La synthèse des anticorps dirigés contre PARL a été confiée à la compagnie Covance (Princeton, NJ, USA). Les peptides utilisés pour l’immunisation correspondent à des fragments extramembranaires de la protéine et ont été choisis par analyse bioinformatique en fonction de leur immunogénicité potentielle et de leur conservation évolutive. Ainsi, les séquences des trois épitopes sont conservées chez l’humain, le rat et la souris, ce qui permet leur utilisation chez les Rongeurs. Le peptide baptisé 4NT est situé dans le domaine extramembranaire N-terminal en position aa54-69 (RKAPRKVEPRRSDPGT). Le deuxième peptide baptisé T2 est situé dans la première boucle extramembranaire, entre le TMH1 et le TMH2 en position aa143-152 (IRPQKEGDFR), et enfin le dernier peptide baptisé 4CT est situé en position C-terminale extrême : aa 367-379 (IRTNGPKKGGGSK). Deux lapins NZW ont été immunisés avec chacun des peptides synthétiques correspondant. Après chaque immunisation, la compagnie nous envoie un échantillon de sérum que nous testons pour déterminer le moment adéquat où la réponse immunitaire de l’animal est maximale avant le sacrifice de l’animal. Après collecte du sérum total, nos anticorps ont été purifiés suivant deux modes : sur colonne d’affinité munie de protéine A pour isoler les IgG ou sur colonne d’affinité munie des peptides ayant servi à l’immunisation pour isoler les IgG spécifiquement dirigées contre PARL. Nous avions donc trois types de préparation pour chaque anticorps : sérum natif, sérum purifié avec la protéine A, et sérum purifié avec le peptide correspondant. Les trois anticorps ont d’abord été testés en western-blot de façon à déterminer leur spécificité. Pour chaque anticorps, les trois préparations ont été testées pour vérifier la spécificité ainsi que la concentration optimale à utiliser en western-blot et en immunohistochimie (cf. 2.4.3).

Pour tester la spécificité des anticorps nous avons mis au point un système de compétition de l’anticorps avec son épitope, système utilisant des protéines de fusion entre un fragment de la protéine PARL portant le peptide reconnu par l’anticorps testé et la Gluthatione-S-Transférase (GST). Par exemple pour l’anticorps 4NT dirigé contre le peptide aa 54-69, la séquence codant pour PARL aa 1-96 a été sous-clonée à partir de la construction préexistante pEG202/HP1-96 dans le même cadre que la GST du vecteur pGex-6P1 (sites EcoRI/XhoI; Amersham Biosciences), pour générer la construction pGex-6P1/HP1-96. Puis les protéines recombinantes sont exprimées dans les BL21 et purifiées sur colonne d’affinité (cf. 2.2.3). L’anticorps 4NT est alors préincubé 1 h. 30 min sous rotation constante à 4ºC avec les protéine recombinantes fixées sur les billes de sépharose, dans un volume total de 500μL de tampon TBS. Il faut compter environ 150 μg de protéine recombinante pour assurer la compétition de 1 μL d’anticorps.

Trente-deux souris C57BL/6 réparties en huit groupes d’animaux ont été utilisées pour cette étude. Un groupe de souriceaux nouveau-nés (P0, n=5), un groupe âgé de 2 j. (P2, n=4), un groupe âgé de 4j. (P4, n=4), un groupe âgé de 7 j. (P7, n=4), un groupe âgé de 11 j. (P11, n=3), un groupe âgé de 14 j. (P14, n=3), un groupe âgé de 21 j. (P21, n=3) et enfin un groupe de souris âgées de 60 j. (P60, n=3), considérées comme adultes. Les animaux sont profondément anesthésiés avec un mélange de Kétamine-Xylol (40 mg/Kg, i.p.). Le thorax est incisé pour accéder au cœur et aux principaux vaisseaux sanguins. La solution de saline (NaCl 0.9%) doit couler goutte à goutte sans bulles d’air (vitesse du flux environ 5 mL/ min). Couper l’extrémité du ventricule gauche et y insérer la canule et la clamper. Couper l’oreillette droite pour permettre à la solution de saline de laver le sang avant de commencer la fixation. Lorsque le foie et les poumons apparaissent vidés de leur sang et que la solution de saline qui ressort est exempte de sang, changer de solution par la solution de fixatif de Zomboni (4% paraformaldéhyde, 15% acide picrique, dans du tampon phosphate (PB) 0.1M, pH=7.4). Laisser fixer 10 min Le cerveau est immédiatement enlevé du crâne, post fixé 1 h 30 min dans la solution de fixation, puis immergé dans une solution cryoprotective (NaH2PO4 5 mM, Na2HPO4 50 mM, glycérol 20% m/v, éthylène glycérol 30% m/v) pour être conservé à -20°C. Le cerveau est ensuite coupé longitudinalement en sections de 50 μm au vibratome. Les sections sont rincées dans du PB 0.1 M.

Trois souris C57BL/6 ont reçu 4 injections de 5-bromo-2’-deoxyuridine (BrDU, Sigma) à raison de 75 mg/Kg à 2 h. d’intervalle. La solution stock de BrDU est à 10 mg/ mL dans du Chlorure de Sodium à 0.9%. Pour faciliter la dissolution du BrDU, la solution est chauffée à 37°C. Le pH est ensuite ajusté à 7. Les animaux sont sacrifiés 24 h. après la dernière injection et perfusés comme décrit précédemment. Après post-fixation 1 h. 30 min dans la solution de fixation, le cerveau est sectionné longitudinalement en tranches de 50 μm. Pour révéler le BrDu, les sections doivent être pré-traitées avant immunohistochimie. Les sections sont incubées 30 min à 37°C dans du HCl 2 N. Pour rééquilibrer leur pH, elles sont ensuite incubées 10 min à la température de la pièce dans une solution de Borax (acide borique 0.1 M, pH 8.5), puis rincées 10 min dans du PB avant immunofluorescence classique.

Le profil d’expression de la protéine PARL dans le cerveau de souris a été étudié en immunohistochimie. L’ensemble des séra anti-PARL à notre disposition a été testé pour déterminer l’anticorps qui fonctionne le mieux pour détecter PARL en immunohistochimie, ainsi que la concentration optimale à utiliser. Plusieurs protocoles de perfusion utilisant des fixatifs différents, et ce sur différentes lignées de souris ont été également testés pour obtenir un marquage optimal. Seul l’anticorps 4NT dirigé contre l’extrémité N-terminale de PARL utilisé à une dilution de 1/3,000 sur des sections de cerveau de souris C57BL/6 perfusées avec le fixatif de Zomboni nous a permis d’obtenir un profil d’expression reproductible.

Le marquage au DAB est une technique alterne à l’immunofluorescence qui permet de visualiser la liaison d’un anticorps sur des sections. La procédure initiale est la même qu’en 2.4.3 jusqu’à l’étape de l’anticorps secondaire. Ici, on utilise un anticorps secondaire biotinylé (1/1,000) dilué dans du TBS. Les sections sont incubées 1 h. 30 min avec le secondaire puis rincées 3 fois avec du TBS. Pendant le lavage, préparer une solution ABC (Kit Vectastain, Vector laboratories) en diluant les solutions A et B du kit au 1/1000ème dans du TBS. Laisser 30 min Incuber les sections avec la solution ABC pendant 1 h. Laver trois fois avec du TBS. Préparer la solution de DAB-Ni (100 mL PB 0.01M + 28-35 mg DAB + 40 mg NH4Cl+ 5 mL NiNH4SO4 0.05 M). Enlever le dernier lavage et recouvrir les sections avec la solution de DAB-Ni. Laisser la solution pénétrer 20 min, puis ajouter 10 μL d’une solution d’H2O2 obtenue en diluant 10 μL de H2O2 à 30% dans 10 mL de ddH2O2 jusqu’à développement de la coloration. Interrompre la réaction en enlevant la solution de DAB-Ni. Rincer plusieurs fois avec du PB avant de monter sur lame.

La compétition de l’anticorps 4NT est réalisée en suivant la procédure décrite en 2.3.2.

Le système de double-hybride développé chez la Levure Saccharomyces cerevisiae ( Yeast Two-Hybrid ou Y2H) est un système très puissant et très sensible pour identifier les gènes codant pour des protéines interagissant physiquement (protéines proie ou cible) avec une protéine donnée (protéine appât) (Fields et Song, 1989; Chien et al. , 1991). Le Y2H exploite le fait que le facteur de transcription bactérien LexA possède un domaine de liaison à l’ADN (LexA DNA-BD) distinct de son domaine d’activation B42 (B42AD) (Figure 2-1). Des sites de liaison de la protéine LexA peuvent être placés en amont de gènes rapporteurs comme les gènes LacZ et LEU2, et introduits dans une souche de S. cerevisiae . L’expression de ces gènes ne sera activée qu’en présence du facteur de transcription bactérien LexA fonctionnel, c’est à dire muni du DNA-BD et du B42AD. Pour détecter une interaction physique entre deux protéines X et Y, on peut coexprimer chez S. cerevisiae des protéines de fusion LexA DNA-BD/ProtéineX (appât) et B42AD/ProtéineY (protéine cible d’une librairie d’ADNc par exemple). Si les deux protéines X et Y interagissent physiquement, le DNA-BD et B42AD seront réunis et l’activation de la transcription sera possible (Figure 2-1).

Nous avons choisi d’utiliser un système de Y2H très sensible de façon à pouvoir détecter les interactions faibles ou transitoires, comme le substrat ou les protéines régulatrices de PARL. Dans le système DupLEX-A Y2H (Origene), les deux gènes rapporteurs utilisés, LacZ et LEU2 , sont deux constructions séparées. Le gène LEU2 est précédé de 6 copies de l’opérateur LexA et intégré dans le génome de la souche de Levure EGY48 auxotrophe à la leucine et n’exprimant pas la β-galactosidase de manière constitutive. Le gène LacZ est précédé de 8 copies de l’opérateur LexA et porté par le plasmide rapporteur p8op-LacZ. Les multiples opérateurs LexA permettent la liaison de nombreuses protéines DNA-BD/appât sur chacun des promoteurs, ce qui amplifie l’intensité des signaux même faibles (Golemis, 1996). Il est à noter que la grande sensibilité du système augmente le risque de détecter des interactions aspécifiques et donc le nombre de faux positifs.

Figure 2- 1 : Principe du système de double-hybride en Levures

Cependant, l’utilisation conjointe de deux gènes rapporteurs pallie ce problème. En effet, pour que l’interaction soit positive, les clones sélectionnés devront être capables d’activer simultanément les deux gènes rapporteurs bien qu’ils soient munis de promoteurs différents. Ceci contribue à une réduction du nombre de faux positifs. Ainsi, la positivité de l’interaction entre PARL et le candidat potentiel de la librairie est détectée par la prototrophie à la leucine restaurée par activation du gène rapporteur LEU2 , ainsi que par l’activation du gène LacZ . L’activation de Lac Z peut être suivie par l’addition de X-Gal dans le milieu de culture. L’hydrolyse de ce substrat chromogène par la β-galactosidase codée par le gène LacZ colore les colonies positives en bleu. D’autre part, l’intensité de la coloration bleue des colonies, traduisant l’activité β-galactosidase, peut être corrélée à la force de l’interaction, ce qui permet de discriminer les interactions faibles, intermédiaires ou fortes (Estojak et al. , 1995). La Figure 2-2 résume les différentes étapes du Y2H qui seront décrites en détail dans les paragraphes suivants.

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Figure 2-2 : Etapes du Y2H

Nous avons choisi de cribler deux librairies d’ADNc disponibles dans le commerce: une librairie d’ADNc de cellules HeLa dérivées d’un carcinome humain et une librairie d’ADNc de cerveau fœtal humain. Les ADNc de chaque librairie (Origene) ont été synthétisés à partir d’amorces oligo-dT, ce qui favorise la présence d’ADNc pleine longueur. Cette librairie est clonée unidirectionnellement dans le vecteur d’expression de levure pJG4-5. Ce vecteur permet l’expression de B42AD fusionné à un ADNc cible de la librairie. D’autre part, il permet de cribler des protéines potentiellement toxiques puisque son expression est inductible par le galactose.

Le criblage consiste d’abord à transformer la souche de levure EGY48[p8opLacZ;pEG202/appât] exprimant la protéine appât avec la librairie d’ADNc clonée dans le vecteur pJG4-5. Les transformants sont sélectionnés dans un milieu déplété en galactose, ce qui empêche l’expression de protéines toxiques de la librairie pendant cette première phase d’amplification du criblage. Les librairies Origene contiennent environ 3 x 106 ADNc indépendants, clonées dans le plasmide pJG4-5. En théorie, une librairie avec 3 x 106 ADNc indépendants contient des ADNc correspondant à des ARNm qui sont représentés, au sein de la population d’ARNm utilisée pour constituer la librairie, à une fréquence plus importante que 1 pour 3 x 106 molécules d’ARNm. Pour pouvoir isoler les ADNc de la librairie les plus rares, c’est à dire ceux dont la fréquence est rare, il est essentiel d’amplifier au moins le mêmes nombre de clones individuels de la librairie, soit obtenir au minimum 3.6 x 106 transformants dans la phase d’amplification. Une très forte efficacité de transformation s’avère donc nécessaire pour garantir une bonne représentation de la banque d’ADNc. Avant de procéder à la transformation de la librairie, dans un premier temps, nous avons optimisé le protocole de transformation présenté en 2.5.2 et ajouté des étapes supplémentaires présentées ci-dessous. Ensuite, des transformations pilotes ont été réalisées pour obtenir l’efficacité de transformation moyenne. Typiquement, nous avons obtenu des efficacités de 0.5 x 105 transformants/μg d’ADN de la librairie. Ceci nous a permis d’évaluer le nombre de transformations individuelles à réaliser pour obtenir 2-3 x 106 transformants (i.e. 40(!) par librairie). Les solutions de transformation sont ensuite étalés sur des boîtes de 22 x 22 cm de DOB (H-T-U-), en essayant d’obtenir 1-2 x 105 transformants/boîte. Le nombre de transformations individuelles à étaler sur chaque boîte est calculé à partir de l’efficacité de transformation moyenne dérivée des expériences pilotes. Il faut absolument éviter d’avoir trop de transformants par boîte, sinon les clones auront du mal à croître et la librairie sera mal représentée.

Inoculer une pré-culture de 5 mL avec une colonie de la souche EGY48[p8opLacZ;pEG202/appât] dans le milieu sélectif approprié DOB (H-U-). Incuber dans le shaker jusqu’à croissance saturée (30°C, 270 rpm, toute la nuit). Le matin, mesurer la DO600 de la culture. Faire une dilution appropriée de la culture de la nuit dans une flasque de 250 mL stérile contenant 50 mL de milieu YPD préchauffé à 30°C pour obtenir une DO600 finale de 0.2. Incuber à 30°C, en agitant à 200 rpm, jusqu’à ce que DO600 =1. Transférer la culture dans un Falcon 50 mL et centrifuger (3,000 rpm, 2 min). Enlever le milieu rapidement mais soigneusement et absorber les dernières gouttes en renversant le tube sur un papier absorbant. Ajouter 10 mL de ddH2O stérile. Resuspendre les cellules en inversant le tube plusieurs fois. Ne pas vortexer sinon l’efficacité de transformation sera moindre. Centrifuger (3,000 rpm, 2 min), enlever l’eau. Resuspendre les cellules dans 5 mL de LiOAc/TE (LiOAc 0.1 M pH 7-7.4, TrisHCl 10 mM pH 7.5, EDTA 1 mM) en inversant le tube plusieurs fois. Centrifuger (3,000 rpm, 2 min), enlever le surnageant. Resuspendre les cellules dans 250 μL de LiOAc/TE en inversant le tube plusieurs fois. Centrifuger (3,000 rpm, 2 min), enlever le surnageant. Resuspendre les cellules dans 250 μL de LiOAc/TE en inversant le tube plusieurs fois. Pour chaque transformation, aliquoter 50 μL de cellules dans des tubes Eppendorf. Ajouter 1 μg d’ADN de la librairie, ainsi que 15 μg d’ADN porteur qui va faciliter l’entrée de l’ADN de la librairie dans les cellules. L’ADN porteur utilisé est issu de sperme de saumon (Eppendorf), la solution stock est à 30 μg/μL et doit être dénaturée (10 min, 100ºC) avant utilisation. De plus, on ajoute également du DMSO (10% final) au milieu de transformation pour augmenter l’efficacité de transformation. Mélanger doucement mais de manière homogène les cellules et l’ADN. Ajouter 300 μL de PEG dilué à 40% dans du LiOAc/TE. Mélanger en inversant les tubes plusieurs fois. Ne pas vortexer, le PEG fragilise les cellules. Incuber à 30°C pendant 30 min Pendant ce temps, préparer un bain à 42°C, préchauffer les boîtes de Pétri en les plaçant dans l’incubateur à 30°C. Incuber les cellules à 42°C pendant 30 min Juste après le choc thermique, les cellules sont resuspendues dans 10 mL/tube de transformation de YPD préchauffé à 30°C et placées dans le skaker ( 2 h., 200 rpm, 30°C) dans une grande flasque de 250 mL pour favoriser l’oxygénation des cellules. Après ces 2h., ne pas oublier d’étaler 100 μL, 10 μL et 1 μL de la solution sur trois boîtes de Pétrie séparées (DOB H-T-U), pour pouvoir vérifier ultérieurement l’efficacité de transformation. Puis les cellules sont centrifugées (3,000 rpm, 2 min) et resuspendues dans un volume de DOB H-T-U- liquide permettant d’étaler 1 mL de solution/ boîtes de 22 x 22cm de milieu sélectif DOB H-T-U- maximum. Pour assurer une distribution homogène des clones, déposer la solution de transformants sur le milieu et verser une centaine de billes de verres (diamètre 4 mm) préalablement autoclavées. Faire rouler les billes doucement autour de la boîte pour distribuer uniformément la solution de transformation, puis transvaser les billes dans la boîte suivante. Cette technique marche seulement si la surface des boîtes n’est pas trop humide, de manière à ce que le milieu puisse absorber la solution. Pour assécher légèrement le milieu, il suffit de placer les boîtes fraîchement coulées 1 h. sous la hotte à flux laminaire avant l’emploi. Les boîtes sont ensuite incubées à 30°C. Les colonies commencent à apparaître dès 24 h. Continuer l’incubation jusqu’à ce qu’elles atteignent 1-2 mm de diamètre, soit 48 h. après. Ensuite, utiliser une lame de microscope 75 x 50 mm stérile prise sur sa longueur pour gratter et collecter l’ensemble des transformants dans un tube Falcon. Eviter d’inclure des morceaux d’agar qui gêneraient le pipettage ultérieur. Rincer les transformants deux fois avec 3 volumes de TE1X en centrifugeant entre chaque lavage (2 min, 3,000 rpm). Les transformants sont finalement resuspendus dans du DOB H-T-U- liquide additionné de 10% de glycérol, comptés, puis congelés en aliquotes de 1 mL à -80ºC.

Il s’agit maintenant de tester ces transformants pour l’activation des gènes rapporteurs, en présence de galactose qui va induire l’expression de la protéine de la librairie. Pour être sûr de cribler également les ADNc faiblement représentés dans la population amplifiée à l’étape précédente, nous avons décidé de cribler 10x le nombre d’ADNc individuels représentés dans la librairie, soit 10x le nombre de transformants obtenus à l’étape précédente. Environ 10x le nombre de transformants obtenus est étalé sur des boîtes de 22 x 22cm le milieu sélectif DOB H-T-U-L-, enrichi en galactose et en X-Gal+, à une densité de 2-3 x 106 transformants/boîte maximum. Les boîtes DOB H-T-U-L- X-Gal+ sont incubées 2-5 j. à 30ºC, jusqu’à ce que des colonies se développent, la croissance étant ralentie dans le milieu X-Gal.

En raison de leur paroi épaisse et résistante et du faible nombre de copies de plasmides présents dans les Levures, il est difficile d’obtenir un bon rendement lors de l’extraction d’ADN plasmidique. Pour obtenir un bon rendement d’extraction de l’ADN plasmidique des clones positifs pour le criblage, nous utilisons un kit (Bio101) qui permet d’obtenir typiquement 100 μL de minipreps d’ADN à 20 ng/μL .

La solution d’acides nucléiques de Levures obtenue en suivant la procédure précédente est constitué majoritairement d’ARN et d’ADN génomique. Seule une petite proportion correspond à l’ADN plasmidique de la librairie. C’est pourquoi il est nécessaire d’amplifier ce matériel plasmidique. Une première amplification est réalisée dans la souche d’ E. coli KC8 qui présente la particularité d’être auxotrophe au tryptophane (T-), ce qui va permettre la sélection des bactéries ayant intégré le plasmide pJG4-5 portant l’ADNc de la librairie. Les bactéries compétentes KC8 sont préparées selon la méthode décrite précédemment (cf. 2.2.2.6), cependant cette souche a des efficacités de transformation très faible (de l’ordre de 103 transformants/μg d’ADN). Pour pallier ce problème, il s’est avéré nécessaire de doubler la quantité de cellules dans les aliquotes de transformation, d’autre part, nous avons utilisé 15 μL de miniprep de Levures/transformation (soit environ 300 ng d’ADN total/transformation) pour augmenter la quantité d’ADN plasmidique. Enfin, après la transformation des KC8 suivant la méthode du choc thermique décrite précédemment, les cellules sont centrifugées (8,000 rpm, 1 min), resuspendues dans 100 μL de ddH2O et la totalité de la solution est étalée sur le milieu sélectif. Le milieu utilisé est le milieu minimal M9 déplété en tryptophane qui permet la sélection des transformants qui sont complémentés par le gène de prototrophie au tryptophane présent sur le plasmide de la librairie. Les boîtes sont incubées 2 j. à 37ºC pour permettre aux colonies une croissance suffisante pour être observable. Parmi les transformants, une colonie est sélectionnée et repiquée dans 2-3 mL de LB liquide. Une miniprep est réalisée à partir de cette culture. Là encore, le rendement est relativement faible, il s’agit d’aplifier une seconde fois le plasmide la librarie dans une nouvelle souche bactérienne les NovaBlue.

Pour réduire la consommation de bactéries compétentes, nous avons fait des aliquotes de 20 μL de bactéries Novablue compétentes que l’on transforme avec 5 μL de la miniprep de KC8, toujours selon la méthode du choc thermique. Ici, 1/5ème de la solution de transformation est étalée sur le milieu sélectif LB/ampi. Les boîtes sont incubées toute la nuit à 37ºC. Parmi les transformants, une colonie est sélectionnée et repiquée dans 2-3 mL de LB/ampi liquide. Une miniprep est réalisée à partir de cette culture. Typiquement, les rendements sont de l’ordre de 50 ng/μL. Cette miniprep contient le plasmide de la librairie contenant l’ADNc codant pour une protéine interagissant avec notre appât. Le plasmide est envoyé à séquencer en utilisant l’amorce pJG4-5sens au service de séquençage de l’Université Laval.