aval du résidu 88, c’est à dire dans la partie C-terminale de la protéine. L’analyse de la séquence de PARL prédit que sa partie N-terminale est un domaine hydrophile de 96 aa de structure globulaire qui comprendrait des hélices-α. L’extrémité C-terminale de 33 aa serait positivement chargée (Koonin et Pellegrini, résultats non publiés).

Une recherche d’homologie entre PARL et des protéines connues recensées dans les banques de données montre qu’elle présente des similarités significatives avec des protéines prédites pour être membranaires chez les eucaryotes, archæbactéries et les bactéries. Une recherche itérative utilisant le programme PSI-BLAST démontre une relation statistiquement significative entre PARL et Rhomboid-1 (Pellegrini et al. , 2001). Une analyse du profil d’hydrophobicité de PARL prédit qu’elle appartient à une famille de protéines à segments transmembranaires multiples ( multipass ) (Figure 1-9), hautement conservée évolutivement.

Figure 1- 9 : Prédiction des hélices transmembranaires de la protéine PARL à partir de sa séquence analysée par TMHMM

La séquence protéique de PARL est analysée avec le programme TMHMM (http:// www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/). Le programme établit son profil d’hydrophobicité et en déduit la probabilité d’existence d’hélices transmembranaires, de domaines extracellulaires et intracellulaires. PARL possède de nombreuses hélices transmembranaires assimilées à sept domaines transmembranaires numérotés TM1 à TM7.

De manière très intéressante, la séquence de PARL porte le motif consensus catalytique GASGA décrit chez Rhomboid-1 (Urban et al. , 2001; Lammich et al. , 2002). Très récemment, un orthologue de PARL a été identifié chez la Levure. Cet orthologue Pcp1 porte également les acides aminés catalytiques décrits chez Rhomboid-1 (Esser et al. , 2002). Pcp1 serait une protéase qui participerait au clivage du précurseur de la cytochrome c péroxydase durant son import dans la mitochondrie (Esser et al. , 2002). PARL pourrait donc être aussi une RIP-protéase et assurer une fonction essentielle chez les Vertébrés.

Des analyses en Northern Blot montrent que le gène de PARL est exprimé de manière ubiquitaire dans tous les tissus adultes et fœtaux testés, mais à des niveaux différents (Pellegrini et al. , 2001). Des études immunocytochimiques de localisation subcellulaire montrent que la protéine PARL est présente dans la membrane plasmique et aussi dans la membrane de plusieurs organelles et colocalise avec les présénilines (Pellegrini et al. , 2001).

L’identification de la protéine PARL, une protéine homologue à Rhomboid, est placée dans un contexte très intéressant. En effet, la protéolyse intramembranaire régulée est un paradigme émergent en matière de transduction du signal qui semble réguler des voies cellulaires essentielles pour la survie cellulaire ou le développement des organismes, et ce à tous les niveaux évolutifs. La caractérisation de cette nouvelle protéine PARL chez les Vertébrés a donc fait l’objet de mes travaux de doctorat.

Dans un premier temps, nous nous sommes intéressés à la fonction biochimique de PARL. Vu sa similarité avec Rhomboid-1 et la présence du motif catalytique GASGA sur la séquence de PARL, nous avons émis l’hypothèse que PARL est une sérine-protéase assurant la protéolyse intramembranaire régulée. Pour valider cette hypothèse, nous avons conduit une analyse phylogénétique et bioinformatique complète.

L’analyse phylogénétique a montré l’appartenance de PARL a une nouvelle famille de RIP-protéases, ce qui laisse suggérer son implication dans des voies de signalisation essentielles pour la survie ou le développement cellulaire puisque toutes les RIP-protéases caractérisées jusqu’à maintenant sont impliquées dans de telles voies. Nous avons développé plusieurs anticorps dirigés contre la protéine PARL, qui nous ont permis de mieux caractériser PARL en western-blot et immunohistochimie. Nous avons étudié sa distribution subcellulaire dans des extraits de cerveau par western-blot. Puis nous avons étudié le profil d’expression de PARL au cours du développement postnatal du cerveau de rongeurs. D’autre part, par l’utilisation de co-marquages, nous avons pu préciser les types cellulaires exprimant PARL.

Nos résultats suggèrent l’implication de PARL dans le développement du cerveau. Cependant, sa voie de signalisation cellulaire reste inconnue. L’identification de protéines interagissant avec PARL, comme son substrat, ses protéines inhibitrices ou régulatrices, pourrait nous permettre de préciser la voie cellulaire dans laquelle elle est impliquée. Dans cette perspective, nous avons mis en place un système de double-hybride en Levures, pour détecter les partenaires cellulaires potentiels de PARL.