4 DISCUSSION

Table des matières

Pour approcher la fonction biochimique de PARL, nous avons conduit une analyse phylogénétique sur l’ensemble des membres de la super-famille RHO à laquelle appartient PARL. Une première analyse de ses membres démontre que la super-famille RHO est présente à tous les niveaux évolutifs, chez les eucaryotes, procaryotes et archæbactéries. Une expansion de la super-famille RHO est observée chez les eucaryotes dont le nombre de gènes codant pour des Rhomboids est augmenté par rapport aux niveaux évolutifs inférieurs, suggérant une diversification fonctionnelle des Rhomboids chez les eucaryotes (cf. 3.1.1). L’alignement multiple des séquences des membres de la super-famille RHO révèle la présence d’un noyau conservé de 6 domaines TMH présent chez tous les membres recensés. Les domaines d’homologie sont concentrés dans les hélices transmembranaires de ces domaines. Or, les protéines munies de multiples domaines transmembranaires ne sont en général pas particulièrement conservées par l’évolution. Une recherche sur les banques de données recensant les COGs ( Cluster of Orthologous Groups ) montre que la super-famille des Rhomboids constitue une exception (Galperin et Koonin, 1999; Tatusov et al. , 2001). Non seulement cette famille est présente à tous les niveaux évolutifs, mais la conservation évolutive de certains résidus présents dans le noyau conservé de 6 TMH est étonnante et peu caractéristique des protéines non-enzymatiques membranaires comme les transporteurs (Mushegian et Koonin, 1996; Pellegrini et al. , 2001). Ceci laisse suggérer une activité enzymatique intramembranaire pour cette famille. Cette hypothèse est confirmée par la présence de résidus hautement conservés évolutivement dans les TMH. Notamment, à l’intérieur du noyau conservé, se retrouvent les acides aminés catalytiques caractérisés chez Rhomboid-1 de la Drosophile (Urban et al. , 2001). Ainsi, la sérine catalytique située dans le domaine TMH4 du noyau conservé, et centrée sur le motif GxSxG caractéristique des protéases à sérine activée (Brenner, 1988) se retrouve chez tous les membres de la famille, à deux exceptions près, accompagnée de l’histidine catalytique du TMH6. Le domaine TMH2 contient également deux autres résidus histidines et un résidu asparagine conservés chez une grande majorité des protéines Rhomboids. L’asparagine conservée est nécessaire pour le clivage de Spitz (Urban et al. , 2001), cependant, la fonction des autres résidus conservés reste inconnue. Il est fortement envisageable qu’ils participent également à la catalyse. La protéine PARL possède tous ces résidus catalytiques, ce qui suggère fortement qu’elle possède aussi une activité de sérine-protéase, tout comme Rhomboid-1. En revanche, certains membres eucaryotes ne possèdent pas l’histidine ou la sérine catalytique et correspondraient vraisemblablement à des protéases inactivées. Ces formes inactivées pourraient être des régulateurs des protéases actives, agissant par exemple comme des dominants négatifs.

Ces résultats suggèrent très fortement que l’ensemble des membres de la super-famille RHO, y compris la protéine PARL, possédant le motif catalytique sont des sérines-protéases assurant la protéolyse intramembranaire régulée.

Nos analyses bioinformatiques montrent l’existence de deux sous-familles eucaryotes distinctes au sein de la super-famille Rhomboid, les Rhomboids d’un côté et les PARLoids de l’autre (cf. 3.1.2). Cette hypothèse est supportée par l’histoire évolutive particulière de la super-famille Rhomboid. En effet, bien que les Rhomboids soient représentées à tous les niveaux évolutifs, l’arbre phylogénétique de la super-famille RHO ne suit pas les scénarii classiques communément acceptés pour expliquer l’origine et la dissémination d’une famille de protéines conservées. Par exemple, le scénario impliquant un clivage majeur entre les lignées archæ-eucaryotes et bactériennes (Brown et Doolittle, 1997) n’est pas envisageable vu l’hétérogénéité phylogénétique des sous-ensembles Rhomboids qui ne définissent pas de clades monophylétiques. Le "scénario mitochondrial" postulant l’acquisition de gènes par les eucaryotes à partir d’un endosymbionte mitochondrial et sa dissémination subséquente par transferts de gènes verticaux, c’est à dire des niveaux évolutifs inférieurs vers les niveaux supérieurs, n’est pas non plus envisageable (Lang et al. , 1999).

Pour expliquer la structure inhabituelle de l’arbre phylogénétique de la super-famille RHO, il faut envisager une histoire évolutive différente des scénarii classiques et faisant intervenir de multiples transferts de gènes horizontaux ou latéraux (TGH). Ainsi, la famille des Rhomboids a pu émerger dans une lignée bactérienne et être disséminée par TGH dans certaines lignées, puis perdue par d’autres lignées. Les Rhomboids des archæbactéries et des eucaryotes, quant à elles, semblent avoir été acquises au cours de deux évènements indépendants. Depuis quelques années, une importance croissante est accordée aux transferts de gènes horizontaux comme évènements majeurs dans l’évolution des eucaryotes (Jain et al. , 1999; Salzberg et al. , 2001). En effet, il a été suggéré que les premiers temps de l’évolution des eucaryotes ont été dominés par des TGH issus de multiples symbiotes bactériens (Koonin, 2002). En particulier, au moins deux évènements de TGH semblent avoir été à l’origine des Rhomboid eucaryotes, l’un ayant donné naissance à la sous-famille Rhomboids et l’autre à la sous-famille des PARLoids. En considérant la représentation extensive des deux sous-famille eucaryotes, les PARLoids et les Rhomboids ont du être acquises via TGH de manière précoce au cours de l’évolution des Eucaryotes. Les PARLoids et les Rhomboids forment donc deux sous-familles distinctes évolutivement.

Cette distinction est confortée par une organisation structurale différente autour du noyau catalytique conservé de 6 TMH (Figure 4-1). La sous-famille Rhomboid prototypée par Rhomboid-1 possède en plus du cœur conservé de 6 TMH un domaine supplémentaire positionné en C-terminal. La deuxième sous-famille prototypée par la protéine PARL adopte une structure différente : le domaine supplémentaire est ajouté en N-terminal. Ces domaines supplémentaires pourraient ajouter des fonctionnalités différentes entre les PARLoids et Rhomboids eucaryotes. Ainsi, bien que Rhomboid et PARL assurent la même fonction biochimique de sérine-protéase, les deux sous-familles sont distinctes et la protéine PARL devient donc le prototype d’une nouvelle sous-famille de sérines-protéases assurant la protéolyse intramembranaire régulée.

La distribution phylogénétique de la super-famille RHO montre que cette protéase membranaire est extrêmement conservée. Cependant, son absence chez quelques espèces montre qu’elle ne serait cependant pas essentielle pour la survie cellulaire. Il est envisageable que l’ancêtre ultime de la famille des Rhomboids ait évolué à partir d’une forme plus primitive de protéine membranaire non-enzymatique, probablement un transporteur, qui aurait été impliqué dans l’export de peptides-signal chez les bactéries (Figure 4-2). Le site actif protéolytique aurait évolué suite à l’émergence aléatoire d’acides aminés catalytiques à l’intérieur de deux ou trois domaines transmembranaires.

Figure 4- 1 : Évolution des deux sous-familles eucaryotes de la super-famille des RHO : PARLoids et Rhomboids .

A partir du noyau conservé RHO de 6 TMH retenant l’activité catalytique de sérine-protéase, des domaines supplémentaires ont été ajoutés au cours de l’évolution, conférant des fonctionnalités différentes aux deux sous-familles. Le domaine supplémentaire des Rhomboids est en C-terminal alors que celui des PARLoids est en N-terminal.

Ces évènements auraient permis la transition d’une fonction de transport simple vers une fonction de libération contrôlée par la RIP de molécules-signal. L’émergence de la RIP aurait constitué une avancée vers la communication intercellulaire, conférant un avantage sélectif aux bactéries ayant fixé ces mutations. Le gène aurait ensuite été disséminé par HGT et fixé chez de nombreux organismes (Figure 4-2). Nous pouvons envisager que l’acquisition de la RIP ait joué un rôle central pour l’évolution vers des organismes multicellulaires. La nécessité de la conservation de l’activité protéolytique a verrouillé la famille des Rhomboids dans un régime d’évolution lente, ce qui a conduit à la similarité significative entre les différents membres de la famille. Ce scénario évolutif à partir d’une fonction de transport vers la RIP pourrait être applicable à d’autres enzymes membranaires, incluant des RIP-protéases comme les présénilines et leurs homologues qui définissent une large famille également présente à tous les niveaux évolutifs (Pellegrini et al. , 2001; Ponting et al. , 2002).

Son appartenance à la classe des RIP protéases place PARL dans un contexte très intéressant en matière de transduction du signal. De plus en plus de voies de signalisation cellulaires essentielles pour le développement d’organismes aussi divers que C. elegans, D. melanogaster ou les mammifères apparaissent régulées par la RIP (Urban et Freeman, 2002). Particulièrement, un rôle de plus en plus important est accordé à la RIP dans les voies de transduction du signal au niveau neuronal ainsi que dans le développement du cerveau des Vertébrés (Ye et Fortini, 2000; Ebinu et Yankner, 2002). En effet, les présénilines, constituant la deuxième grande famille de RIP-protéases caractérisée jusqu’à maintenant assurent le clivage de substrats neuronaux, que ce soit Notch, APP ou encore le récepteur aux EGF ErbB4 (cf. 1.2.2 . et 1.4.1.2 ). La protéolyse intramembranaire régulée conduit dans les trois cas à la libération de facteurs de transcription essentiels pour le contrôle de voies développementales ou pathogéniques (Ebinu et Yankner, 2002). L’ARNm de PARL étant détectable dans le cerveau adulte (Pellegrini et al., 2001), nous avons voulu préciser la fonction cellulaire de l’activité RIP-protéase de PARL dans le cerveau.

La figure montre schématiquement les trois étapes d’évolution de la famille Rhomboid. I– L’ancêtre primitif de la famille Rhomboid a une fonction de transporteur pour un peptide régulateur dans une lignée bactérienne. II– Le site catalytique de la protéase intramembranaire subit une transition vers le mécanisme de RIP pour la libération contrôlée du peptide régulateur. III– L’émergence de la RIP est suivie d’une explosion de transferts de gènes horizontaux (TGH). R, peptide régulateur; les hélices transmembranaires du noyau conservé des Rhomboid sont notifiées par des rectangles numérotés de 1 à 6, leur topologie dans la membrane est celle proposée par Urban et al. (Urban et al. , 2001). L’histidine et la sérine catalytiques sont reliées par un trait discontinu qui montre le système de transfert de charge de la protéase; les autres résidus potentiellement catalytiques ne sont pas mentionnés (d’après Koonin et al. , 2003).

Les analyses en Northern Blot conduites précédemment montrent que le gène de PARL est exprimé de manière ubiquitaire dans tous les tissus adultes et fœtaux testés, mais à des niveaux différents (Pellegrini et al. , 2001). Particulièrement, de forts niveaux d’expression de l’ARNm sont observés dans le cerveau humain fœtal et adulte (Pellegrini et al. , 2001). Nous avons généré avec succès l’anticorps polyclonal anti-PARL T2 qui reconnaît spécifiquement la protéine PARL en western-blot. Nos études confirment l’expression de la protéine PARL dans le cerveau de souris (Figure 3-3). De plus, la distribution sub-cellulaire de PARL montre qu’elle est concentrée dans les fractions membranaires, et particulièrement dans les fractions contenant de la membrane plasmique (Figure 3-4). Ces résultats corroborent nos analyses bioinformatiques qui indiquaient que PARL est une protéine membranaire, comme tous les membres de la famille Rhomboid et toutes les autres RIP-protéases caractérisées jusqu’à maintenant. PARL est également détectée dans la fraction synaptosomale correspondant aux vésicules synaptiques associées à la membrane présynaptique, ce qui laisse suggérer qu’elle est présente sur toute la surface des neurones. D’autre part, la protéine PARL concentrée dans la fraction enrichie en membrane plasmique (LP1) apparaît à un PM supérieur (10 kDa environ de plus que le PM prédit de 42 kDa) (Figure 3-4), ce qui laisse supposer qu’après son transport et son insertion dans la membrane plasmique, PARL subit des modifications post-traductionnelles. De nombreux exemples de protéases subissant des modifications post-traductionnelles multiples sont représentés dans la littérature. Par exemple, BACE, la protéase assurant le premier clivage de APP au site β (cf. 1.3.1.1; Figure 1-4) subit une N-glycosylation dans les compartiments sécrétoires (Haniu et al. , 2000) et est également palmitoylée dans son domaine cytoplasmique (Benjannet et al. , 2001) et enfin phosphorylée (Capell et al. , 2000; Haniu et al. , 2000; Huse et al. , 2000; Walter et al. , 2001). Ces modifications régulent son trafic entre les compartiments sécrétoires et son activité enzymatique. La préséniline-1 subit des phosphorylations multiples par les protéines-kinases A et C (PKA, PKC) (De Strooper et al. , 1997; Seeger et al. , 1997; Kirschenbaum et al. , 2001), la glycogène-synthase-kinase-3β (GSK-3β) (Kirschenbaum, Hsu et al. 2001) et la kinase 5 cycline-dépendante (cdk5/p35) (Lau et al. , 2002). Ces modifications contrôlent l’endoprotéolyse de PS-1 et contribuent à stabiliser l’hétérodimère fonctionnel (cf. 1.3.1.2). Bien qu’aucun site consensus de phosphorylation, de lipidation ou de glycosylation ne soit détecté sur la séquence de PARL, ces types de modification ne peuvent être exclues. Ces modifications post-traductionnelles de PARL pourraient moduler son activité de RIP-protéase. Une autre possibilité pour expliquer cette forme de PARL de PM plus élevé envisage un épissage alternatif de l’ARNm de PARL conduisant à la formation de plusieurs isoformes de PM différents.

PARL est donc une protéine transmembranaire exprimée dans le cerveau de souris. Les travaux précédents ont également montré son expression dans le cerveau foetal (Pellegrini et al., 2001), nous nous sommes alors intéressés à son profil d’expression au cours du développement du cerveau, particulièrement pendant la période postnatale.

Au cours du développement embryonnaire précoce, des mouvements morphogénétiques de cellules précurseurs établissent les rombhomères du rhombencéphale, la couche germinale externe du cervelet et les limites latérales du télencéphale. Au milieu de la gestation, après le début de la neurogenèse primaire dans les zones ventriculaires, les cellules post-mitotiques vont migrer de manière orientée le long d’un réseau formé de fibres gliales, établissant les premières couches neuronales (Hatten, 1999). À la naissance, la neurogenèse primaire est donc achevée et les structures principales du cerveau sont en place. Au cours du développement postnatal, une seconde vague de neurogenèse va produire en grand nombre des interneurones destinés au cortex cérébral, au cortex du cervelet, à la formation hippocampique et au bulbe olfactif. Nous avons étudié le profil d’expression de PARL au cours de cette période de développement postnatal du cerveau de souris, à partir de la naissance. Nos analyses immunohistochimiques montrent que l’expression de PARL est restreinte temporellement et spatialement au cours du développement postnatal du cerveau de souris. Ainsi, chez les nouveau–nés, PARL est largement exprimée dans le néocortex, le cervelet, la zone subventriculaire et toute la formation hippocampique, les structures majeures du cerveau qui subissent un remodelage important durant la période postnatale (Hatten, 1999). Un parallèle intéressant peut être fait entre l’évolution du profil d’expression de PARL et l’état de différenciation de chacune des structures où elle est exprimée.

Formation hippocampique

À la naissance (jour postnatal 0 ou P0), l’organisation de la formation hippocampique est encore très rudimentaire et est le siège d’une activité mitotique intense. PARL est fortement exprimée dans toute la formation. La région des cornes d’Ammon (CA1-3) montre une expression de PARL forte à la naissance et qui disparaît graduellement, d’abord du CA3 (entre P7 et P11), puis du CA1 (entre P14 et P21). Or, les neurones pyramidaux du CA se différencient suivant un gradient morphogénétique : les neurones du CA3ab qui ont été générés très tôt au cours du développement embryonnaire (E17 pour le rat), se différencient en premier, puis ce sont les cellules du CA1 générées un peu plus tardivement (E19 pour le rat), qui arrivent à maturité (Bayer et Altman, 1975; Bayer, 1980a, b). L’expression de PARL diminue donc dans les zones en différenciation et se maintient dans les zones encore en prolifération. La zone proliférative secondaire dérivée du neuroépithélium primaire embryonnaire et située à l’emplacement du futur gyrus denté est le siège d’une activité mitotique intense (Hatten, 1999) et toutes les cellules la constituant expriment PARL. Les cellules précurseurs des cellules granulaires y subissent une expansion clonale qui va générer 85% des neurones de l’hippocampe au cours de la première semaine de vie postnatale (de P0 à P4) chez le rat (Altman et Bayer, 1990a, b, c). Ces neurones vont former d’abord l’aile supérieure puis l’aile inférieure du gyrus denté. C’est précisément dans l’aile inférieure que l’expression de PARL est la plus importante (Figure 3-7). Dans le gyrus denté, une seule couche cellulaire reste indifférenciée pendant toute la vie de l’animal: la zone subgranulaire. Et c’est précisément dans cette zone que l’on retrouve une expression résiduelle de PARL dès P21. En effet, à P21, le profil d’expression de PARL est comparable à celui observé chez l’adulte, avec une immunoréactivité résiduelle au niveau de la SGZ du gyrus denté, de la SVZ, du RMS et du bulbe olfactif, les zones de neurogenèse chez l’adulte. L’expression de PARL est donc restreinte aux populations en prolifération ou en phase précoce de différenciation neuronale.

Cortex cérébral

À P0, les couches corticales sont organisées de manière très grossière et sont toutes fortement immunoréactives pour PARL (Figure 3-8). Dans le néocortex en développement, une autre zone proliférative secondaire se développe au-dessus de la zone proliférative primaire générée pendant l’embryogenèse. Cette zone subventriculaire (SVZ) va donner naissance à des cellules gliales et des neurones dans la période postnatale précoce. L’expression de PARL décroît graduellement avec l’âge pour disparaître des couches inférieures à P7 et des couches supérieures à P11. Or, plusieurs vagues de migration radiale au cours de la première semaine postnatale vont conduire à une organisation progressive des différentes couches. Les neurones générés précocement occupent les couches inférieures alors que les neurones générés plus tardivement peuplent les couches externes. Dans le cortex, l’expression de PARL disparaît donc d’abord des couches qui se différencient en premier, mais se maintient dans les couches I-III générées plus tardivement. A P11, le cortex a fini sa phase de prolifération et de migration et l’expression de PARL est absente. L’expression de PARL est donc là encore inversement corrélée à l’état de différenciation.

Cortex du cervelet

À P0, le cervelet adopte une structure très rudimentaire. Des trois couches cellulaires qui vont constituer le cortex du cervelet mature, seule la couche de cellules de Purkinje (pl) générées au cours du développement embryonnaire est en place. PARL est exprimée dans tout le cervelet, particulièrement au niveau de la couche granulaire externe (egl). Cette couche temporaire est le siège d’une activité mitotique intense des précurseurs neuronaux. Tout comme la zone du gyrus denté et la SVZ, cette couche est une zone proliférative secondaire constituée à partir de précurseurs de cellules granulaires situés dans la zone ventriculaire adjacente au 4ième ventricule (Hatten, 1999). Après une expansion clonale dans la couche granulaire externe, les cellules granulaires entament leur différenciation et commencent une migration radiale à travers la couche de cellules de Purkinje pour former la couche granulaire interne. PARL commence à être détectée dans l’igl, dès le début de sa formation. Ces cellules marquées sont vraisemblablement des neurones indifférenciés qui ont commencé à exprimer PARL dans l’egl et qui ont migré vers l’igl. Au terme de cette migration, les cellules granulaires terminent leur différenciation pour former l’igl mature entre P11 et P14 (Altman, 1972a, b, c; Altman et Bayer, 1985a, b, c), l’expression de PARL disparaît alors de l’igl. Lorsque l’igl est pleinement constituée, la période proliférative dans l’egl se termine, l’egl régresse alors. À P11 l’egl est déjà très réduite, à P14 elle a quasiment disparu, seules quelques cellules résiduelles PARL-positives la peuplent (Figure 3-9). Enfin, dès P21 ne restent que les trois couches corticales du cervelet : la couche moléculaire externe (ml) contenant les axones des cellules granulaires et les dendrites des cellules de Purkinje, la couche de cellules de Purkinje (pc) et enfin la couche granulaire interne (igl). L’expression de PARL n’est pas détectée dans ces couches différenciées. L’expression de PARL est donc limitée à la phase proliférative et au début de la différenciation des cellules granulaires du cervelet.

Ainsi, au cours du développement postnatal du cerveau de souris, l’expression de PARL est limitée aux zones prolifératives secondaires. Lorsque la période proliférative se termine et que les neurones issus de ces zones prolifératives secondaires entrent en différenciation, l’expression de PARL décroît. PARL aurait donc un rôle dans la prolifération ou les étapes précoces de la différenciation neuronale. PARL serait donc sélectivement exprimée dans les cellules prolifératives ou les neurones immatures. Pour valider cette hypothèse, nous avons réalisé des co-marquages avec des marqueurs de prolifération/différenciation du SNC.

Les co-marquages indiquent que PARL est exprimée dans les cellules PCNA positives du cortex et du cervelet (non montré), du gyrus denté et de la SVZ (Figure 3-10). La protéine PCNA ( Proliferative Cellular Nuclear Antigen ) est utilisée comme marqueur physiologique ou pathologique des cellules en prolifération (Ino et Chiba, 2000). PCNA fonctionne comme une protéine auxiliaire des DNA polymérases δ et ε et est requise pour la réplication et la réparation de l’ADN. PCNA est un marqueur général des cellules en prolifération : synthétisée en fin de phase G1-début de phase S, son expression précède immédiatement le début de la synthèse d’ADN, culmine en phase S et décline en phase G2/M. Son expression décline également lorsque les cellules deviennent quiescentes (Ino et Chiba, 2000). PARL est donc exprimée dans les cellules en prolifération, vraisemblablement des cellules précurseurs neuronales des zones prolifératives secondaires. D’autre part, PARL est co-exprimée avec l’isoforme neuro-spécifique de la β−III tubuline reconnue par l’anticorps TuJ-1 (Figure 3-11). L’expression de cette protéine du cytosquelette neuronal est initiée juste avant la mitose finale des précurseurs neuronaux et constitue donc un évènement précoce de la différenciation neuronale (Memberg et Hall, 1995). L’abondance de cette isotype de la tubuline augmente en conjonction avec l’état de différenciation neuronale et son expression perdure chez les neurones matures (Menezes et Luskin, 1994). PARL est donc aussi bien exprimée dans les précurseurs neuronaux mitotiques que dans les neurones post-mitotiques immatures.

Au cours de la 1ère semaine de vie postnatale, certaines cellules PARL-positives sont aussi positives pour le marqueur neuronal tardif NeuN, notamment dans le cortex et le cervelet (non montré). Après P11, PARL n’est plus co-exprimée avec NeuN, sauf au niveau de la couche granulaire du gyrus denté de l’hippocampe. Cette couche suit un gradient neurogénétique : les couches externes se différencient plus précocement que les couches internes (Bayer, 1980a, b). Le gradient d’expression de NeuN observable à P14 dans la zone granulaire du gyrus denté illustre précisément ce gradient neurogénétique (Figure 3-12; Figure 3-13). En effet, il a été montré que l’expression de NeuN commence faiblement lorsque les neurones deviennent post-mitotiques et commencent à initier leur différenciation, puis augmente graduellement avec l’état de différenciation du neurone. Ainsi, de forts niveaux d’expression de NeuN correspondent à un stade hautement différencié du neurone (Mullen et al. , 1992). En revanche, un gradient inverse d’expression de PARL est observé, montrant que PARL cesse d’être exprimée à des niveaux détectables dans les neurones matures (Figure 3-12; Figure 3-13).

Le profil d’expression de PARL est régulé spatialement et temporellement au cours du développement postnatal du cerveau. A l’échelle systémique, PARL ne semble requise que dans les zones prolifératives secondaires ou en début de différenciation. A l’échelle cellulaire, PARL n’est requise que dans les cellules précurseurs en prolifération ou dans les neurones en phase précoce de prolifération. La Figure 4-3 résume l’expression de PARL en fonction des étapes de différenciation neuronale et en parallèle avec l’expression des marqueurs de prolifération/différenciation du SNC. Ces résultats orientent vers l’hypothèse que l’activité RIP-protéase de PARL joue un rôle dans la neurogenèse au cours du développement postnatal du cerveau de souris. Chez l’adulte, l’expression de PARL perdure dans les zones de neurogenèse actives tout au long de la vie de l’animal, suggérant que PARL continue à jouer un rôle même lorsque le développement du SNC est terminé.

Figure 4- 3 : Évolution des niveaux d’expression de PARL en fonction de l’état de différenciation des neurones et de l’expression des marqueurs de prolifération/différenciation du SNC.

L’expression de PARL commence au stade prolifératif dans les cellules souches neurales. Lorsque la cellules souche s’oriente vers la destinée neuronale, PARL continue d’être exprimée dans les progéniteurs neuronaux. Son expression perdure pendant les premiers stades de différenciation du neurone immature post-mitotique. Son expression cesse d’être détectable dans le neurone mature.

Au cours du développement postnatal du cerveau, l’expression de PARL décroît graduellement. Dans le cerveau de souris adulte, l’expression de PARL est restreinte à la zone subgranulaire du gyrus denté de l’hippocampe (SGZ), à la zone subventriculaire (SVZ), au courant migratoire rostral (RMS) et au bulbe olfactif. Ces régions correspondent aux zones de neurogenèse active tout au long de la vie de l’animal (Figure 4-4). En effet, une série d’études ont montré que la production de neurones continue dans ces régions discrètes du cerveau adulte (pour revue, voir (Taupin et Gage, 2002)). L’activité mitotique de la zone subventriculaire et de la SGZ adultes est bien documentée dans la littérature et laisse suggérer la présence de cellules souches neurales ( Neural Stem Cells ou NSC) dans ces régions (pour revue voir (Weiss et al. , 1996)). Les NSC sont des cellules pluripotentes se divisant de manière asymétrique, produisant une copie d’elle-même et une cellule-fille unipotente plus engagée soit vers la destinée neuronale, soit vers la destinée gliale. Ces cellules-filles unipotentes peuvent être appelées cellule précurseur neuronale ou gliale suivant leur destin cellulaire final (Scheffler et al. , 1999). A l’état quiescent, les NSC sont des petites cellules avec des noyaux denses et fusiformes ne présentant aucun des caractères matures des cellules du SNC différenciées : absence de prolongements cytoplasmiques et aucune activité électrique, c’est à dire qu’elles ne reçoivent aucun input synaptique.

Sous l’impulsion de signaux neurogéniques, ces NSC entrent en prolifération puis en différenciation pour générer des neurones et des cellules gliales. Les neurones néoformés dans l’hippocampe adulte sont issus des NSC de la SGZ du gyrus denté et vont migrer sur une petite distance vers la couche granulaire où ils se différencient et établissent des connexions avec les réseaux hippocampiques préexistants (Altman et Das, 1965; Kaplan et Hinds, 1977; Bayer et al. , 1982; Kaplan et Bell, 1983; Cameron et al. , 1993; Kuhn et al. , 1996; Kempermann et al. , 1997; van Praag et al. , 2002). Les neurones néoformés dans la zone subventriculaire empruntent le courant migratoire rostral et viennent repeupler le bulbe olfactif (Altman et Das, 1965; Altman, 1969; Kaplan et Hinds, 1977; Bayer et al. , 1982; Bayer, 1983; Kaplan et Bell, 1983; Kishi, 1987; Cameron et al. , 1993; Corotto et al. , 1993; Lois et Alvarez-Buylla, 1993; Kuhn et al. , 1996; Kempermann et al. , 1997).

Figure 4- 4 : Neurogenèse et cellules souches neurales du système nerveux central adulte.

(A) Les cellules souches neurales ( Neural Stem Cells ou NSC) sont des cellules pluripotentes capables de se renouveler et de donner naissance à toutes les lignées cellulaires du système nerveux central : neurones, astrocytes et oligodendrocytes. (B) Représentation sagittale des zones de neurogenèse chez l’adulte : le bulbe olfactif (OB) et le gyrus denté (DG) de l’hippocampe. Les nouveaux neurones du bulbe olfactif (OB) sont générés à partir des cellules souches neurales (NSC) de la zone subventriculaire (SVZ) bordant les ventricules latéraux (LV). Les NSC de la SVZ migrent vers le bulbe olfactif via le courant migratoire rostral (RMS), où elles se différencient en interneurones du bulbe olfactif. (C) Les nouvelles cellules neurales du gyrus denté adulte sont générées à partir de la zone subgranulaire (SGZ) du gyrus denté de l’hippocampe et se différencient en neurones et cellules gliales dans la zone granulaire (GL) du DG. Les nouveaux neurones de la GL établissent des connexions avec les neurones du CA3. (D) Deux théories s’affrontent concernant l’origine des cellules souches neurales de la SVZ adulte. Dans l’une, les NSC de la SVZ sont des cellules épendymales différenciées, les cellules spécialisées et ciliées bordant les ventricules latéraux (LV). Suivant l’autre théorie, les NSC sont des cellules astrocytaires de la SVZ exprimant le marqueur glial GFAP (d’après Taupin et Gage, 2002).

Certaines cellules PARL-positives adoptent une morphologie comparable à celle des cellules souches neurales. D’autre part, des études en microscopie électronique montrent que les corps cellulaires PARL-positifs de la SGZ ne reçoivent pas d’inputs synaptiques (A. Sik, résultats non publiés). Ces résultats orientent vers l’hypothèse que PARL est exprimée dans les cellules souches ou précurseurs neurales. Pour vérifier cette hypothèse, nous avons réalisé des co-marquages avec des marqueurs de prolifération/différenciation du SNC.

Les doubles-marquages PARL/PCNA montrent que PARL est exprimée dans les cellules mitotiques la SGZ et de la SVZ (Figure 3-16). Ces résultats sont corroborés par le double marquage PARL/BrDU (Figure 3-17). Le BrDU (5-bromo-2’-déoxyuridine) est un analogue de la thymidine. L’injection systémique de BrDU permet son incorporation dans l’ADN des cellules en phase S de mitose, marquant ainsi les cellules mitotiques (del Rio et Soriano, 1989). Ce marqueur est particulièrement utilisé pour marquer les cellules précurseurs du SNC en prolifération, à condition que les animaux soient sacrifiés rapidement après les injections de BrDU puisque les cellules n’auront pas eu le temps de se différencier (Cooper-Kuhn et Kuhn, 2002). Nous avons ainsi sacrifié les animaux 24h. après l’injection de BrDu pour éviter de marquer des cellules différenciées. Les cellules de la SGZ marquées avec le BrDU expriment aussi PARL (Figure 3-17), confirmant le fait que PARL est exprimée dans les cellules précurseurs mitotiques. La co-expression de PARL avec les marqueurs de prolifération PCNA et BrDU montre que l’expression de PARL commence dans les cellules souches neurales ou dans les cellules précurseurs neuronales ou gliales avant même le stade post-mitotique. Cependant, une population résiduelle PARL-positive n’est marquée ni par le BrDU, ni par PCNA, suggérant que l’expression de PARL perdure après le stade post-mitotique, c’est à dire lorsque les cellules précurseurs commencent à se différencier en neurones ou cellules gliales.

Pour vérifier que cette fraction de cellules PCNA et BrDU-négatives correspond à des cellules en différenciation, nous avons réalisé des doubles-marquages avec des marqueurs de différenciation neuronale ou gliale. Les co-marquages PARL/TuJ-1 indiquent que la plupart des cellules PARL-positives sont des neurones matures ou immatures TuJ-1 positifs (Figure 3-18). Les quelques cellules PARL-positives n’exprimant pas TuJ-1 sont vraisemblablement des cellules qui n’ont pas terminé leur prolifération et ne possèdent donc pas encore les caractères neuro-spécifiques précoces. En revanche, contrairement aux résultats obtenus chez des animaux plus jeunes, les neurones terminalement différenciés marqués par NeuN n’expriment jamais PARL. Ceci indique que l’expression de PARL à des niveaux détectables cesse chez le neurone mature. D’autre part, les co-marquages PARL/GFAP montrent que PARL n’est pas exprimée dans les cellules gliales matures exprimant le marqueur astrocytaire GFAP (Hajos et Kalman, 1989). Dans le cerveau adulte, PARL n’est donc pas détectable dans les neurones terminalement différenciés, ni dans les cellules gliales.

De manière intéressante, les cellules PARL-positives sont cantonnées dans la zone subgranulaire et le hylus du gyrus denté. Aucune immunoréactivité n’est détectée dans la couche granulaire où les neurones néoformés migrent pour peupler les couches supérieures. Dans le cerveau de souris adulte, l’expression de PARL est donc restreinte aux cellules souches neurales, aux cellules précurseurs neuronales et aux neurones immatures qui n’ont pas commencé leur migration (Figure 4-3). L’ensemble de ces résultats permet d’envisager que la fonction de PARL soit requise pour le maintien de l’état prolifératif des cellules souches, ou du moins dans des stades très précoces d’orientation vers la destinée neuronale. Par contre son expression n’est nécessaire que pour une période limitée de la vie du neurone. Son expression décroît au fur et à mesure de la différenciation pour s’arrêter à maturité. Cependant, les résultats obtenus en western-blot laissaient envisager une expression relativement importante de PARL chez l’adulte, que l’ont peut difficilement attribuer aux seules zones de neurogenèse adulte. Il est très envisageable que le seuil de détection soit beaucoup plus faible en immunohistochimie qu’en western-blot, ce qui expliquerait l’apparente disparité de résultats. Ainsi, l’expression de PARL pourrait perdurer chez le neurone mature, mais à des niveaux non détectables en immunohistochimie. Vu l’implication de PARL dans la prolifération/différenciation du SNC, il serait également intéressant de vérifier l’expression de PARL dans des tissus cancéreux.

Le rôle de la protéine PARL dans le développement du SNC rejoint le rôle de régulateurs développementaux attribué aux autres membres de la super-famille des Rhomboid caractérisés jusqu’à maintenant. En effet, la famille des Rhomboid-1 à -7 régule l’établissement de l’axe dorso-ventral de D. melanogaster (Urban et al. , 2001). Rhomboid régule la spécificité spatiale de la voie des EGFR de la Drosophile, puisque l’expression de Rhomboid est restreinte au neuroectoderme ventral, alors que les autres composants de la voie des récepteurs aux EGF sont largement exprimés dans toute la larve (Bier et al. , 1990; Schweitzer et al. , 1995; Golembo et al. , 1996; Bier, 1998) (cf. 1.4.3). De manière intéressante, Ventrhoid, le seul membre de la famille Rhomboid caractérisé jusqu’à maintenant chez les Vertébrés aurait également un rôle dans la régionalisation de l’axe dorso-ventral. En effet, l’expression de Ventrhoid prédomine dans le tube neural de l’embryon de souris (Jaszai et Brand, 2002). De la même manière, les profils d’expression de Rhomboid, Ventrhoid et de PARL dans le système nerveux sont restreints spatialement et évoluent de manière dynamique au cours du développement (cf. 1.4.2.3). L’expression différentielle de PARL doit permettre d’activer sélectivement une voie de signalisation participant à la neurogenèse, cependant, son substrat reste encore inconnu. Le laboratoire du Dr Pellegrini est actuellement en train d’analyser les candidats à l’interaction avec PARL obtenus en Y2H, à la recherche de substrats potentiels (cf. 3.5).

Nous avons montré que PARL a une expression différentielle eu cours du développement postnatal du SNC. Or chez la Drosophile, c’est la restriction spatiale et temporelle de Rhomboid qui préfigure les zones d’activation de la voie des EGF. Ainsi, l’expression différentielle de PARL pourrait également restreindre à des zones précises l’activation d’une voie de signalisation impliquée dans la neurogenèse à laquelle elle participe. Il a été montré que l’expression du gène Rhomboid-1 est contrôlée par le produit d’expression du gène net qui encode un facteur de transcription de la famille bHLH (Brentrup et al. , 2000). Net et Rhomboid-1 sont exprimées suivant des profils mutuellement exclusifs au cours du développement des disques imaginaux de la Drosophile. Une invalidation de l’activité Net entraîne une expression plus large de Rhomboid, et vice-versa. D’autre part, l’activation de la voie des EGF réprime la transcription de net , et Net réprime la transcription de rhomboid en interférant avec la voie de signalisation en aval de Rhomboid (Brentrup et al. , 2000). Un mécanisme régulateur similaire pourrait être envisagé pour le contrôle de l’expression de PARL au cours du développement. Le clonage du gène PARL permettrait de mieux comprendre les mécanismes régulateurs de son expression et conduisant à ce profil d’expression dynamique au cours du développement.

PARL a été initialement découverte par son interaction avec les présénilines (Pellegrini et al. , 2001) et nous avons montré l’implication de PARL dans la neurogenèse et le développement du système nerveux. Des études récentes montrent que PS-1 est également impliquée dans le contrôle de la neurogenèse, vraisemblablement en régulant négativement la voie de signalisation de Notch (Handler et al. , 2000). En effet, durant le développement du système nerveux, l’invalidation du gène de PS-1 conduit à une réduction de l’activation de la voie de signalisation de Notch, altérant la spécification du destin cellulaire des cellules précurseurs neuronales vers la voie neuronale post-mitotique. Ceci entraîne une augmentation du nombres de neurones post-mitotiques différenciés aux dépends des cellules précurseurs neurales, résultant en un pool de précurseurs réduit (Handler et al. , 2000). Cependant, le profil d’expression de PS-1 durant le développement postnatal du SNC diffère de celui de PARL. Contrairement à PARL, l’expression de PS-1 dans le cerveau à la naissance est très faible (Moreno-Flores et al. , 1999). Elle augmente graduellement au cours de la première semaine postnatale pour atteindre un maximum aux alentours de P11, particulièrement dans le cervelet et l’hippocampe (Moreno-Flores et al. , 1999), moment où l’expression de PARL décroît. Il ne semble donc pas que l’interaction PARL/PS-1 ait une signification fonctionnelle au cours du développement postnatal du SNC. En revanche, des travaux très récents montrent que PS-1 est exprimée dans les cellules précurseurs neuronales dans l’hippocampe de rat adulte (Wen et al. , 2002), suggérant un rôle pour les présénilines dans la neurogenèse adulte. PARL est également exprimée dans les cellules précurseurs neuronales du gyrus denté de l’hippocampe adulte, permettant d’envisager une signification fonctionnelle pour l’interaction PARL/PS-1.

Tant que le substrat de PARL restera inconnu, il est difficile de préciser sa voie de signalisation, et a fortiori de connaître la voie de transduction du signal dans laquelle PARL est impliquée. Cependant, le marquage nucléaire de PARL obtenu en immunohistochimie nous oriente vers un rôle direct de PARL dans la transduction du signal. En effet, la possibilité que l’extrémité N-terminale de PARL soit clivée puis adressée au noyau peut être envisagée. Il existe dans la littérature de nombreux exemples de facteurs de transcription synthétisés à l’état de précurseurs inactifs séquestrés dans une membrane biologique et dont le clivage permet la libération d’un fragment cytosolique qui est adressé au noyau où il va réguler l’expression de gènes spécifiques (Notch, fragment N-terminal de APP, SREBP) (cf. 1.1). Des résultats obtenus très récemment (Pellegrini, résultats non publiés) confirment cette hypothèse. En effet, l’extrémité N-terminale de PARL possède un signal de localisation nucléaire (NLS) putatif. La transfection transitoire dans des cellules HEK293 d’une protéine de fusion PARL-NT/GFP montre une localisation nucléaire du fragment N-terminal de la protéine. En revanche, l’utilisation d’une forme mutante au niveau des résidus du NLS potentiel se traduit par une localisation cytoplasmique et membranaire du fragment. Ces données montrent l’adressage au noyau du fragment N-terminal de PARL et expliquent le marquage nucléaire obtenu en immunohistochimie avec l’anticorps 4NT dirigé contre l’extrémité N-terminale cytosolique de PARL. Le site de clivage de PARL serait situé entre les deux régions reconnues par l’anticorps 4NT (aa54-69) et T2 (aa143-152), c’est-à-dire soit dans la partie du domaine N-terminal cytosolique placée juste avant le premier domaine transmembranaire TMH1, soit directement au cœur du TMH1. Ainsi la RIP-protéase PARL subirait une modification post-traductionnelle de type protéolytique, qui conduirait à l’adressage de son fragment N-terminal vers le noyau.

Dans l’hypothèse où le site de clivage de PARL est situé dans le premier domaine transmembranaire, une possibilité tout à fait intéressante serait que la protéine PARL soit capable d’une autoprotéolyse de type RIP. L’autoprotéolyse est un processus bien documenté dans la littérature, particulièrement dans le cas de SonicHedgeHog (SHH) (Hynes et al. , 1995; Roelink et al. , 1995). Synthétisé à l’état de précurseur inactif, SHH est capable d’une protéolyse autocatalytique dans un site clivage interne conduisant à la libération d’un fragment N-terminal (SHH-NT) actif. SHH-NT est ensuite lipidé (Porter et al. , 1996a) et diffuse dans l’espace extracellulaire. SHH-NT contrôle ainsi la différenciation cellulaire au cours du développement. Particulièrement, SHH-NT induit différents types cellulaires au niveau de la plaque neurale (Porter et al. , 1996a). De manière analogue, l’autoprotéolyse de la protéase PARL permettrait la libération de son extrémité N-terminale. En revanche, si le clivage a lieu dans un domaine extramembranaire, l’intervention d’une deuxième protéase est très envisageable. PARL pourrait catalyser la RIP d’un précurseur d’une protéase, ou bien encore d’une protéine associée avec cette protéase hypothétique, entraînant la libération et l’activation d’une protéase cytosolique qui pourrait alors assurer le clivage de PARL. Le fragment N-terminal serait adressé au noyau où il pourrait avoir un rôle transcriptionnel et moduler notamment l’expression de gènes impliqués dans la neurogenèse. Le clivage de protéases est un phénomène courant, par exemple, la protéase BACE est endoprotéolysée, ce clivage régulant son activité (Huse et al. , 2003). De manière analogue, les présénilines subissent un clivage au niveau d’un boucle extramembranaire qui conduit à la stabilisation de leur forme activée (Thinakaran et al. , 1996; Ratovitski et al. , 1997). En revanche, l’adressage après clivage d’un fragment de la protéase est un phénomène nouveau, absent de la littérature.

Le rôle transcriptionnel du fragment PARL-NT pourrait être assuré de deux manières. Soit directement comme le fragment N-terminal de SREBP qui appartient à la famille des facteurs de transcription bHLH, cependant, aucune homologie avec des facteurs de transcription connus n’est détectée dans la partie N-terminale de PARL. C’est pourquoi un rôle indirect pourrait être envisagé, comparable à celui observé pour le fragment N-terminal de Notch (NICD) qui se lie aux facteurs de transcription de la famille CSL (Schroeter et al. , 1998). De la même manière, AID, le fragment N-terminal de APP issu du clivage de APP par les présénilines forme un complexe avec le facteur de transcription Fe65 et agit ainsi sur la transcription via une action sur Tip60, une histone acétylase (Cao et Sudhof, 2001). La caractérisation des partenaires cellulaires de PARL-NT par le système de double-hybride en Levures semble abonder dans ce sens (cf. 3.5). En effet, parmi les protéines interagissant avec l’extrémité N-terminale de PARL, se retrouvent de nombreux facteurs de transcription. Bien sûr, ces interactions détectées en Levures nécessitent d’être validées in vitro et in vivo , mais ces résultats orientent vers un rôle régulateur de la transcription pour PARL-NT. Une autre voie de signalisation parallèle ferait intervenir un substrat encore inconnu de PARL. La libération de fragments actifs à partir du substrat pourrait générer un signal extracellulaire (sécrétion d’un facteur) ou intracellulaire (libération d’un facteur de transcription), impliqué dans la prolifération/différenciation du SNC. La Figure 4-5 résume les différents mécanismes envisageables pour la transduction d’un signal par PARL.

Figure 4- 5 : Modèles des mécanismes possibles de contrôle de la prolifération/ différenciation neuronale par la protéine PARL

Figure 4-5 (voir légende page suivante)

(a) Selon un premier scénario, PARL pourrait subir une RIP par autoprotéolyse ou bioen encore une protéolyse assurée par une autre RIP-protéase ou une protéase encore non identifiée, générant le fragment PARL-NT ensuite adressé au noyau où il pourrait réguler la transcription de gènes spécifiques impliqués dans la prolifération ou la phase précoce de différenciation neuronale. (b) Un autre scénario envisage le clivage d’un substrat encore inconnu assuré par PARL. Ce clivage pourrait activer des voies de signalisation dans les cellules adjacentes, maintenant l ‘état prolifératif ou bien favorisant la différenciation neuronale., ou bien encore moduler directement la prolifération ou la différenciation neuronale en agissant au niveau transcriptionnel. Une autre possibilité serait que le substrat de la RIP de PARL soit une protéase ou un co-facteur de protéase. Sa RIP entraînerait son activation et un clivage subséquent de PARL (flèche pointillée).