2 MATÉRIELS & MÉTHODES

Table des matières

Ce chapitre décrit l’ensemble des techniques et méthodes utilisées au cours de mon doctorat pour caractériser la protéine PARL. La première partie aborde la méthodologie mise en place pour réaliser les analyses bioinformatiques menées sur les membres de la super-famille Rhomboid. La deuxième partie présente les techniques de base de biologie moléculaire utilisées, le mode d’obtention des différentes constructions plasmidiques de PARL, la production de protéines recombinantes hétérologues et la technique de fractionnement sub-cellulaire. La troisième partie est consacrée à la génération des différents anticorps anti-PARL et au test de leur spécificité. La quatrième partie traite des techniques d’immunohistochimie utilisées pour visualiser PARL dans le cerveau de souris. Enfin, le cinquième et dernière partie présente la réalisation du système de double-hybride en Levures utilisé pour détecter les partenaires cellulaires de PARL.

Pour recenser l’ensemble des membres de la super-famille Rhomboid, nous avons conduit en étroite collaboration avec le Dr Koonin (NIH, Bethesda) une recherche itérative sur une banque de données non-redondante répertoriant les séquences protéiques connues ou inconnues (Altschul et al. , 1997). Pour cette recherche, nous avons utilisé le programme PSI-BLAST (http://www.ncbi.nih.gov/blast/) qui a permis de recenser une centaine de séquence présentant une similarité avec les séquences d’entrée. Nous avons ensuite procédé à l’alignement multiple de ces séquences en utilisant le programme ClustalW (http://www.bork.embl-eidelberg.de/Alignment/alignment.html) (Thompson et al. , 1994). L’alignement a été ajusté manuellement en se basant sur les résultats de la recherche par PSI-BLAST et les hélices transmembranaires multiples prédites par les programmes TMPRED et TMAP (http://www.ch.embnet.org/software/TMPRED_form.html et http://www.mbb.ki.se/TMap/).

L’arbre phylogénétique de la super-famille Rhomboid a été réalisé en utilisant la méthode du moindre carré (Fitch et Margoliash, 1967) comprise dans le programme FITCH du package PHYLIP (Felsenstein, 1996), avec des réarrangements des séquences utilisant le programme PROTML du package MOLPHY pour obtenir le maximum de similarité.

Ce type de préparation d’ADN permet de purifier environ 5 μg d’ADN plasmidique à partir d’une culture de la souche désirée de 2 mL (250 rpm, 37°C, toute la nuit), en utilisant le kit High Pure Purification Kit de Roche. Le matin, centrifuger la culture de 2 mL (Vmax, 5 min) et jeter le surnageant. Resuspendre le culot dans 400 μL de tampon de resuspension (glucose 50 mM, Tris-HCl pH 8 25 mM, EDTA 10 mM, RNaseA 10 μg/μL), soigneusement pour éviter les grumeaux qui empêcheraient une lyse homogène La présence de RNase est essentielle pour éviter la contamination de l’ADN plasmidique par de l’ARN. Après resuspension, ajouter 400 μL de tampon de lyse (NaOH 0.2 N, SDS 1%). Mélanger en inversant doucement le tube 4-5 fois jusqu’à ce que la solution prenne un aspect visqueux, signe que l’ADN est libéré. Ne jamais laisser agir plus de 5 min Pour arrêter la lyse, ajouter 400 μL de tampon de neutralisation (KOAc 3 M, acide acétique glacial 11% volume/volume (v/v)). Mélanger doucement en inversant le tube. La solution prend un aspect trouble, ce sont les protéines qui précipitent. Pour s’en débarrasser, centrifuger (12,000 rpm, 15 min, 4°C). Prélever le surnageant en évitant le culot blanchâtre de protéines et le placer sur la colonne. Centrifuger à vitesse maximale 30s. Rincer avec 800 μL de solution de lavage. Centrifuger deux fois pour éliminer toute trace résiduelle d’éthanol (Vmax, 30 s.). Eluer l’ADN en ajoutant 50μL de ddH2O au centre de la colonne puis centrifuger (Vmax, 30 s.). Quantifier en mesurant la DO. La concentration en ADN obtenue doit être autour de 100 ng/μL.

Ce type de préparation d’ADN permet de purifier environ 500μg d’ADN plasmidique à partir d’une culture de la souche désirée de 300 mL (250 rpm, 37°C, toute la nuit). Centrifuger la culture de 300 mL (4,000 rpm, 10 min). Enlever soigneusement le surnageant. (NB : A cette étape, le culot bactérien peut être congelé à -20°C et la procédure continuée ultérieurement). Le culot est resuspendu dans 5 mL de tampon de resuspension, soigneusement pour éviter les grumeaux qui empêcheraient une lyse homogène. La présence de RNase est essentielle pour éviter la contamination de l’ADN plasmique par de l’ARN. Après resuspension, 10 mL de tampon de lyse (NaOH 0.2 N, SDS 1%) sont ajoutés. Si le tampon de lyse apparaît turbide, le chauffer pour dissoudre le SDS. Le mieux est d’utiliser du tampon fait juste avant l’emploi. Mélanger immédiatement en inversant doucement le tube 4-5 fois jusqu’à ce que la solution prenne un aspect visqueux, signe que l’ADN est libéré. Incuber 2 min à température pièce. Ne jamais laisser agir plus de 4 min Pour arrêter la lyse, ajouter 5 mL de tampon de neutralisation (KOAc 3 M, acide acétique glacial 11% v/v). Mélanger doucement en inversant le tube. La solution prend un aspect trouble, ce sont les protéines qui précipitent. Incuber sur glace 10 min, puis centrifuger (12,000 rpm, 15 min, 4°C). Prélever le surnageant et le placer dans un tube Oakridge propre, en évitant de prélever le culot blanchâtre de protéines. Ajouter 0.6 v d’isopropanol et vortexer. Laisser précipiter à -20°C, 1 h. maximum sinon les protéines risquent de contaminer l’ADN en précipitant. Centrifuger (12,000 rpm, 15 min, 4°C). Enlever le surnageant et rincer soigneusement le culot avec de l’EtOH 70%, en évitant de le détacher de la paroi du tube. Centrifuger (12,000 rpm, 15 min, 4°C). Enlever le surnageant et laisser sécher le culot d’ADN à l’air libre. Puis le resuspendre dans 500 μL de ddH2O. S’il reste du matériel insoluble, centrifuger et transférer le surnageant dans un autre tube. Ajouter un volume équivalent de solution de PEG (PEG 20%, NaCl 2.5 M). La précipitation de l’ADN doit être quasi-immédiate, sinon incuber sur glace 1h. Centrifuger (12,000 rpm, 15 min, 4°C). Enlever le surnageant en éliminant les dernières gouttes de PEG. Resuspendre dans 500 μL de ddH2O. Si l’ADN se dissout mal, incuber 10 min à 37°C. Ajouter 1 v de phénol/chloroforme, vortexer 1 min. Puis centrifuger (Vmax, 5 min) et collecter rapidement la phase supérieure aqueuse qui contient l’ADN palsmidique, sinon la phase contenant le PEG va diffuser. Recommencer la procédure 3 fois, ou jusqu’à ce que la phase aqueuse soit claire. Ajouter un volume de chloroforme, centrifuger (Vmax, 5 min). Collecter la phase supérieure contenant l’ADN purifié. Ajouter 0.1 v d’acétate de sodium 3 M, pH 5.2. Mélanger doucement. Ajouter 3 v d’EtOH, l’ADN précipité devient visible. Laisser précipiter 30 min ou toute la nuit à -20°C. Centrifuger (12,000 rpm, 15 min, 4°C), enlever le surnageant et rincer le culot à l’EtOH 70%. Laisser le culot sécher à l’air libre, ou bien en utilisant l’arrivée d’air, puis le resuspendre dans 500 μL de ddH2O. Quantifier en mesurant la DO. La concentration en ADN obtenue doit être autour de 1 μg/μL.

La PCR permet l’amplification, grâce à des couples d’amorces spécifiques, d’une séquence d’ADN particulière située sur un ADNc d’intérêt. Dans le cas d’un clonage par PCR, il s’agit également d’introduire au niveau des extrémités de la séquence d’intérêt des sites de restriction adaptés pour permettre le clonage entre ces sites dans le vecteur d’expression. Nous avons fait synthétiser divers oligonucléotides (Gene Probe Technologies Inc., USA) de manière à pouvoir amplifier différentes régions de l’ADNc de PARL humaine et ajouter au niveau des inserts les sites de restriction voulus (Tableau 2-1). Les principes de base pour déterminer la séquence des amorces sont les suivants. Chaque amorce doit inclure au moins 17-18 bases complémentaires à la séquence de l’insert, pour garantir la spécificité de l’amplification. De plus, il est recommandé d’ajouter 1 ou 2 bases supplémentaires en 5’ pour protéger les sites de restriction d’une éventuelle activité exonucléasique de la Taq polymérase. Un codon-stop peut être ajouté dans l’amorce antisens, même si le vecteur contient déjà des codons stop en 3’ dans les trois phases de lecture, pour éviter l’ajout de quelques acides aminés supplémentaires en C-terminal. La température approximative d’hybridation (T°H) de chaque oligonucléotide est calculée en utilisant la relation : T°H= T°M[(A+T)x2+(G+C)x4] -5°C (A, nombre d’adénines; T, nombre de thymidines; G, nombre de guanines; C, nombre de cytosines de chaque amorce). La température d’hybridation retenue est généralement la T°H la plus basse des deux oligonucléotides. Il est conseillé d’essayer dans la mesure du possible d’avoir des oligos avec une T°H proche pour éviter l’amplification aspécifique.

Pour contrôler la qualité de la PCR, les produits d’amplification sont soumis à une électrophorèse sur gel d’agarose (cf. 2.2.1.2). Après migration, le gel est placé sous la lampe à UV. Pour éviter la dégradation de l’ADN sous l’influence des UV, une plaque protectrice en plexiglas est placée entre le gel et la source UV. Si la bande des produits d’amplification apparaît bien au poids moléculaire (PM) attendu, la bande d’intérêt est excisée du gel à l’aide d’une lame de rasoir et fractionnée en petits cubes, puis placée dans un eppendorf, et ensuite pesée. La masse en mg est assimilée au volume de gel. NB : Si le PM ne correspond pas ou si plusieurs bandes apparaissent, la stringence des conditions de PCR doit être modifiée. La température d’hybridation du programme peut être montée de façon à limiter l’hybridation aspécifique des amorces et l’amplification aspécifique subséquente. Ajouter l’équivalent de 3 v de tampon de solubilisation (tampon QX1, Qiagen). Placer 10 min à 50ºC pour favoriser la dissolution du gel. Ajouter 1 v d’isopropanol. Vortexer et placer sur la colonne d’absorption (colonne du kit High Pure DNA purification Kit, Roche). NB : Le tampon de solubilisation contient un indicateur de pH, la solution reste jaune si le pH est optimal pour l’adsorption sur la colonne (pH≤ 7.5). Par contre, lorsque le pH est trop élevé, la solution vire au rose. Dans ce cas, le pH doit être corrigé en ajoutant 10 μL d’acétate de sodium 3 M, pH 5. Centrifuger (Vmax, 1 min). Enlever le liquide résiduel, l’ADN est maintenant fixé sur la colonne. Rinser avec 500 μL de tampon de lavage, centrifuger (Vmax, 1 min). Enlever le tampon résiduel. Centrifuger (Vmax, 1 min) à nouveau pour éliminer les dernières traces d’EtOH. Eluer en ajoutant 50 μL de ddH2O au centre de la colonne. Puis centrifuger (Vmax, 1 min). Cette procédure permet de purifier environ 75% de l’ADN présent dans le gel pour des fragments de petites taille, et environ 50% pour les fragments de plus grande taille (≥ 1,000pb). Les fragments obtenus sont suffisamment purs pour pouvoir effectuer des digestions enzymatiques.

Ce type de criblage convient lorsque l’on procède à un clonage classique avec un fort taux de réussite. Une dizaine de clones sont sélectionnés, à partir desquels des minipreps d’ADN plasmidique sont préparées (cf. 2.2.1.1). Les minipreps sont ensuite digérées avec les enzymes de restriction correspondant aux sites d’insertion du clonage (cf. 2.2.2.4). Le produit de restriction est ensuite analysé par électrophorèse sur gel d’agarose (cf. 2.2.1.2). Les clones ayant intégré un plasmide muni de l’insert souhaité montreront deux bandes après restriction : le vecteur linéarisé et l’insert.

Le système utilisant la Glutathion S-transférase (GST) permet l’expression et la purification de protéines recombinantes produites dans Eschericia coli . Le système est basé sur l’expression inductible de fragments de gènes fusionnés avec la GST de Schistosoma japonicum , conduisant à la production de protéines de fusion contenant la GST en N-terminal et une protéine d’intérêt en C-terminal qui s’accumulent en grande quantité dans le cytoplasme des cellules. Les protéines fusionnées à la GST sont construites en insérant un fragment de gène dans le site de clonage multiple du vecteur pGEX-6P-1 (Amersham Pharmacia). L’expression est placée sous le contrôle du promoteur tac, induit par l’analogue du lactose isopropyl β-D thiogalactoside (IPTG). Le vecteur pGex-6P-1 contient également le gène lac Iq . Le produit de ce gène est une protéine répresseur qui lie la région de l’opérateur du promoteur tac , empêchant l’expression de la protéine de fusion en l’absence d’IPTG. Ceci permet un contrôle très fin de l’expression des protéines recombinantes. Des essais d’expression à petite échelle sont menés sur quelques dizaines de clones, de façon à sélectionner un clone présentant un bon rendement, avant de passer à l’expression sur un grand volume de culture bactérienne. Les protéines de fusion peuvent alors être purifiées à partir de lysats bactériens par chromatographie d’affinité utilisant du gluthation immobilisé sur billes de sépharose. En effet, la GST a une très forte affinité avec son substrat le gluthation, ce qui va permettre la capture des protéines de fusion GST sur les billes, les impuretés seront supprimés par plusieurs lavages. Cette phase de purification permet d’obtenir de très grandes quantités de protéine de fusion.

Nous avons mis au point plusieurs constructions codant pour différents fragments de PARL fusionnés à la GST, dans le vecteur pGex-6P-1 (Amersham Pharmacia). Les fragments de PARL correspondant aux aa1-96 (HP1-96), aa 121-170 (HP121-170) et aa317-379 (HP317-379) ont été amplifiés par PCR à l’aide des couples d’amorces spécifiques (Tableau 2-1). Ces amorces introduisent également les sites de restriction EcoRI en 5’ et BamHI en 3’, ce qui permet l’insertion des fragments dans les sites EcoRI/BamHI du vecteur pGex-6P-1, en phase avec la séquence codant la glutathione S-transférase (GST) présente en 5’ dans le vecteur. Le gène de résistance à l’ampiciline porté par le vecteur pGex-6P-1 permet la sélection des transformants.

Pour la production de protéines recombinantes, nous avions commencé à utiliser une souche bactérienne spécialement adaptée, les BL21 (Stratagene). Cependant les niveaux d’expression restaient très faibles, c’est pourquoi nous nous sommes tournés vers les BL21-CodonPlus (Stratagene), qui nous ont permis d’exprimer en grandes quantités des protéines hétérologues. Bien que la production efficace de protéines hétérologues soit souvent limitée par la disponibilité de certains ARN de transfert (ARNt) qui sont abondants chez l’organisme dont provient la protéine, la souche CodonPlus pallie ce problème. En effet, cette souche contient des copies supplémentaires des gènes des ARN de transfert qui sont normalement limitants. Ceci permet des forts niveaux d’expression de nombreuses protéines recombinantes qui sont normalement faiblement exprimées dans les BL21 classiques. Bien que les niveaux d’expression soient très variables dépendamment du type de protéines recombinante générée, on peut cependant tabuler sur un rendement moyen de 2.5 mg de protéines recombinantes purifiées/L de culture. La procédure décrite ci-dessus est valable pour 200 mL de culture induite, ce qui correspondrait à 0.5 mg de protéine recombinante purifiée en final.

Une préculture de la souche de BL21 prétransformée avec le vecteur d’expression d’intérêt (cf. 2.2.2.6) est ensemencée la veille au soir dans 2-3 mL de LB-ampi. Le matin, la préculture est diluée au 1/1,000ème dans 200 mL de LB-ampi et remise à pousser jusqu’à une DO600 comprise entre 0.3 et 0.6. A la DO désirée, l’induction de l’expression de la protéine de fusion est commencée par ajout de isopropyl-β-D-thiogalactoside (IPTG, Roche) à 0.2 mM final. La croissance est poursuivie 4h., puis la culture est transférée dans des Falcons 50 mL et centrifugée (10,000 rpm, température pièce (TP), 10 min) pour récupérer les culots bactériens.

  Les cellules sont lysées par 3 cycles de congélation/décongélation dans l’azote liquide. Les cellules sont soigneusement resuspendues dans 2 mL tampon de lyse (B-PER, Pierce) puis laissées sur la glace 10 min. La solution est ensuite centrifugée à vitesse maximum pendant 15 min pour faire culotter la fraction insoluble et séparer le surnageant contenant les protéines solubles et donc les protéines recombinantes. Pendant ce temps, 90 mg de billes d’agarose-GSH sont équilibrés dans 2 mL de tampon 1 (Tris-HCl 50 mM, pH 8) et laissées 10 min sur la glace, en agitant le tube régulièrement pour éviter la sédimentation des billes. Les billes sont réparties dans 3 tubes Eppendorfs (± 0.7 mL/tube), et centrifugées (3 min, 8,000 rpm, TP). Le surnageant est jeté et les billes resuspendues dans 0.5 mL de tampon 1, puis centrifugées à nouveau. La procédure est répétée une nouvelle fois. Un aliquote de 10 µL est prélevé du surnageant bactérien pour tester la quantité de protéines avant purification. Puis le surnageant bactérien est réparti dans les trois tubes contenant les billes, et incubé (1 h. 30 min, à 4°C, sous rotation constante) pour permettre la liaison des protéines recombinantes GST aux billes munies de gluthation. Ensuite, la solution est centrifugée (3 min, 8,000 rpm, TP). Un aliquote de 10µL est prélevé du surnageant pour tester la quantité de protéines résiduelles. Puis les billes sont rincées pour éliminer les liaisons aspécifiques : 2 fois dans 0.7 mL/tube de tampon 1, en prélevant un aliquote de surnageant à chaque fois, ensuite 1 fois dans 0.7 mL/tube de tampon 2 (Tris-HCl 50 mM, NaCl 150 mM, pH 8). Pour contrôler la qualité de la purification et la quantité de protéines purifiées, faire un gel SDS-PAGE avec les différentes fractions.  Chacun des trois tubes contient environ 150 μg de protéine recombinantes fixée sur les billes de sépharose.

Les quantités et volumes donnés sont valables pour 10 g de tissu frais, soit une vingtaine de souris sacrifiées. Après la collecte des cerveaux, toutes les opérations doivent être menées à 4°C pour limiter l’altération des tissus : manipulations des tissus et centrifugations comprises Toutes les solutions utilisées doivent être refroidies à 4°C dans un bain de glace avant utilisation.

Les animaux sont décapités et les cerveaux sont rapidement prélevés et placés dans 10 mL de tampon d’homogénéisation (sucrose 320 mM, HEPES-NaOH 4 mM, pH 7.3) contenant des inhibiteurs de protéases (Complete Inhibitor Protease Cocktail Tablets, Roche). Le tissu est séparé en plusieurs aliquotes et homogénéisé à l’aide d’un Potter en verre Téflon. L’homogénat (H) est centrifugé (10 min; 1,000 g) , le culot résultant contenant de larges fragments cellulaires et les noyaux (P1) est jeté, et le surnageant (S1) est collecté et centrifugé (15 min; 12,000 g). Le surnageant résultant (S2) contenant des petits fragments subcellulaires comme des microsomes, des fragments de myéline et des protéines solubles est enlevé. Le culot résultant (P2) est resuspendu soigneusement dans 6 mL de tampon d’homogénéisation en faisant des allers/retours avec la pipette, tout en évitant la partie brun sombre constituant la partie inférieure du culot et contenant les mitochondries. Centrifuger à nouveau (10 min; 11,000 g). Eliminer le surnageant (S2’). Le culot résultant (P’2) représente la fraction synaptosomale brute. Pour libérer les vésicules synaptiques des synaptosomes, resuspendre P’2 dans le tampon d’homogénéisation pour arriver à un volume final de 1 mL. Transférer cette fraction dans un Potter en verre Téflon, ajouter 9 volumes (9 mL) ddH2O, et faire plusieurs allers/retour du piston. Ajouter 200μL de tampon Hepes-NaOH (1 M, pH 7.4) et à nouveau des antiprotéases. Centrifuger la suspension (20 min; 33,000 g) pour récupérer la fraction culot lysé (LP1) et surnageant lysé (LS1). Séparer ces deux fractions très soigneusement, il est crucial que la fraction LS1 ne soit pas contaminée avec des traces de membranes provenant de LP1. LS1 est ensuite centrifugé (200 min; 260,000 g) pour obtenir les membranes légères incluant les vésicules synaptiques. Pour estimer la contamination entre les différents compartiments subcellulaires ainsi isolés, la présence de plusieurs marqueurs spécifiques aux compartiments est testée par western-blotting. La synaptophysine pour les vésicules synaptiques, la sous-unité NR1 du récepteur NMDA pour la membrane plasmique.

La synthèse des anticorps dirigés contre PARL a été confiée à la compagnie Covance (Princeton, NJ, USA). Les peptides utilisés pour l’immunisation correspondent à des fragments extramembranaires de la protéine et ont été choisis par analyse bioinformatique en fonction de leur immunogénicité potentielle et de leur conservation évolutive. Ainsi, les séquences des trois épitopes sont conservées chez l’humain, le rat et la souris, ce qui permet leur utilisation chez les Rongeurs. Le peptide baptisé 4NT est situé dans le domaine extramembranaire N-terminal en position aa54-69 (RKAPRKVEPRRSDPGT). Le deuxième peptide baptisé T2 est situé dans la première boucle extramembranaire, entre le TMH1 et le TMH2 en position aa143-152 (IRPQKEGDFR), et enfin le dernier peptide baptisé 4CT est situé en position C-terminale extrême : aa 367-379 (IRTNGPKKGGGSK). Deux lapins NZW ont été immunisés avec chacun des peptides synthétiques correspondant. Après chaque immunisation, la compagnie nous envoie un échantillon de sérum que nous testons pour déterminer le moment adéquat où la réponse immunitaire de l’animal est maximale avant le sacrifice de l’animal. Après collecte du sérum total, nos anticorps ont été purifiés suivant deux modes : sur colonne d’affinité munie de protéine A pour isoler les IgG ou sur colonne d’affinité munie des peptides ayant servi à l’immunisation pour isoler les IgG spécifiquement dirigées contre PARL. Nous avions donc trois types de préparation pour chaque anticorps : sérum natif, sérum purifié avec la protéine A, et sérum purifié avec le peptide correspondant. Les trois anticorps ont d’abord été testés en western-blot de façon à déterminer leur spécificité. Pour chaque anticorps, les trois préparations ont été testées pour vérifier la spécificité ainsi que la concentration optimale à utiliser en western-blot et en immunohistochimie (cf. 2.4.3).

Trente-deux souris C57BL/6 réparties en huit groupes d’animaux ont été utilisées pour cette étude. Un groupe de souriceaux nouveau-nés (P0, n=5), un groupe âgé de 2 j. (P2, n=4), un groupe âgé de 4j. (P4, n=4), un groupe âgé de 7 j. (P7, n=4), un groupe âgé de 11 j. (P11, n=3), un groupe âgé de 14 j. (P14, n=3), un groupe âgé de 21 j. (P21, n=3) et enfin un groupe de souris âgées de 60 j. (P60, n=3), considérées comme adultes. Les animaux sont profondément anesthésiés avec un mélange de Kétamine-Xylol (40 mg/Kg, i.p.). Le thorax est incisé pour accéder au cœur et aux principaux vaisseaux sanguins. La solution de saline (NaCl 0.9%) doit couler goutte à goutte sans bulles d’air (vitesse du flux environ 5 mL/ min). Couper l’extrémité du ventricule gauche et y insérer la canule et la clamper. Couper l’oreillette droite pour permettre à la solution de saline de laver le sang avant de commencer la fixation. Lorsque le foie et les poumons apparaissent vidés de leur sang et que la solution de saline qui ressort est exempte de sang, changer de solution par la solution de fixatif de Zomboni (4% paraformaldéhyde, 15% acide picrique, dans du tampon phosphate (PB) 0.1M, pH=7.4). Laisser fixer 10 min Le cerveau est immédiatement enlevé du crâne, post fixé 1 h 30 min dans la solution de fixation, puis immergé dans une solution cryoprotective (NaH2PO4 5 mM, Na2HPO4 50 mM, glycérol 20% m/v, éthylène glycérol 30% m/v) pour être conservé à -20°C. Le cerveau est ensuite coupé longitudinalement en sections de 50 μm au vibratome. Les sections sont rincées dans du PB 0.1 M.

Le profil d’expression de la protéine PARL dans le cerveau de souris a été étudié en immunohistochimie. L’ensemble des séra anti-PARL à notre disposition a été testé pour déterminer l’anticorps qui fonctionne le mieux pour détecter PARL en immunohistochimie, ainsi que la concentration optimale à utiliser. Plusieurs protocoles de perfusion utilisant des fixatifs différents, et ce sur différentes lignées de souris ont été également testés pour obtenir un marquage optimal. Seul l’anticorps 4NT dirigé contre l’extrémité N-terminale de PARL utilisé à une dilution de 1/3,000 sur des sections de cerveau de souris C57BL/6 perfusées avec le fixatif de Zomboni nous a permis d’obtenir un profil d’expression reproductible.

La co-expression de PARL avec les différents marqueurs de prolifération ou de différenciation a été visualisée par immunofluorescence simple et double, en utilisant l’anticorps 4NT dirigé contre l’extrémité N-terminale de PARL et les différents marqueurs.

Les sections humides sont d’abord montées sur lames recouvertes de gélatine. Après séchage à l’air libre, 15 min maximum pour éviter la détérioration de l’épitope, les sections sont préincubées (30 min, TP) dans une solution de saturation (sérum de chèvre normal 5% v/v, Triton X-100 0.5% v/v, Tampon Tris Salin (TBS) 0.05 M, pH 7.4) pour bloquer les liaisons aspécifiques, puis incubées (12 h., 4°C) dans une chambre humide avec un mélange d’anticorps polyclonal anti-PARL (4NT, 1 /2,000; Covance) et monoclonal anti-Nestin (1/500, Chemicon) ou anti-NeuN (1 /2,000; Chemicon) ou anti-GFAP (1/1,000; Sigma) ou anti-PCNA (1/3,000; Sigma), anti-βIII tubuline (TuJ-1, 1/1,000; Promega) dilués dans du TBS. Les sections sont ensuite rinsées dans du TBS 0.05 M et incubées (4 h., RT) avec un mélange d’anticorps secondaires anti-IgG de lapin couplés à un fluorochrome (AlexA488, 1/1,000, Molecular Probes) et anti-IgG de souris couplés à un autre fluorochrome (AlexA546, 1/1,000; Molecular Probes). Les sections sont ensuite analysées avec un microscope en fluorescence classique (Olympus) ou bien avec un microscope confocal (Zeiss Axioskop 2 FS Mot).

Le marquage au DAB est une technique alterne à l’immunofluorescence qui permet de visualiser la liaison d’un anticorps sur des sections. La procédure initiale est la même qu’en 2.4.3 jusqu’à l’étape de l’anticorps secondaire. Ici, on utilise un anticorps secondaire biotinylé (1/1,000) dilué dans du TBS. Les sections sont incubées 1 h. 30 min avec le secondaire puis rincées 3 fois avec du TBS. Pendant le lavage, préparer une solution ABC (Kit Vectastain, Vector laboratories) en diluant les solutions A et B du kit au 1/1000ème dans du TBS. Laisser 30 min Incuber les sections avec la solution ABC pendant 1 h. Laver trois fois avec du TBS. Préparer la solution de DAB-Ni (100 mL PB 0.01M + 28-35 mg DAB + 40 mg NH4Cl+ 5 mL NiNH4SO4 0.05 M). Enlever le dernier lavage et recouvrir les sections avec la solution de DAB-Ni. Laisser la solution pénétrer 20 min, puis ajouter 10 μL d’une solution d’H2O2 obtenue en diluant 10 μL de H2O2 à 30% dans 10 mL de ddH2O2 jusqu’à développement de la coloration. Interrompre la réaction en enlevant la solution de DAB-Ni. Rincer plusieurs fois avec du PB avant de monter sur lame.

La compétition de l’anticorps 4NT est réalisée en suivant la procédure décrite en 2.3.2.

Le système de double-hybride développé chez la Levure Saccharomyces cerevisiae ( Yeast Two-Hybrid ou Y2H) est un système très puissant et très sensible pour identifier les gènes codant pour des protéines interagissant physiquement (protéines proie ou cible) avec une protéine donnée (protéine appât) (Fields et Song, 1989; Chien et al. , 1991). Le Y2H exploite le fait que le facteur de transcription bactérien LexA possède un domaine de liaison à l’ADN (LexA DNA-BD) distinct de son domaine d’activation B42 (B42AD) (Figure 2-1). Des sites de liaison de la protéine LexA peuvent être placés en amont de gènes rapporteurs comme les gènes LacZ et LEU2, et introduits dans une souche de S. cerevisiae . L’expression de ces gènes ne sera activée qu’en présence du facteur de transcription bactérien LexA fonctionnel, c’est à dire muni du DNA-BD et du B42AD. Pour détecter une interaction physique entre deux protéines X et Y, on peut coexprimer chez S. cerevisiae des protéines de fusion LexA DNA-BD/ProtéineX (appât) et B42AD/ProtéineY (protéine cible d’une librairie d’ADNc par exemple). Si les deux protéines X et Y interagissent physiquement, le DNA-BD et B42AD seront réunis et l’activation de la transcription sera possible (Figure 2-1).

Nous avons choisi d’utiliser un système de Y2H très sensible de façon à pouvoir détecter les interactions faibles ou transitoires, comme le substrat ou les protéines régulatrices de PARL. Dans le système DupLEX-A Y2H (Origene), les deux gènes rapporteurs utilisés, LacZ et LEU2 , sont deux constructions séparées. Le gène LEU2 est précédé de 6 copies de l’opérateur LexA et intégré dans le génome de la souche de Levure EGY48 auxotrophe à la leucine et n’exprimant pas la β-galactosidase de manière constitutive. Le gène LacZ est précédé de 8 copies de l’opérateur LexA et porté par le plasmide rapporteur p8op-LacZ. Les multiples opérateurs LexA permettent la liaison de nombreuses protéines DNA-BD/appât sur chacun des promoteurs, ce qui amplifie l’intensité des signaux même faibles (Golemis, 1996). Il est à noter que la grande sensibilité du système augmente le risque de détecter des interactions aspécifiques et donc le nombre de faux positifs.

Cependant, l’utilisation conjointe de deux gènes rapporteurs pallie ce problème. En effet, pour que l’interaction soit positive, les clones sélectionnés devront être capables d’activer simultanément les deux gènes rapporteurs bien qu’ils soient munis de promoteurs différents. Ceci contribue à une réduction du nombre de faux positifs. Ainsi, la positivité de l’interaction entre PARL et le candidat potentiel de la librairie est détectée par la prototrophie à la leucine restaurée par activation du gène rapporteur LEU2 , ainsi que par l’activation du gène LacZ . L’activation de Lac Z peut être suivie par l’addition de X-Gal dans le milieu de culture. L’hydrolyse de ce substrat chromogène par la β-galactosidase codée par le gène LacZ colore les colonies positives en bleu. D’autre part, l’intensité de la coloration bleue des colonies, traduisant l’activité β-galactosidase, peut être corrélée à la force de l’interaction, ce qui permet de discriminer les interactions faibles, intermédiaires ou fortes (Estojak et al. , 1995). La Figure 2-2 résume les différentes étapes du Y2H qui seront décrites en détail dans les paragraphes suivants.

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Nous avons choisi comme appât les extrémités extramembranaires de PARL : HP1-96 (PARL-NT) et HP317-379 (PARL-CT). Les séquences correspondantes ont été sous-clonée en EcoRI/BamHI à partir des constructions pGex-6P-1 correspondantes, dans le même cadre de lecture que le domaine LexA du vecteur pEG202 (Origene), pour assurer l’expression des protéines chimériques utilisées comme appât HP1-96 et HP317-379/LexA DNA-BD (cf. 2.2.2). Le gène de résistance à l’ampicilline présent sur ce vecteur permet la sélection dans E. Coli . Ces vecteurs portant les appâts NT et CT de PARL seront appellés pEG202/appât dans le reste de la procédure.

La souche de levures EGY48 (Origene) est la souche utilisée pour porter la protéine appât/LexA-DNABD. Son génotype natif est le suivant [ MATα, his3, ura3, trp1 , LexAop(x6)-LEU2 ] ce qui signifie que cette souche est auxotrophe aux trois marqueurs de sélection histidine, uracile et tryptophane et qu’elle contient déjà le gène rapporteur LexA-LEU2. Dans cette souche, nous avons introduit deux vecteurs : le vecteur p8opLacZ qui porte le deuxième gène rapporteur utilisé pour le double-hybride, et le vecteur pEG202 portant notre protéine appât. Le vecteur p8opLacZ restaure l’autotrophie à l’uracile grâce au gène URA3 et le vecteur pEG202 restaure l’autotrophie à l’histidine grâce au gène HIS3, ce qui permet la sélection des transformants ayant intégré les plasmides.

NB : Tout le long de la procédure, travailler en milieu stérile pour éviter toute contamination et avec des solutions filtrées ou autoclavées.

Cette procédure permet d’obtenir à partir de 50 mL de culture, 5 x 50 μL de cellules compétentes EGY48 avec une efficacité de transformation moyenne de 103 à 104 transformants/μg d’ADN/50 μL de cellules. Inoculer une pré-culture de 5 mL avec une colonie de EGY48, dans du YPD. Incuber dans le shaker jusqu’à croissance saturée (30°C, 270 rpm, toute la nuit). Le matin, mesurer la DO600 de la culture. Faire une dilution appropriée de la culture de la nuit dans une flasque de 250 mL stérile contenant 50 mL de milieu YPD préchauffé à 30°C pour obtenir une DO600 finale de 0.2. Incuber à 30°C, en agitant à 200 rpm, jusqu’à ce que DO600 =1. Transférer la culture dans un Falcon 50 mL et centrifuger (3,000 rpm, 2 min). Enlever le milieu rapidement mais soigneusement et absorber les dernières gouttes en renversant le tube sur un papier absorbant. Ajouter 10 mL ddH2O stérile. Resuspendre les cellules en inversant le tube plusieurs fois. Ne pas vortexer sinon l’efficacité de transformation sera moindre. Centrifuger (3,000 rpm, 2 min), enlever l’eau. Resuspendre les cellules dans 5 mL de LiOAc/TE (LiOAc 0.1 M pH 7-7.4, TrisHCl 10 mM pH 7.5, EDTA 1 mM) en inversant le tube plusieurs fois. Centrifuger (3,000 rpm, 2 min), enlever le surnageant. Resuspendre les cellules dans 250 μL de LiOAc/TE en inversant le tube plusieurs fois. Centrifuger (3,000 rpm, 2 min), enlever le surnageant. Resuspendre les cellules dans 250 μL de LiOAc/TE en inversant le tube plusieurs fois. Pour chaque transformation, aliquoter 50 μL de cellules dans des tubes Eppendorf. Ajouter 1 μg d’ADN plasmidique (0.5 μg p8opLacZ+ 0.5 μg pEG202/appât). Mélanger doucement mais de manière homogène les cellules et l’ADN. Ajouter 300 μL de PEG dilué à 40% dans du LiOAc/TE. Mélanger en inversant les tubes plusieurs fois. Ne pas vortexer, le PEG fragilise les cellules. Incuber à 30°C pendant 30 min. Pendant ce temps, préparer un bain à 42°C, préchauffer les boîtes de Pétri en les plaçant dans l’incubateur à 30°C. Incuber les cellules à 42°C pendant 30 min. Centrifuger (20 s., 8,000 rpm), enlever le surnageant sauf 100 μL puis étaler 1/10ème de la solution de transformation sur des boîtes de Pétrie DOB déplétés en histidine et uracile (DOB H-U-). Seuls les transformants ayant intégré les deux plasmides pourront survivre sur ce milieu. Les boîtes contenant les transformants sont incubées 2-3 j. à 30ºC, jusqu’à ce que les colonies atteignent un diamètre de 1 mm environ. Choisir un clone EGY48[p8opLacZ;pEG202/appât] parmi les transformants.

Il s’agit ensuite de vérifier que l’appât est bien exprimé dans les clones EGY48[p8opLacZ;pEG202/appât] choisis. Un western-blot est réalisé à partir d’extraits des clones sélectionnés. Pour préparer les échantillons protéiques de Levures, inoculer une pré-culture de 5 mL avec une colonie de la souche de Levures d’intérêt, dans le milieu sélectif approprié si la souche contient un plasmide ou dans du YPD simple si la souche ne contient pas de plasmide. Dans le cas des souches porteuses d’un plasmide dont l’expression est induite par le galactose, ne pas oublier de mettre du galactose dans le milieu. Le matin centrifuger 1.5 mL de culture dans un tube eppendorf (Vmax, 2 min). Resuspendre le culot dans 5 mL/g de culot de solution de lyse Y-PER (Pierce Inc., USA), contenant le cocktail antiprotéase (Boeringher-Mannheim). Laisser agir 20 min à température pièce, puis centrifuger à nouveau (10,000 g, 4°C). Prélever le surnageant qui contient les protéines solubles. L’échantillon protéique est dilué dans du tampon 4X (Tampon LDS pour la Préparation des Echantillons pH 8.4 NuPAGE, Novex, USA) pour réduire les ponts dissulfure, additionné d’une solution d’antioxydants 10X (additif antioxydant NuPAGE, Novex, USA) pour limiter l’oxydation des protéines, avant d’être chauffé 10 min à 70°C. Les échantillons sont soumis à un western-blot (cf. 2.2.1.3). La présence de la protéine appât est révélée avec un anticorps anti-LexA (Clontech). Nous avons ainsi vérifié que nos deux appâts PARL-NT et PARL-CT/LexADNA-BD étaient exprimés.

Avant d’entreprendre le criblage de la banque d’ADNc, il est nécessaire de s’assurer que l’appât n’active pas seul les gènes rapporteurs LacZ et LEU2 . Le clone EGY48[p8opLacZ;pEG202/appât] choisi est étalé sur le milieu sélectif qui sera utilisé pour le criblage de la librairie : DOB (H-, U-, L-) pour vérifier l’absence de croissance sur milieu déplété en leucine. D’autre part, le clone est aussi testé sur le milieu DOB (H-, U-, L-) enrichi en X-Gal de façon à vérifier l’absence de coloration bleue des colonies qui indiquerait une autoactivation du gène LacZ . Nous avons aussi réalisé le test β-galactosidase des levures transformées par pBait et pTarget, les plasmides contrôle fournies par Origene qui constituent des témoins positifs.

Nous avons choisi de cribler deux librairies d’ADNc disponibles dans le commerce: une librairie d’ADNc de cellules HeLa dérivées d’un carcinome humain et une librairie d’ADNc de cerveau fœtal humain. Les ADNc de chaque librairie (Origene) ont été synthétisés à partir d’amorces oligo-dT, ce qui favorise la présence d’ADNc pleine longueur. Cette librairie est clonée unidirectionnellement dans le vecteur d’expression de levure pJG4-5. Ce vecteur permet l’expression de B42AD fusionné à un ADNc cible de la librairie. D’autre part, il permet de cribler des protéines potentiellement toxiques puisque son expression est inductible par le galactose.

Le criblage consiste d’abord à transformer la souche de levure EGY48[p8opLacZ;pEG202/appât] exprimant la protéine appât avec la librairie d’ADNc clonée dans le vecteur pJG4-5. Les transformants sont sélectionnés dans un milieu déplété en galactose, ce qui empêche l’expression de protéines toxiques de la librairie pendant cette première phase d’amplification du criblage. Les librairies Origene contiennent environ 3 x 106 ADNc indépendants, clonées dans le plasmide pJG4-5. En théorie, une librairie avec 3 x 106 ADNc indépendants contient des ADNc correspondant à des ARNm qui sont représentés, au sein de la population d’ARNm utilisée pour constituer la librairie, à une fréquence plus importante que 1 pour 3 x 106 molécules d’ARNm. Pour pouvoir isoler les ADNc de la librairie les plus rares, c’est à dire ceux dont la fréquence est rare, il est essentiel d’amplifier au moins le mêmes nombre de clones individuels de la librairie, soit obtenir au minimum 3.6 x 106 transformants dans la phase d’amplification. Une très forte efficacité de transformation s’avère donc nécessaire pour garantir une bonne représentation de la banque d’ADNc. Avant de procéder à la transformation de la librairie, dans un premier temps, nous avons optimisé le protocole de transformation présenté en 2.5.2 et ajouté des étapes supplémentaires présentées ci-dessous. Ensuite, des transformations pilotes ont été réalisées pour obtenir l’efficacité de transformation moyenne. Typiquement, nous avons obtenu des efficacités de 0.5 x 105 transformants/μg d’ADN de la librairie. Ceci nous a permis d’évaluer le nombre de transformations individuelles à réaliser pour obtenir 2-3 x 106 transformants (i.e. 40(!) par librairie). Les solutions de transformation sont ensuite étalés sur des boîtes de 22 x 22 cm de DOB (H-T-U-), en essayant d’obtenir 1-2 x 105 transformants/boîte. Le nombre de transformations individuelles à étaler sur chaque boîte est calculé à partir de l’efficacité de transformation moyenne dérivée des expériences pilotes. Il faut absolument éviter d’avoir trop de transformants par boîte, sinon les clones auront du mal à croître et la librairie sera mal représentée.

Inoculer une pré-culture de 5 mL avec une colonie de la souche EGY48[p8opLacZ;pEG202/appât] dans le milieu sélectif approprié DOB (H-U-). Incuber dans le shaker jusqu’à croissance saturée (30°C, 270 rpm, toute la nuit). Le matin, mesurer la DO600 de la culture. Faire une dilution appropriée de la culture de la nuit dans une flasque de 250 mL stérile contenant 50 mL de milieu YPD préchauffé à 30°C pour obtenir une DO600 finale de 0.2. Incuber à 30°C, en agitant à 200 rpm, jusqu’à ce que DO600 =1. Transférer la culture dans un Falcon 50 mL et centrifuger (3,000 rpm, 2 min). Enlever le milieu rapidement mais soigneusement et absorber les dernières gouttes en renversant le tube sur un papier absorbant. Ajouter 10 mL de ddH2O stérile. Resuspendre les cellules en inversant le tube plusieurs fois. Ne pas vortexer sinon l’efficacité de transformation sera moindre. Centrifuger (3,000 rpm, 2 min), enlever l’eau. Resuspendre les cellules dans 5 mL de LiOAc/TE (LiOAc 0.1 M pH 7-7.4, TrisHCl 10 mM pH 7.5, EDTA 1 mM) en inversant le tube plusieurs fois. Centrifuger (3,000 rpm, 2 min), enlever le surnageant. Resuspendre les cellules dans 250 μL de LiOAc/TE en inversant le tube plusieurs fois. Centrifuger (3,000 rpm, 2 min), enlever le surnageant. Resuspendre les cellules dans 250 μL de LiOAc/TE en inversant le tube plusieurs fois. Pour chaque transformation, aliquoter 50 μL de cellules dans des tubes Eppendorf. Ajouter 1 μg d’ADN de la librairie, ainsi que 15 μg d’ADN porteur qui va faciliter l’entrée de l’ADN de la librairie dans les cellules. L’ADN porteur utilisé est issu de sperme de saumon (Eppendorf), la solution stock est à 30 μg/μL et doit être dénaturée (10 min, 100ºC) avant utilisation. De plus, on ajoute également du DMSO (10% final) au milieu de transformation pour augmenter l’efficacité de transformation. Mélanger doucement mais de manière homogène les cellules et l’ADN. Ajouter 300 μL de PEG dilué à 40% dans du LiOAc/TE. Mélanger en inversant les tubes plusieurs fois. Ne pas vortexer, le PEG fragilise les cellules. Incuber à 30°C pendant 30 min Pendant ce temps, préparer un bain à 42°C, préchauffer les boîtes de Pétri en les plaçant dans l’incubateur à 30°C. Incuber les cellules à 42°C pendant 30 min Juste après le choc thermique, les cellules sont resuspendues dans 10 mL/tube de transformation de YPD préchauffé à 30°C et placées dans le skaker ( 2 h., 200 rpm, 30°C) dans une grande flasque de 250 mL pour favoriser l’oxygénation des cellules. Après ces 2h., ne pas oublier d’étaler 100 μL, 10 μL et 1 μL de la solution sur trois boîtes de Pétrie séparées (DOB H-T-U), pour pouvoir vérifier ultérieurement l’efficacité de transformation. Puis les cellules sont centrifugées (3,000 rpm, 2 min) et resuspendues dans un volume de DOB H-T-U- liquide permettant d’étaler 1 mL de solution/ boîtes de 22 x 22cm de milieu sélectif DOB H-T-U- maximum. Pour assurer une distribution homogène des clones, déposer la solution de transformants sur le milieu et verser une centaine de billes de verres (diamètre 4 mm) préalablement autoclavées. Faire rouler les billes doucement autour de la boîte pour distribuer uniformément la solution de transformation, puis transvaser les billes dans la boîte suivante. Cette technique marche seulement si la surface des boîtes n’est pas trop humide, de manière à ce que le milieu puisse absorber la solution. Pour assécher légèrement le milieu, il suffit de placer les boîtes fraîchement coulées 1 h. sous la hotte à flux laminaire avant l’emploi. Les boîtes sont ensuite incubées à 30°C. Les colonies commencent à apparaître dès 24 h. Continuer l’incubation jusqu’à ce qu’elles atteignent 1-2 mm de diamètre, soit 48 h. après. Ensuite, utiliser une lame de microscope 75 x 50 mm stérile prise sur sa longueur pour gratter et collecter l’ensemble des transformants dans un tube Falcon. Eviter d’inclure des morceaux d’agar qui gêneraient le pipettage ultérieur. Rincer les transformants deux fois avec 3 volumes de TE1X en centrifugeant entre chaque lavage (2 min, 3,000 rpm). Les transformants sont finalement resuspendus dans du DOB H-T-U- liquide additionné de 10% de glycérol, comptés, puis congelés en aliquotes de 1 mL à -80ºC.

L’efficacité de transformation de la librairie est calculée à partir des boîtes contrôle et le nombre total de transformants est déduit.

Il s’agit maintenant de tester ces transformants pour l’activation des gènes rapporteurs, en présence de galactose qui va induire l’expression de la protéine de la librairie. Pour être sûr de cribler également les ADNc faiblement représentés dans la population amplifiée à l’étape précédente, nous avons décidé de cribler 10x le nombre d’ADNc individuels représentés dans la librairie, soit 10x le nombre de transformants obtenus à l’étape précédente. Environ 10x le nombre de transformants obtenus est étalé sur des boîtes de 22 x 22cm le milieu sélectif DOB H-T-U-L-, enrichi en galactose et en X-Gal+, à une densité de 2-3 x 106 transformants/boîte maximum. Les boîtes DOB H-T-U-L- X-Gal+ sont incubées 2-5 j. à 30ºC, jusqu’à ce que des colonies se développent, la croissance étant ralentie dans le milieu X-Gal.

Seuls les clones positifs pour l’activation des deux gènes rapporteurs: LEU2 et LacZ ont été choisis, c’est-à-dire les colonies capables de croître sur un milieu déprimé en leucine et de coloration bleue. Pour ne pas négliger les interacteurs faibles, des colonies de bleu plus faible ont également été sélectionnées. Chaque clone sélectionné est repiqué sur des boîtes de milieu sélectif DOB H-T-U-L-/Galactose/X-Gal pour vérifier la positivité de l’activation des deux gènes rapporteurs. Les clones ayant passé ce test contiennent donc un plasmide pJG4-5/ADNc codant pour une protéine interagissant avec notre appât. Il s’agit maintenant d’extraire et d’amplifier ce plasmide pour pouvoir ensuite procéder au séquençage individuel des candidats à l’interaction (SUCOF, Université Laval).

En raison de leur paroi épaisse et résistante et du faible nombre de copies de plasmides présents dans les Levures, il est difficile d’obtenir un bon rendement lors de l’extraction d’ADN plasmidique. Pour obtenir un bon rendement d’extraction de l’ADN plasmidique des clones positifs pour le criblage, nous utilisons un kit (Bio101) qui permet d’obtenir typiquement 100 μL de minipreps d’ADN à 20 ng/μL .

Inoculer une pré-culture de 5 mL avec un clone positif pour l’interaction, dans le milieu sélectif (DOB-U-H-T). Transvaser 1.5 mL de culture dans les tubes fournis avec le kit. Centrifuger (Vmax, 30s.), enlever le surnageant et ajouter les billes de verre fournies avec le kit. Ajouter 250 µL de solution de lyse alcaline. Placer dans l’appareil agitateur à haute vitesse FastPrep (Bio101) et agiter (Vmax, 10 s.). Enlever les échantillons de l’appareil, ajouter 250µL de solution de neutralisation. Mélanger en vortexant brièvement puis centrifuger (Vmax, 2 min). Transférer le surnageant sur la colonne fournie avec le kit (Spin Filter) en évitant les débris blanchâtres contenant des protéines précipitées et les billes de verre. Ajouter 250 µL de la solution contenant la matrice qui va recueillir l’ADN (Glassmilk Spin Buffer). Inverser le tube pour mélanger, centrifuger (Vmax, 1 min) et enlever le liquide résiduel. Ajouter 500 µL de solution de lavage, centrifuger 1 min et enlever le liquide lavage résiduel. Répéter le lavage et centrifuger une fois supplémentaire pour éliminer toute trace d’EtOH résiduel. Transférer la colonne dans un nouveau tube. Ajouter 100 µL de ddH2O, vortexer doucement à vitesse moyenne et centrifuger (Vmax, 30 s.) pour collecter l’ADN.

La solution d’acides nucléiques de Levures obtenue en suivant la procédure précédente est constitué majoritairement d’ARN et d’ADN génomique. Seule une petite proportion correspond à l’ADN plasmidique de la librairie. C’est pourquoi il est nécessaire d’amplifier ce matériel plasmidique. Une première amplification est réalisée dans la souche d’ E. coli KC8 qui présente la particularité d’être auxotrophe au tryptophane (T-), ce qui va permettre la sélection des bactéries ayant intégré le plasmide pJG4-5 portant l’ADNc de la librairie. Les bactéries compétentes KC8 sont préparées selon la méthode décrite précédemment (cf. 2.2.2.6), cependant cette souche a des efficacités de transformation très faible (de l’ordre de 103 transformants/μg d’ADN). Pour pallier ce problème, il s’est avéré nécessaire de doubler la quantité de cellules dans les aliquotes de transformation, d’autre part, nous avons utilisé 15 μL de miniprep de Levures/transformation (soit environ 300 ng d’ADN total/transformation) pour augmenter la quantité d’ADN plasmidique. Enfin, après la transformation des KC8 suivant la méthode du choc thermique décrite précédemment, les cellules sont centrifugées (8,000 rpm, 1 min), resuspendues dans 100 μL de ddH2O et la totalité de la solution est étalée sur le milieu sélectif. Le milieu utilisé est le milieu minimal M9 déplété en tryptophane qui permet la sélection des transformants qui sont complémentés par le gène de prototrophie au tryptophane présent sur le plasmide de la librairie. Les boîtes sont incubées 2 j. à 37ºC pour permettre aux colonies une croissance suffisante pour être observable. Parmi les transformants, une colonie est sélectionnée et repiquée dans 2-3 mL de LB liquide. Une miniprep est réalisée à partir de cette culture. Là encore, le rendement est relativement faible, il s’agit d’aplifier une seconde fois le plasmide la librarie dans une nouvelle souche bactérienne les NovaBlue.