3 RÉSULTATS

Table des matières

Ce chapitre comprend l’ensemble des résultats obtenus au cours de mon doctorat. La première partie présente l’analyse phylogénétique réalisée sur la super-famille RHO, qui nous a permis de valider l’homologie fonctionnelle entre PARL et Rhomboid-1 de la Drosophile. La deuxième partie est consacrée à l’étude de l’expression de PARL dans le cerveau de souris, et particulièrement à l’étude de sa distribution sub-cellulaire dans les différentes fractions membranaires du cerveau. La troisième partie consiste en une analyse immunohistochimique de l’expression de PARL au cours du développement postnatal du cerveau de souris, de façon à déterminer son profil d’expression et préciser les types cellulaires dans laquelle elle est exprimée. La quatrième partie insiste sur le profil d’expression de PARL dans le cerveau de souris adulte. Enfin, la cinquième partie est consacrée à l’approche moléculaire des partenaires cellulaires de PARL par le biais d’un système de double-hybride en Levures.

Cette analyse complète repose sur une étude bioinformatique des séquences des membres de la super-famille Rhomboid que nous avons pu recenser dans les banques de données. Cette étude dépasse le simple cadre de l’étude de la protéine PARL et nous permet de la replacer dans son contexte évolutif. Nous nous sommes ainsi intéressés aux caractéristiques générales des Rhomboids ainsi qu’à leurs propriétés structurales, en insistant sur la conservation évolutive étonnante de cette famille. Nous nous sommes ensuite plus particulièrement penchés sur les Rhomboids eucaryotes qui comprennent les Rhomboids de la Drosophile et leurs orthologues, ainsi que la protéine PARL humaine et ses orthologues, de façon à valider l’homologie fonctionnelle entre Rhomboid et PARL. Cette étude a été réalisée en collaboration étroite avec le Dr Eugene Koonin, bioinformaticien au NIH. J’ai participé à l’élaboration de l’analyse phylogénétique. Ces résultats sont extraits de l’article de Koonin et al., 2003, qui figure en annexe.

Les membres de la super-famille Rhomboid caractérisées jusqu’à maintenant sont peu nombreux. Chez la Drosophile, sept membres sont identifiés (Rhomboid-1 à -7) dont seulement quatre sont caractérisés (Urban et al. , 2002a). Chez les Vertébrés trois membres sont identifiés RRP (Pascall et Brown, 1998), Ventrhoid (Jaszai et Brand, 2002) et PARL (Pellegrini et al. , 2001), et enfin, chez les Procaryotes, seul un membre a été caractérisé extensivement : AarA (Rather et al. , 1999) (cf. 1.4.2). Les séquences correspondant à ces membres ont été comparées avec une base de donnée non-redondante en utilisant trois itérations du programme PSI-BLAST. Ainsi, l’ensemble des membres de la super-famille Rhomboid a pu être isolé de manière statistiquement significative et sans faux positifs. Les protéines Rhomboids sont présentes à tous les niveaux évolutifs : des procaryotes aux eucaryotes supérieurs, en passant par les archæbactéries (Figure 3-1 et Figure 3-2). La plupart des espèces procaryotes ne possèdent qu’un seul gène codant pour une protéine de la famille Rhomboid. Par contraste, les eucaryotes présentent une expansion de la famille Rhomboid. Par exemple, chez D . Melanogaster , on compte 7 membres : Rhomboid-1 à -7, et chez Arabidopsis thaliana , jusqu’à 13 membres.

La similarité de séquence entre les Rhomboids eucaryotes et procaryotes est relativement basse : de 10 à 15% d’identité dans les régions conservées. Cependant, tous les membres de la super-famille Rhomboid présentent des caractères communs. Tout d’abord, les prédictions utilisant les programmes TMPRED et TMAP montrent que toutes ces protéines sont munies de multiples domaines transmembranaires. Les régions les plus conservées sont situées à l’intérieur de ces domaines transmembranaires. D’autre part, l’alignement de séquences multiple révèle un "noyau conservé" de la super-famille des Rhomboid contenant 6 domaines munis d’hélices transmembranaires (TMH1 à TMH6), ce noyau est présent chez tous les membre de la famille sans exception (Figure 3-1). Dans le domaine TMH4 de ce noyau conservé, la sérine catalytique caractérisée chez Rhomboid-1 (Urban et al. , 2001) est présente chez tous les membres, à deux exceptions près (Figure 3-1). De même, l’histidine catalytique située dans le domaine TMH6 est aussi hautement conservée. Nous avons également mis en évidence dans le TMH2 la présence de deux histidines additionnelles et une asparagine qui sont conservés chez la majorité des Rhomboids (Figure 3-1). La protéine PARL possède la sérine, l’histidine et l’asparagine catalytiques, ainsi que les deux histidines additonnelles conservées (Figure 3-1).

Figure 3-1   (voir légende page suivante)

Figure 3- 1 : Alignement multiple du noyau conservé de la super famille de protéines Rhomboid.

Figure 3-1 suite voir légende page suivante)

L’alignement inclut la majorité des protéines de la famille Rhomboid recensées dans les bases de données, certaines séquences très proches ont été omises. Seuls les six domaines correspondant à des hélices transmembranaires prédites (TMH) et de courtes séquences adjacentes sont montrées. Les limites des TMH prédites sont indiquées en surbrillance et les TMH sont numérotés de 1 à 6. Les acides aminés omis en N- et C-terminal, ainsi qu’entre les TMH sont indiqués. La séquence consensus montre les acides aminés identiques présents dans au moins 90% des séquences alignées. h équivaut aux résidus hydrophobes (A,C,I,L,V,M,F,Y,W) et s aux petits résidus (G,A,S,D,N,V). La sérine catalytique (TMH4) et l’histidine (TMH6) ainsi que les résidus conservés dans le TMH3 avec une fonction auxiliaire potentielle dans la catalyse figurent en couleur. Les protéines sont identifiées à partir du numéro d’identification du gène correspondant (GI) répertorié dans les banques de données ainsi qu’avec l’espèce correspondante abrégée. Les espèces bactériennes sont en vert, les eucaryotes en bleu et les archæbactéries en orange. Abréviations des noms d’espèces utilisées: Aerpe, Aeropyrum pernix , Agrtu, Agrobacterium tumefaciens , Anoga, Anopheles gambiae , Arath, Arabidopsis thaliana ; Arcfu, Archaeoglobus fulgidus , Bacsu, Bacillus subtilis , Brume, Brucella melitensis , Caeel, Caenorhabdtitis elegans , Caucr, Caulobacter crescentus , Chlte, Chlorobium tepidum , Cloac, Clostridium acetobutilicum , Corgl, Corynebacterium glutamicum , Deira, Deinococcus radiodurans , Dicdi, Dictyostelium discoideum , Drome, Drosophila melanogaster , Escco, Escherichia coli , Haein, Haemophilus influenzae , Halsp, Halobacterium sp ., Homsa, Homo sapiens , Lacla, Lactococcus lactis , Lisin, Listeriainnocua , Metja, Methanoccocus jannaschii , Metka, Methanopyrus kandleri , Metma, Methanosarcina mazei , Meslo, Mesorhisobium loti , Mycle, Mycobacterium leprae , Myctu, Mycobacterium tuberculosis , Neucr, Neurospora crassa , Nossp, Nostoc sp ., Prost, Providencia stuartii , Pyrab, Pyrococcus abyssi , Pyrae, Pyrobaculum aerophilum , Ralso, Ralstonia solanaraceum , Sacce, Saccharomyces cerevisiae , Schpo, Schizosaccharomyces pombe , Sinme, Sinorhisobium meliloti , Strco, Streptomyces coelicolor , Strpn, Streptococcus pneumoniae , Sulso, Sulfolobus solfataricus , Sulto, Sulfolobus tokodaii , Synsp, Synechocystis sp ., Theac, Thermoplasma acidophilum , Thema, Thermotoga maritima , Thete, Thermus thermophilus , Vibch, Vibrio cholerae , Xanca, Xanthomonas campestris , Xylfa, Xylella fastidiosa .

L’alignement multiple du noyau conservé de 6 TMH de la famille Rhomboid a été employé pour construire un arbre phylogénétique (Figure 3-2). Seules les régions conservées comprenant les 6 domaines TMH ainsi que de courtes séquences adjacentes ont été utilisées pour la construction de l’arbre phylogénétique, alors que les résidus peu ou pas conservés ont été omis pour réduire le bruit issu de mauvais alignement. L’arbre phylogénétique de la super-famille Rhomboid a une apparence particulière : les sous-ensembles que forment les Rhomboids des archæbactéries ou des eucaryotes ne forment pas des clades monophylétiques (Figure 3-2). La structure des Rhomboids est organisée différemment suivant leur niveau évolutif. Ainsi, les Rhomboid bactériens et archæbactériens comportent typiquement 6 TMH alors que les Rhomboids eucaryotes en contiennent typiquement 7. Ce 7ième domaine TMH peut être situé en C- ou N-terminal par rapport au noyau conservé de 6 TMH qui retient l’activité catalytique (Figure 3-2).

Si l’on s’intéresse plus particulièrement aux Rhomboids eucaryotes, il apparaît qu’elles sont séparées en deux sous-ensembles principaux positionnés au milieu de branches procaryotes. La première sous-famille eucaryote qui inclue six des sept Rhomboids (Rhomboid-1 à -6) de la Drosophile est liée à un noyau procaryote. Cette sous-famille prototypée par Rhomboid-1 possède en plus du noyau conservé de 6 TMH un domaine supplémentaire positionné en C-terminal. Certaines de ces protéines possèdent également en position N-terminale un domaine de liaison du calcium (Figure 3-2). La deuxième sous-famille, baptisée sous-famille des PARLoids, réside dans un large groupement procaryote. Cette sous-famille est prototypée par notre protéine PARL qui apparaît comme l’orthologue humain de Rhomboid-7 de D. Melanogaster. Dans cette famille, PARL et ses orthologues d’autres espèces animales adoptent une structure différente de la sous-famille des Rhomboids : le domaine supplémentaire en plus du noyau conservé de 6 TMH est ajouté en N-terminal.

Ces résultats montrent l’étonnante conservation évolutive du noyau de 6 TMH des Rhomboids, et particulièrement des résidus catalytiques, chez la quasi-totalité des membres de la super-famille Rhomboid et suggèrent fortement que toutes les Rhomboids sont des sérines-protéases assurant la protéolyse intramembranaire régulée. La PARL est donc une RIP-protéase. Nous avons poursuivi notre étude sur la caractérisation de PARL dans le cerveau.

Figure 3- 2 . Arbre phylogénétique de la super-famille des Rhomboid.

Figure 3-2 (voir légende page suivante)

Les séquences et régions utilisées pour la construction de l’arbre phylogénétique sont les mêmes que celles présentées dans la Figure 3-1. Le code couleur et les abréviations sont également les mêmes. Les deux sous-familles eucaryotes principales sont notifiées RHO et PARL et quatre groupes regroupant plusieurs espèces sont identifiés de 1 à 4. Le code utilisé pour l’architecture des différents domaines protéiques est indiqué sous l’arbre.

Ces travaux ont été réalisés dans le laboratoire du Dr Luca Pellegrini. J’ai participé au test des anticorps anti-PARL en western-blot, ainsi qu’à l’initiation du fractionnement sub-cellulaire de cerveau de souris.

Figure 3- 3 : Expression de PARL dans le cerveau de souris.

Des homogénats totaux (H) et une fraction correspondant au surnageant post-nucléaire (S) sont séparés par SDS-PAGE sur un gel gradient 4-12%. Le marqueur de poids moléculaire (PM) est indiqué en kDa. Le blot a été incubé en présence de l’anticorps T2 dirigé contre la première boucle extramembranaire de PARL (1/500), puis révélé par la technique de chemiluminescence intensifiée (ECL). Le western-blot montre la présence de deux bandes réactives à l’anticorps T2 si l’anticorps est préincubé avec la protéine GST (A). Une bande spécifique aux alentours de 43 kDa correspond à la protéine PARL et disparaît si l’anticorps est préincubé avec une protéine de fusion entre la GST et un fragment aa121-170 de PARL (GST-HP121-170) portant son épitope (B). L’anticorps reconnaît également la protéine de fusion (voir les 1ères voies du gel) (A, B).

L’anticorps T2 utilisé à une concentration de 1/500 reconnaît une bande à un poids moléculaire de 43 kDa environ, correspondant au PM prédit à partir de la séquence protéique déduite de l’ADNc de PARL. Cependant, une autre bande est observée à un PM plus élevé que celui attendu, aux alentours de 55 kDa (Figure 3-3). Cette bande est vraisemblablement aspécifique. Pour vérifier cette hypothèse, nous avons donc dû tester la spécificité de l’anticorps T2. Dans un premier temps, nous avons essayé la compétition de l’anticorps avec le peptide synthétique utilisé pour l’immunisation, sans obtenir de résultats concluants. Nous avons donc mis au point un système de compétition de l’épitope utilisant une protéine de fusion entre le fragment aa121-170 de la protéine PARL portant l’épitope reconnu par l’anticorps T2 (aa 143-152) et la GST décrit en 2.2.3. La préincubation de l’anticorps T2 avec la GST-HP 121-170 conduit à la disparition de la bande à 43 kDa (Figure 3-3B), par contre sa préincubation avec la GST seule ne modifie pas les résultats obtenus avec l’anticorps non pré-traité (Figure 3-3A), démontrant que la bande à 43 kDa correspond bien spécifiquement à PARL. L’anticorps 4CT ne fonctionne pas en western-blot, par contre, des résultats semblables à ceux obtenus avec le T2 ont été obtenus avec l’anticorps 4NT dirigé contre l’extrémité N-terminale de PARL et utilisé à une concentration de 1/500. L’anticorps 4CT ne fonctionne pas en western-blot.

Pour étudier la distribution subcellulaire de PARL, nous avons procédé au fractionnement subcellulaire d’extraits de cerveau de souris. Le contrôle de la qualité et des contaminations entre les différents compartiments est effectué en utilisant des protéines marqueurs. Pour marquer la membrane plasmique, nous avons utilisé la sous-unité NR1 du récepteur NMDA qui est exprimé spécifiquement au niveau de la membrane plasmique des neurones. Pour marquer la fraction synaptosomale, nous avons utilisé la synaptophysine, une protéine présente dans la membrane des vésicules synaptiques. Ainsi, la Figure 3-4 montre un enrichissement progressif de la protéine synaptophysine (Syp) dans les membranes légères (LP2) et dérivée de la lyse hypotonique des synaptosomes. Par contraste, la sous-unité NR1 du récepteur NMDA sédimente préférentiellement avec les membranes lourdes issues de la rupture des synaptosomes (LP1). Ceci montre que nous avons réussi à séparer les différentes fractions subcellulaires.

Figure 3- 4 : Distribution subcellulaire de la protéine PARL dans le cerveau de souris.

Différentes fractions subcellulaires (S1, S2, P2’, LS1, LP1, LP2) issues de centrifugation et ultrcentrifugations successives d’homogénats de cerveau totaux (H) sont séparés par SDS-PAGE sur un gel gradient 4-12%. Le marqueur de poids moléculaire (PM) est indiqué en kDa. Le blot a été incubé en présence de l’anticorps T2 (1/500), puis révélé par la technique de chemiluminescence intensifiée (ECL). La contamination entre les différentes fractions est estimée par la présence du marqueur de la membrane plasmique NR1, une sous-unité du récepteur NMDA et du marqueur des vésicules synaptiques, la synaptophysine (Syp). La protéine PARL est présente dans toutes les fractions NR1 positives contenant la membrane plasmique (H, S1, P2’, LP1, LP2), mais également dans les fractions contenant d’autres membranes comme les membranes des vésicules synaptiques (S2, LP1, LS2). Notez que dans le compartiment LP1 contenant beaucoup de membranes du Golgi, PARL apparaît à un poids moléculaire plus élevé.

PARL est présente dans la fraction S2 correspondant aux membranes grossièrement séparées (Figure 3-4). PARL est également présente dans la fraction synaptosomale P2’, ainsi que dans la fraction LP2 correspondant à la lyse hypotonique des synaptosomes. Cette fraction très enrichie en Syp contient des vésicules de transport ainsi que des vésicules synaptiques. La protéine PARL est également enrichie dans la fraction LP1 contenant de la membrane plasmique (NR1 positive). De manière intéressante, le poids moléculaire de PARL apparaît plus élevé d’une dizaine de kDa dans ce compartiment que dans les autres, laissant suggérer que PARL y subit une modification post-traductionnelle.

Nous avons donc montré que PARL est exprimée dans le cerveau de souris et concentrée dans les fractions membranaires .

L’ensemble de ces études immunohistochimiques de l’expression de PARL dans le cerveau de Rongeurs ont été réalisées dans le laboratoire du Dr Attila Sik. Avant mon arrivée dans son laboratoire en juin 2002, le Dr Sik avait déjà initié cette étude postnatale ainsi que certains co-marquages. J’ai donc reproduit et précisé certains de ces résultats chez la souris (co-marquages 4NT/PCNA, 4NT/NeuN, 4NT/GFAP) et j’ai également mis au point des co-marquages complémentaires (4NT/TuJ-1). J’ai aussi optimisé les protocoles de perfusion chez les jeunes souris et mis au point le protocole d’injection et de révélation du BrDU chez la souris adulte. Les expériences d’expression, de purification et d’utilisation des protéines de fusion GST-PARL nécessaires pour la compétition de l’anticorps 4NT ont été réalisés par le Dr Luca Pellegrini.

Le profil d’expression de la protéine PARL au cours du développement postnatal du cerveau de souris, à partir du jour de la naissance (P0) jusqu’à l’âge adulte (P60) a été étudié en immunohistochimie. Chez les animaux nouveau-nés, des régions distinctes du cerveau sont très fortement immunoréactives pour PARL : le néocortex, le cervelet, les zones ventriculaires et subventriculaires, le courant migratoire rostral, le bulbe olfactif (BO) ainsi que toute la formation hippocampique (Tableau 3-1). Au cours de la première semaine postnatale, ces zones restent très immunoréactives pour PARL (Figure 3-5).

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L’intensité du marquage est codifiée de la manière suivante : +++ élevée; ++, modérée; +, faible; +/-, très faible; et -, négative.

Figure 3- 5 : Distribution de l’immunoréactivité pour PARL dans le cerveau de souris âgée de 7 j. (P7)

Image composite obtenue à partir de sections longitudinales de cerveau de souris de 7 j. analysées par immunohistochimie avec l’anticorps anti-PARL 4NT. A 7j., l’ensemble de la formation hippocampique est fortement immunoréactive pour PARL, particulièrement le gyrus denté (DG). La zone subventriculaire (SVZ) qui borde le ventricule latéral (LV), le courant migratoire rostral (RMS) ainsi que le bulbe olfactif (OB) sont aussi très fortement immunoréactifs pour PARL. L’ensemble des couches du néocortex, particulièrement les couches externes (I-III) expriment aussi PARL. Le noyau du stria terminalis (st. ter.) est fortement immunoréactif pour PARL. CA1-3, régions des Cornes d’Ammon -1 et -3 (barre d’échelle : 100 μm).

Au contraire, de larges zones sont dépourvues d’immunoréactivité pour PARL : le cortex pyriforme, le thalamus, le striatum et la pontine (Tableau 3-1, Figure 3-5). Seules quelques cellules isolées sont PARL-positives dans un noyau de la pontine et du thalamus, mais aucune immunoréactivité n’est détectable après 7 j. Un co-marquage 4NT/parvalbumine indique que le noyau du striatum PARL-positif est situé plus rostralement par rapport au noyau réticulaire thalamique parvalbumine-positif, nous l’avons donc identifié comme étant le stria terminalis. Le groupe de cellules PARL-positives est le noyau de la pontine (non montré).

L’immunoréactivité pour PARL est localisée dans le noyau des cellules. La spécificité de l’anticorps 4NT est vérifiée par un système de compétition de l’anticorps avec des protéines de fusion entre un fragment de PARL (aa 1-96) portant l’épitope de l’anticorps 4NT (aa 54-69) et la GST. Lorsque l’anticorps est préincubé avec les protéines GST-HP1-96, l’immunoréactivité pour PARL disparaît (Figure 3-6B), alors que la préincubation avec la GST donne des résultats comparables à ceux observés avec l’anticorps utilisé seul (Figure 3-6A, C).

Figure 3- 6 : Test de la spécificité de l’anticorps anti-PARL 4NT dans l’hippocampe de rat.

Des sections longitudinales de cerveau de rats âgés de 21 j. sont analysées par immunohistochimie avec l’anticorps 4NT dirigé contre l’extrémité N-terminale de PARL, révélé par marquage au DAB. L’anticorps est utilisé à une concentration de 1/3,000 à l’état natif (A), préincubé avec la GST-HP 1-96 (B) ou préincubé avec la GST seule (C). Dans les conditions A et B, l’immunoréactivité pour PARL est localisée au niveau de la zone subventriculaire (SVZ) et subgranulaire (SGZ) du gyrus denté de l’hippocampe. Le signal disparaît lorsque l’anticorps est préincubé avec son épitope (B) (barre d’échelle : 100 μm).

Formation hippocampique

L’immunoréactivité pour PARL est d’abord largement répandue dans toute la formation hippocampique, particulièrement dans la zone du gyrus denté en développement (Tableau 3-1; Figure 3-7). Au cours de la première semaine de vie postnatale (P0 à P7), cette immunoréactivité décroît progressivement. Elle disparaît d’abord du CA3 et du CA2 (entre P7 et P11), puis du CA1 (entre P14 et P21), pour ne rester qu’au niveau de la zone granulaire et subgranulaire du gyrus denté de l’hippocampe. Dès P21, le profil d’expression de PARL est comparable à celui observé chez l’adulte, avec une immunoréactivité résiduelle au niveau de la SGZ du gyrus denté, de la SVZ (Tableau 3-1; Figure 3-7), du RMS et du bulbe olfactif (non montré).

Cortex cérébral

À P0, l’organisation des couches corticales est très grossière. L’immunoréactivité pour PARL est détectée dans l’ensemble du néocortex. En revanche, le cortex pyriforme ainsi que le cortex entorhinal ne sont pas immunoréactifs pour PARL. Toutes les couches du néocortex sont fortement immunoréactives pour PARL (Figure 3-8). L’immunoréactivité décroît graduellement avec l’âge pour disparaître des couches inférieures à P7 et des couches supérieures à P11.

Cortex du cervelet

À P0, le cervelet adopte une structure très rudimentaire (Figure 3-9). Une forte immunoréactivité pour PARL est détectée dans tout le cervelet. De nombreuses cellules de la medulla (M) sont immunopositives pour PARL, cependant, la couche granulaire externe (egl) concentre l’immunoréactivité pour PARL. Cette immunoréactivité diminue au cours des deux premières semaines de vie postnatale. La couche granulaire externe rétrécit au fur et à mesure que la couche granulaire interne (igl) se constitue. À P4 PARL est fortement exprimée dans l’egl, mais aussi à des niveaux plus faibles dans l’igl. À P7, l’immunoréactivité pour PARL est seulement détectable dans l’egl qui régresse. À P11, l’egl est déjà très réduite, à P14, elle a quasiment disparu, seules quelques cellules résiduelles PARL-positives la peuplent.

Figure 3- 7 : Évolution de l'expression de PARL au cours du développement postnatal de la formation hippocampique de souris.

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Des sections longitudinales de cerveau de souris au jour de la naissance (P0), âgées de 4 j. (P4), 7 j. (P7), 14 j. (P14), 21 j. (P21), et 60 j. (P60) sont analysées par immunohistochimie avec l’anticorps anti-PARL 4NT. Chez les nouveaux-nés, l’ensemble de la formation hippocampique est fortement immunoréactive pour PARL, particulièrement le gyrus denté (DG). Puis l’immunoréactivité décroît progressivement pour ne rester concentrée qu’au niveau de la zone subgranulaire (SGZ) et de la zone subventriculaire (SVZ) adultes qui borde le ventricule latéral (lv). gl, couche granulaire; CA1-3, régions des Cornes d’Ammon -1 et -3 (barre d’échelle : 100 μm).

Chez le nouveau-né (P0), toutes les couches du cortex (I à VI) sont fortement immunoréactives pour PARL (anticorps 4NT). L’immunoréactivité des couches externes du cortex est plus importante que celle des couches internes et décroît graduellement avec l’âge pour disparaître totalement entre P7 et P11 (barre d’échelle : 100 μm).

Chez les nouveau-nés (P0), le cervelet est fortement immunoréactif pour PARL (anticorps 4NT), particulièrement la couche granulaire externe. L’immunoréactivité décroît graduellement dans cette couche et dans le reste du cervelet avec l’âge pour disparaître totalement après P14. egl, couche granulaire externe; ml, couche moléculaire; pc, cellules de Purkinje; igl, couche granulaire interne; M, medulla (barre d’échelle : 100 μm).

Le reste du cervelet n’est pas immunoréactif pour PARL. À P21, seules quelques cellules restent immunoréactives pour PARL, aucune immunoréactivité n’est détectée chez l’adulte (P60) (résultats non montrés).

Le profil d’expression de PARL évolue donc de manière dynamique au cours du développement. D’abord largement exprimée dans le cerveau à la naissance, son expression est régulée négativement au cours du développement postnatal. Ces résultats laissent sous-entendre que le gène de PARL n’est pas un gène de ménage (housekeeping gene) mais bien un gène exprimé différentiellement au cours du développement.

Au cours du développement postnatal du cerveau, plusieurs types cellulaires coexistent dans les zones immunoréactives pour la protéine PARL : cellules souches neurales, cellules progénitrices neuronales et gliales, neurones et cellules gliales, correspondant à des stades de prolifération/différenciation différents. Nous avons utilisé plusieurs types de marqueurs et étudié leur co-expression avec la protéine PARL, de façon à préciser les types et stades cellulaires où PARL est exprimée.

Dans le cerveau en développement de la souris, de nombreuses cellules apparaissent immunoréactives pour le marqueur PCNA, indiquant une prolifération cellulaire importante (Ino et Chiba, 2000). L’immunoréactivité pour PCNA décroît progressivement de P0 à P21 au fur et à mesure que la neurogenèse et la gliogenèse se terminent (résultats non montrés). La majorité des cellules PCNA-positives sont également immunoréactives pour PARL. Particulièrement, toutes les cellules PCNA-positives de la SVZ et du gyrus denté de l’hippocampe sont PARL-positives à P7 (Figure 3-10 A et B respectivement). Certaines cellules de la SGZ et de la SVZ sont PARL-positives mais n’expriment pas PCNA. À l’inverse, certaines cellules de la SGZ et de la SVZ sont PCNA-positives mais n’expriment pas PARL.

L’immunoréactivité pour le marqueur neuronal précoce TuJ-1 est également largement répandue dans tout le cerveau (Menezes et Luskin, 1994; Memberg et Hall, 1995) (Figure 3-11).

Figure 3- 10 : Co-expression de PARL avec le marqueur mitotique PCNA dans la zone subventriculaire (A) et la zone granulaire (B) du gyrus denté de souris âgée de 7j.

Des sections longitudinales sont analysées par double-immunohistochimie avec l’anticorps anti-PARL 4NT et l’anticorps anti-PCNA. Dans la SGZ et la SVZ, les cellules PCNA-positives sont PARL-positives. Dans la SVZ, quelques cellules PARL-positives sont PCNA-négatives (barre d’échelle : 50 μm).

Figure 3- 11 : Co-expression de PARL avec le marqueur de neuronal précoce TuJ-1 dans la zone subventriculaire (A) et la zone granulaire (B) du gyrus denté de souris âgées de 7 j. et 14 j. respectivement.

Des sections longitudinales sont analysées double-immunohistochimie en microscopie confocale avec l’anticorps anti-PARL 4NT et l’anticorps anti-TuJ-1. Dans la SVZ, les cellules TuJ-1-positives sont PARL-positives, cependant certaines cellules marginales PARL-positives apparaissent TuJ-1- (flèches blanches). A 14 j., les cellules PARL-positives de la zone granulaire sont TuJ-1-positives. Notez le gradient d’expression de PARL des couches internes de la zone granulaire (haut) vers les couches externes (bas) (barre d’échelle 25 μm).

L’immunoréactivité pour TuJ-1 augmente progressivement, indiquant l’entrée en différenciation des neurones générés au cours du développement (résultats non montrés). De manière intéressante, la majorité des cellules TuJ-1-positives sont aussi PARL-positives. Par exemple, les neurones exprimant TuJ-1 de la SVZ et du gyrus denté de l’hippocampe co-expriment pour la plupart PARL (Figure 3-11A et B). Cependant, quelques cellules PARL- positives de la SVZ n’expriment pas TuJ-1 (flèches blanches, Figure 3-11B).

Chez l’animal jeune, la majorité des cellules du gyrus denté sont immunoréactives pour PARL (Figure 3-12), s’étageant sur plusieurs couches cellulaires dans la zone granulaire (gl) du gyrus denté. Il apparaît comme un gradient d’expression de la protéine dans les différentes couches (flèche verte, Figure 3-12) orienté des couches internes vers les couches externes du gyrus denté. Par contraste, un gradient inverse est observé pour l’expression de NeuN, les couches externes étant plus fortement immunoréactives pour NeuN (flèche rouge, Figure 3-12). L’analyse des intensités de fluorescence relative aux deux canaux utilisés pour NeuN et PARL en utilisant le logiciel ImagePro permet d’obtenir un graphique illustrant les variations d’intensité de fluorescence dans une zone (Figure 3-13). Ce graphique illustre clairement l’existence des gradients d’expression de PARL et de NeuN. Dans les couches internes la zone granulaire et subgranulaire, une intensité maximale de fluorescence pour le canal PARL (100%) est corrélée à une expression minimale de NeuN (0%). A l’opposé, dans les couches externes, une intensité de fluorescence maximale pour NeuN (100%) est corrélée à des niveaux réduits d’intensité de fluorescence pour PARL (27%).

Chez l’animal jeune, la majorité des cellules PARL-positives n’expriment pas le marqueur astrocytaire GFAP. Cependant, quelques cellules co-expriment GFAP et PARL (Figure 3-14).

L’expression de PARL fluctue en fonction de l’état de prolifération/différenciation des cellules neuronales. Fortement exprimée dans les cellules mitotiques et en cours de différenciation, PARL est faiblement exprimée dans les neurones ou les cellules gliales matures .

Figure 3- 12 : Co-expression de PARL avec le marqueur neuronal tardif NeuN au niveau de la SGZ à P14.

Images obtenues en microscopie en fluorescence classique avec les anticorps anti-PARL (4NT) et anti-NeuN. Notez le gradient inverse d’expression de PARL (flèche verte) par rapport au gradient d’expression de NeuN (flèche rouge).

Figure 3- 13 : Illustration du gradient inverse PARL/NeuN dans la zone granulaire du gyrus denté (P14).

A l’aide du logiciel ImagePro, l’analyse des pourcentages relatifs de l’intensité maximale de fluorescence pour chaque canal en fonction de la distance fait apparaître le gradient inverse d’expression de PARL et NeuN des couches externes de la zone granulaire vers les couches internes.

Figure 3- 14 : Co-expression de PARL avec le marqueur astrocytaire GFAP dans la la zone granulaire du gyrus denté de souris âgée de 7 j.

Des sections longitudinales sont analysées double-immunohistochimie en microscopie confocale avec l’anticorps anti-PARL 4NT et l’anticorps anti-GFAP. La majorité des cellules PARL-positives sont PCNA-négatives (flèches blanches). Cependant, quelques cellules GFAP-positives expriment aussi PARL (tête de flèche blanche) (barre d’échelle : 25 μm).

Les cellules immunoréactives pour PARL et PCNA sont visualisées par double immunofluorescence dans des sections de cerveau de souris adulte. La distribution de l’immunoréactivité pour PCNA dans la région subgranulaire du gyrus denté, dans la région subventriculaire, au niveau du courant migratoire rostral et du bulbe olfactif corrobore les études précédentes (Ino et Chiba, 2000) (Figure 3-16B). Au niveau de la SVZ et SVZ, les zones d’immunoréactivité pour PCNA recouvrent partiellement les zones d’immunoréactivité pour PARL (Figure 3-16C) Ainsi, la majorité des cellules PCNA-positives co-expriment PARL (flèches blanches (Figure 3-16C), panneau gauche et droit). En revanche, certaines cellules PARL-positives n’expriment pas PCNA, particulièrement au niveau de la SGZ (Figure 3-16B). À l’inverse, certaines cellules de la SGZ et de la SVZ sont PCNA-positives mais n’expriment pas PARL.

Pour compléter ces données, nous avons utilisé le BrDU, un autre marqueur qui permet d’identifier les cellules en prolifération. Les cellules immunoréactives pour PARL et le BrDU sont visualisées par double immunofluorescence dans des sections de cerveau de souris adulte préalablement traitées au BrDU. La distribution de l’immunoréactivité pour le BrDU dans le noyau des cellules de la région subgranulaire du gyrus denté et dans la région subventriculaire confirme des études antérieures (del Rio et Soriano, 1989) (Figure 3-17B). Au niveau de la SVZ et SVZ, certaines cellules sont immunoréactives pour PARL et le BrDU (flèches blanches, Figure 3-17C). En revanche, la plupart des cellules PARL-positives n’ont pas incorporé le BrDU. D’autre part, certaines cellules ayant incorporé le BrDU n’expriment pas PARL.

Figure 3- 16 : Co-expression de PARL avec le marqueur mitotique PCNA dans la zone subventriculaire (A) et la zone subgranulaire (B) du gyrus denté de souris adulte.

Des sections longitudinales sont analysées par double-immunohistochimie avec l’anticorps anti-PARL 4NT et l’anticorps anti-PCNA. De nombreuses cellules PARL-positives expriment aussi PCNA. Certaines cellules PCNA-positives sont PARL-négatives. La majorité des cellules PARL-positives sont PCNA-négatives (barre d’échelle : 50 μm et 100 μm respectivement).

Images obtenues en microscopie confocale montrant la localisation de PARL (anticorps 4NT) dans les cellules ayant incorporé le BrDU (têtes de flèches blanches). Certaines cellules BrDU-négatives sont PARL-positives (flèches blanches). Le set C montre un plus fort grossissement de l’encadré présenté en B (barre d’échelle : 50 μm (A,B) et 15 μm (C)).

Les cellules immunoréactives pour PARL et TuJ-1 sont visualisées par double immunofluorescence dans des sections de cerveau de souris adulte. Au niveau du gyrus denté de l’hippocampe et en accord avec la littérature (Menezes et Luskin, 1994; Memberg et Hall, 1995), l’immunoréactivité pour TuJ1 est distribuée dans tout le cytoplasme des neurones de la zone granulaire et subgranulaire, seul le noyau n’est pas marqué (Figure 3-18). La population des cellules PARL- positives est très faible par rapport à l’ensemble de la population TuJ-1-positive. Cependant, au niveau de la SGZ, certaines cellules co-expriment TuJ-1 et PARL (flèches blanches, Figure 3-18B). La co-expression apparaît évidente à un plus fort grossissement (Figure 3-18B). Ainsi, PARL est exprimée dans les neurones immatures et matures du cerveau.

Pour visualiser les cellules terminalement différenciées du cerveau, nous avons utilisé le marqueur de neurones matures NeuN et le marqueur de cellules gliales matures GFAP. Les zones d’immunoréactivité pour NeuN et GFAP sont cohérentes avec la littérature et les populations marquées avec NeuN ou GFAP sont distinctes (Hajos et Kalman, 1989; Mullen et al. , 1992). Ainsi, au niveau de la zone subventriculaire, les cellules ne sont pas immunoréactives pour NeuN, les populations NeuN positives apparaissent situées dans des régions plus distales (panneau gauche, Figure 3-19B). La population de cellules PARL-positives de la SVZ n’exprime pas NeuN (Figure 3-19A). Au niveau du gyrus denté de l’hippocampe, une large population de neurones de la zone subgranulaire externe est fortement immunoréactive pour NeuN (Figure 3-19B). La population de cellules PARL positives est beaucoup plus restreinte et située dans la zone subgranulaire interne bordant le hylus du gyrus denté (Figure 3-19B) et coexiste en partie avec des neurones NeuN positifs. Cependant, l’utilisation d’un plus fort grossissement (Figure 3-19C), montre que les cellules PARL positives sont distinctes des cellules NeuN positives. D’autre part, la population PARL positive se distingue des cellules NeuN positives par la morphologie cellulaire : les noyaux sont beaucoup plus petits. D’autre part, les cellules de la SGZ immunoréactives pour PARL n’expriment pas le marqueur glial GFAP.

Figure 3- 18 : Co-expression de PARL avec le marqueur de neurones matures et immatures TuJ-1 dans la SGZ du gyrus denté de l’hippocampe de souris adulte .

Images obtenues en microscopie en fluorescence classique (A) et en microscopie confocale (B) montrant que les neurones marqués avec l’anticorps TuJ-1 qui reconnaît l’isoforme de la β-III tubuline expriment PARL (anticorps 4NT). Le set B montre un plus gros grossissement de la zone encadrée en A, les flèches blanches indiquent des neurones PARL-positifs/TuJ-1 positifs (barre d’échelle : 50 μm et 20 μm respectivement).

Figure 3- 19 : Absence de co-expression de PARL avec le marqueur neuronal tardif NeuN au niveau de la SVZ (A) et de la SGZ du gyrus denté (B, C) .

Images obtenues en microscopie en fluorescence classique (A, B) et confocale (C) montrant l’absence de co-localisation PARL (anticorps 4NT) et NeuN (anticorps anti-NeuN). Le set C montre un plus fort grossissement de l’encadré présenté en B (barre d’échelle : 50 μm et 10 μm respectivement).

Figure 3- 20 : Absence de co-expression de PARL avec le marqueur astrocytaire GFAP au niveau de la SGZ du gyrus denté .

Images obtenues en microscopie en fluorescence classique par double marquage anti-PARL (anticorps 4NT) et anti-GFAP (anticorps anti-GFAP) (barre d’échelle : 50 μm).

Chez l’adulte, l’expression de PARL est restreinte à la SGZ, à la SGZ du gyrus denté de l’hippocampe, au RMS et au bulbe olfactif. D’autre part, seules les cellules souches neurales et les neurones indifférenciés expriment PARL.

Cette dernière approche a été menée dans le laboratoire du Dr Luca Pellegrini. J’ai réalisé par moi-même l’ensemble des étapes du système de double-hybride présentées dans le chapitre 2. J’ai également participé à l’analyse des clones séquencés.

Pour identifier les protéines correspondant aux ADNc isolées par le biais du système de Y2H, chaque séquence est soumise à une recherche sur une banque de données protéiques non redondante ( nr database ) en utilisant le programme BLAST disponible sur le serveur NCBI (http://www. ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/). Ce programme compare la séquence protéique entrée avec les séquences protéiques répertoriées dans la banque et fournit en réponse les séquences produisant des alignements significatifs avec la séquence d’entrée, en précisant le pourcentage de similarité. Nous avons ainsi pu identifier les protéines interagissant potentiellement avec les différentes régions de PARL utilisées comme appât. Bien que le Y2H soit un système puissant de détection d’interaction protéine-protéine, se pose toujours le problème des faux positifs qui représentent une part importante des clones sélectionnés. Les faux positifs correspondent en majorité à des protéines interagissant de manière aspécifique ( sticky proteins ) avec l’appât. La plupart de ces faux positifs sont recensées dans des banques de données sur les faux positifs obtenus en routine par Y2H (i.e. http://www.fccc.edu/research/ labs/golemis /InteractionTrapInWork.html). Ainsi nous avons retrouvé parmi les clones sélectionnés des facteurs d’élongation, la ferritine, des lamines, des protéines de choc thermique (HSP), l’ubiquitine, des protéines du protéasome ou encore des protéines ribosomales qui sont tous des faux positifs. Pour l’appât HP317-379, nous avons ainsi éliminé ~70% des clones correspondant aux faux positifs, pour l’appât HP1-96, 60% des clones sélectionnés se sont avérés des faux positifs (Tableau 3-2). Ainsi, 36 interacteurs potentiels ont été isolés pour l’extrémité C-terminale de PARL, et 97 interacteurs potentiels pour l’extrémité N-terminale.

Le Tableau 3-2 résume le nombre clones criblés pour chaque appât et chaque librairie ainsi que le nombre de clones positifs séquencés.

Deux appâts ont été utilisés PARL-NT (aa 1-96) et PARL-CT (aa 317-379). Une librairie de cerveau fœtal humain et une librairie de cellules HeLa ont été criblées.