CHAPITRE 2 : MATÉRIELS ET MÉTHODES

Table des matières

Les échantillons de sols que nous avons utilisé dans ce projet, ont été collectés en été 2000. Certains, à partir de sites situés sur les champs cultivés de l’action blé de Dire, dans la région de Tombouctou au Nord du Mali. D’autres, à partir de sites adjacents à la mine de phosphate, au nord-est de Bourem, dans la vallée du Tilemsi, au Nord du Mali. Des échantillons composites de sols, ont été prélevés sur plusieurs parcelles de ces sites à des profondeurs variant de 5 à 10 cm. Les échantillons recueillis dans des récipients stériles, ont été séchés à l’air et passés au tamis à mailles 5 mm pour éliminer les cailloux et les gros débris de matière organique, puis sur tamis à mailles 2 mm. Chaque échantillon de sol de 2 mm ainsi obtenus a été divisé en deux parties. Une première moitié pour l’analyse chimique du sol et l’autre moitié pour les tests d’isolement. Le phosphore extractible, le potassium (K), le calcium (Ca) et le magnésium (Mg) ont été déterminés selon une méthode modifiée de Mehlich 3 (Mehlich, 1984). L’extraction de ces éléments a été faite en plaçant 2.3 cm3 de sol dans des boites d’extraction en plastiques, contenant 100 ml de la solution extractive Mehlich 3, composée de 0.2N CH3COOH, 0.25N NH4NO3, 0.015N NH4F, 0.013 HNO3 et 0.01M EDTA. Le phosphore dans les extraits, a été mesuré par la méthode colorimétrique de Tandon et al (1968). Le K a été mesuré par émission en flamme, tandis que, le Ca, Mg, le Mn, le Zn et le Cu ont été mesurés par absorption atomique. Le pH des sols a été déterminé dans une solution de CaCl2. 0,01M La détermination de la matière organique a été faite selon la méthode de Walkley et Black (McKeague, 1978). La distribution des particules de sol a été mesurée par la méthode de l’hydromètre de Bouyoucos (McKeague, 1978).

Le phosphate naturel de Tilemsi (PNT) est un carbonate apatité dont les dépôts sont localisés dans la vallée de Tilemsi à côté de In-Tassit. Il renferme 23 à 32% de P2O5 et sa solubilité dans le citrate neutre d’ammonium est de 4,2% (Bationo et al., 1997). La composition de la poudre fine de PNT déterminée au laboratoire de foresterie (Université Laval) est de (en mg/g) : P, 150; Ca, 328,9; Al, 19,6, F, 29. Le phosphore extractible du PNT déterminé selon la méthode standard décrite dans le journal officiel de la communauté Européenne (1977).

Le P du PNT a été extrait en plaçant un échantillon de 0,400g de PNT dans des tubes a centrifugation en polypropyrène de 50 ml contenant 40 ml de d’acide formique 2% (20 g/l) ou d’acide citrique 2%. Les tubes ainsi traités ont été agités pendant 30 minutes, centrifugés à 8000 g pendant 10 minutes et leur contenu filtré avec un papier watmann No 41. 3 répétions ont été mises sur place pour chaque extraction. Le P extrait a été mesuré par la methode jaune du vanado molybdate (Tandon et al., 1968). Le P extrait par cette méthode était de 16,2 mg/g dans l’acide citrique 2% et 73,4 mg/g dans l’acide formique 2%.

Cette expérience a été effectuée selon la méthode décrite par Scher et al. (1984). Nous avons, tout d’abord rempli des tubes à essais (25 X 200 mm) jusqu’à une hauteur de 6 cm avec des échantillons de sols stérilisés. Ensuite, nous avons ajouté à chaque tube 5 ml d’eau distillée pour que le sol soit à la capacité au champ et avons recouvert le sol stérile avec 2 cm d’échantillon de sol non stérilisé. Deux graines de blé provenant du Mali, désinfectées en surface (trempées dans l’alcool 70% pendant 1minute, puis placées dans l’eau de javel pendant 15 minutes et enfin rincées à l’eau à 10 reprises), ont été semées dans chaque tube et recouvertes d’un autre 2 cm de sol non stérilisé provenant du Mali. Les tubes ont été scellés avec du papier parafilm et incubés dans une chambre de croissance (30oC, 4000 lux) pendant 4 semaines sans ajout d’eau. Pour isoler les microorganismes de la rhizosphère, tout le sol se trouvant sur les racines a été gentiment mélanger pour récolter le sol rhizosphérique. Les racines ont été ensuite lavées pendant 2 minutes avec de l’eau de robinet pour récolter toutes les particules de sol coller aux racines. Ensuite, les racines ont été ensuite lavées par une solution saline stérile à 0,85% (poids/volume), pour isoler les microorganismes du rhizoplan. Un échantillon de 1 ml de chaque solution obtenue a été dilué de 10-1 à 10-8. Le reste de la solution a été filtrée et le sol rhizosphérique recueillit a été séché à 70oC pendant une nuit et pesé par la suite

Afin de dénombrer les microorganismes des sols à l’étude et d’en isoler les MSP, nous avons incubé des milieux de cultures liquides NBRIP contenant 2 g des différents sols à 28oC pendant 7 jours. Le dénombrement des microorganismes totaux (du sol rhizosphérique, du rhizoplan et des échantillons de sol étudiés), a été effectué sur milieu TSA 0,1 X (Tryptic soy broth de Difco : 3g/l avec 2% de gélose). Pour dénombrer les microorganismes dissolvant le PNT, nous avons effectué des dilutions en séries en ajoutant 1ml de la suspension de sol rhizosphérique ou des sols à l’étude dans 9 ml de tampon phosphate (pH 7.0). Une aliquote de 0.1 ml de chaque dilution, a été étalé sur le National Botanical Research Institute’s Phosphate growth medium (NBRIP) (Nautiyal, 1999), contenant par litre d’eau distillée les éléments suivants : glucose, 10g; MgCl2.6H2O, 5g; MgSO4.7H2O, 0.25g; KCl, 0.2g et (NH4)2SO4, 0.1; agar, 15 g; pH ajusté à 7.0. Comme seule source de phosphore, nous avons ajouté au milieu de culture 5g/l de PNT. Avant d’ajouter le PNT, nous l’avons lavé avec la solution Mehlich 3 pour éliminer le phosphore disponible. Le PNT ainsi lavé a été stérilisé avant d’être ajouté au milieu de culture qui est également stérile. Trois répétitions ont été réalisées pour chaque dilution. L’énumération des colonies bactériennes (bactéries + actinomycètes) a été effectuée après 2 à 3 jours, sur milieu NBRIP auquel nous avons ajouté de la cycloheximide à 50 μg/ml, pour inhiber la croissance des champignons. Les champignons ont été énumérés après 4 à 7 jours, toujours sur milieu NBRIP contenant de la streptomycine à 150 μg /ml stérilisée par filtration et du rose 50 μg /ml.

Vu que, la capacité d’un isolat à solubiliser le phosphore après plusieurs repiquage est un critère fondamental dans la sélection des microorganismes à utiliser comme inoculant, et qu’en plus, des organismes ne produisant pas d’halo de solubilisation sur milieu solide peuvent solubiliser efficacement le phosphore en milieu liquide, nous avons effectué deux tests un en milieu solide et un en milieu liquide.

La capacité des bactéries isolées à dissoudre le PNT a été testée selon la méthode décrite par Nautiyal (1999). Les microorganismes isolés, ont été étalés sur milieux solides contenant le PNT comme seule source de phosphore. Avant d’ajouter le PNT, nous l’avons lavé avec une solution de Mehlich 3 (Mehlich, 1984) pour le débarrasser de tout son phosphore soluble. Après 14 jours d’incubation à 30oC, nous avons mesuré le diamètre total (diamètre du halo + diamètre de la colonie) pour chaque colonie, en plus le diamètre de chaque colonie a été mesuré. Le diamètre du halo de solubilisation, pour chacun des isolats, a été déterminé en soustrayant le diamètre de la colonie de celui diamètre total (Halo+colonie). Au début, nous avons testé 10 colonies bactériennes par boîte de pétri, tandis que les champignons, ont été testés à 4 par boîte de pétri et incubés à 30oC pendant 2 semaines. Ce premier test a été suivi d’un second effectué avec les isolats sélectionnés à partir du premier test, mais cette fois, chaque isolat a été testé sur une boite. Les isolats les plus performants ont été sélectionnés et testés pour leur capacité à conserver le pouvoir de solubilisation du phosphore, sur milieu solide, après 10 générations.

Ce test a été effectué en deux temps. Dans un premier temps, chaque isolat (provenant de cultures jeunes sur milieu NBRIP a été utilisé pour inoculer des Erlenmeyers de 250 ml contenant chacun 50 ml de milieu NBRIP avec le PNT comme seule source de phosphore. Les milieux inoculés ont été placés sur un incubateur agitateur à 30oC, pendant 2 semaines. Ensuite, les milieux de culture ont été centrifugés à 10 000 g pendant 10 minutes. Le phosphore dans le milieu de culture a été déterminé par la méthode de Tandon et al. (1968). Les isolats ayant solubilisé le plus de phosphore au cours de ce test et se retrouvant parmi les isolats sélectionnés au cours du test sur milieu solide ont été utilisés dans le second test en milieu liquide. Ce second test a été effectué selon la méthode de Whitelaw (2000). Dans ce test, le PNT a été stérilisé séparément avant d’être placé, à raison de 1g/l, dans des Erlenmeyers de 250 ml, contenant 50 ml de milieu NBRIP. 1 ml de suspension de la culture pure a été utilisé pour inoculer les milieux de cultures. Trois répétitions ont été faites pour chaque isolat. Les milieux autoclavés et non inoculés, ont servi de contrôles. Les milieux inoculés et les contrôles, ont été incubés sous agitation permanente à 30oC sur un incubateur agitateur à 180 rpm. Après deux semaines, le contenu de chaque Erlenmeyer a été centrifugé à 10 000 g pendant 10 minutes et le surnageant décanté. Le phosphore soluble du surnageant a été déterminé par la méthode colorimétrique de Tandon et al. (1968). La quantité de P solubilisé a été déterminée en soustrayant la quantité de P soluble du témoin de la quantité de P soluble contenu dans le surnageant des milieux inoculés avec les isolats. L’acidité titrable a été déterminée par titration volumétrique avec du NaOH 0,1N. Le pH des filtrats a été déterminé à l’aide d’un pH-mètre. Le poids sec du mycélium des champignons a été déterminé après séchage à 70oC pendant une nuit, tandis que, les protéines bactériennes totales ont été déterminées par la méthode de Lowry et al. (1951) après hydrolyse totale des cellules bactériennes avec du NaOH 1.0 N pendant 60 minutes à 100oC. Les acides organiques ont été déterminés par la méthode de Baziramakenga et al. (1995). Les résultats représentent la moyenne de trois répétitions.

La production de sidérophores par les isolats, a été testée en milieu pauvre en fer. Le milieu utilisé est le milieu Chrome Azurol S (CAS) (Schwyn et Neilands 1997), modifié par Milagres et al. (1999). Le milieu modifié se prépare en mélangeant 2,7 mg de FeCl3.6H2O dans 10 ml de HCl 10 mM avec 65,5 mg de CAS dissout auparavant dans 50 ml d’eau bi distillée. Ce mélange, de couleur violette foncée, est ajouté très lentement avec agitation constante, à 72,8 mg de HDTMA (Hexamethylammonium bromide) dissous dans 40 ml d’eau bi distillée. La solution bleu foncée obtenue a été autoclavée à 121oC pendant 15 minutes. Un autre mélange est préparé en dissolvant 30,24 g de Pipes et 15 g d’agar dans 750 ml d’eau. Le pH de cette solution est ajusté au pKa du Pipes en ajoutant 12 g d’hydroxyde de sodium 50% (w/w). Pour faire croître les isolats, des boîtes de pétri (10 cm de diamètre) ont été préparées en versant 30 ml du milieu approprié. Après solidification, le milieu de culture a été coupé au milieu, la moitié enlevée a été remplacée par 15 ml d’Agar bleu CAS. La moitié contenant le milieu de culture, a été inoculée avec une aliquote de milieu de culture contenant la souche appropriée. L’inoculum a été placé aussi loin possible de l’intersection entre les deux milieux. Les boîtes de pétri ont été incubées à la 28oC et à l’obscurité pendant 3 semaines. La réaction avec le bleu CAS a été déterminée en mesurant la distance sur laquelle on observe un changement de couleur, sur l’agar bleu CAS, à partir de l’intersection entre les deux milieux.

La capacité des isolats pré sélectionnés à produire l’acide cyanhydrique a été vérifiée selon la méthode de Bakker et Schippers (1987). Ainsi, chaque isolat a été inoculé, à l’aide d’une anse, sur une boîte de pétri contenant le milieu composé de : 3 g de bouillon tryptic soy broth (TSB, Difco), 20 g de gélose et 4,4 g de glycine par litre d’eau distillée. Ce milieu a été autoclavé à 121oC pendant 20 minutes et refroidit au bain-marie jusqu’à 50oC. Un papier filtre de 9 cm de diamètre, est déposé dans le couvercle de chaque pétri en position inverse. Ce papier est par la suite imprégné d’une solution de couleur orangée contenant 0,5% d’acide picrique et 20% de carbonate de calcium. Les boites de pétri sont scellées avec du papier parafilm et incubées à 28oC. Les boites sont vérifiées quotidiennement afin d’identifier les pétris dont le papier filtre a changé de couleur de l’orange au brun, indiquant la synthèse de HCN.

Le milieu solide de Luria-Bertani enrichi avec du tryptophane a été utilisé (LBT, Bric et al., (1991)), pour identifier les souches productrices de AIA ou des substances apparentées. Ce milieu contient 10 g de tryptone (Difco), 5g d’extrait de levure, 5 g de NaCl, 1,02 g de L-tryptophane et 20 g de gélose, le tout dissout dans 1 litre d’eau distillée et stérilisé à 121oC pendant 20 minutes et refroidit au bain-marie à 50oC. Le milieu ainsi préparé est coulé dans des boites de pétri de 9 cm. Une membrane de nitrocellulose est déposée directement sur le milieu LBT. Les pétris ont été inoculés en déposant les isolats sur une même membrane à l’aide d’une anse à inoculer. Les pétris inoculés, ont été incubés en position inversée à 28oC, le temps nécessaire pour que les colonies atteignent un diamètre de 2 mm. Un papier Watmann No.2 de 9 cm, imprégné de 2,5 ml de solution de Salkowski composé de 2% de FeCl3 (0,5 M) dans une solution de 35% d’acide perchlorique. La membrane de nitrocellulose dont les colonies montrent une bonne croissance, est déposée sur le papier filtre imprégné du réactif de Salkowski. Les bactéries qui synthétisent de l’AIA sont identifiées par la formation d’un halo rouge caractéristique qui cerne la colonie.

Ce test est effectué pour vérifier l’existence d’une éventuelle action inhibitrice d’un des isolats envers un ou plusieurs autres des isolats. Le milieu solide NBY (Nutrient broth yeast extract) utilisé pour ce test contient : 8g de bouillon nutritif (nutrient broyh, Difco), 2g d’extrait de levure (Difco), 10 g de glucose, 2g de K2HPO4, 0,5 de KH2PO4, 0,2 g de MgSO4.7H2O et 20 g d’agar. Le pH de ce milieu est ajusté à 7.0.

Les inoculum bactériens ont été produits selon la méthode décrite par Chabot et al. (1993). Les 6 bactéries sélectionnées, ont été cultivées dans des fioles Erlenmeyer de 250 ml contenant 50 ml de milieu NBRIP, sur agitateur rotatif (New Brunswick) à 100 rpm par minute à 28oC pendant 48 heures. Les cellules bactériennes ont été ensuite concentrées par centrifugation à 5000g pendant 15 minutes, lavées à trois reprises dans une solution de tampon phosphate, et suspendues dans 500 ml d’eau de robinet stérile afin d’obtenir une concentration bactérienne de 1012 unités formant des colonies (ufc) par millilitre qui a été diluée pour obtenir une concentration finale de 106 ufc/ml.

Les champignons C1 et C13 ont été cultivés sur milieux NBRIP + PNT pendant 3 jours (C1) et 5 jours (C13). Les spores (+hyphes) ont été recueillis en versant 5 ml de milieu de culture liquide NBRIP stérile dans les différentes boîtes de pétri contenant les champignons et en les mettant en solution a l’aide d’un râteau en verre. Le mélange de spores + hyphes contenu dans les différentes solutions a été broyé dans un mélangeur culinaire. La suspension ainsi obtenue a été lavée et le mélange (spores + hyphes) suspendu dans une solution saline stérile. 1 ml de chaque solution (Spores + hyphes dans la saline de chaque champignon) a été utilisé pour faire une dilution en série de 10-1 à 10-8. 100μl de chaque dilution ont été étalés sur milieu solide pour déterminer le nombre d’unités formant des colonies par dilution. Après inoculation des graines, nous avons pris 3 graines au hasard pour déterminer le nombre d’unités formant des colonies de champignons par graine.

L’expérience au champ a été menée au cours de l’année 2000-2001 à Koygour (Diré), qui correspond au sol S3 très pauvre en phosphore. Les caractéristiques du sol du site d’expérimentation sont présentées dans le tableau 2.1. Le dispositif expérimental utilisé au cours de cet essai est un Split plot avec trois parcelles principales et neuf sous parcelles en quatre répétitions. Les traitements incluent le phosphate biammoniacal (DAP) à 30 kg de P par ha, le phosphate naturel de Tilemsi à 30 kg de P par ha et un témoin (sans source de phosphore) en parcelles principales et les microorganismes solubilisant le phosphore (BR2, BR8, BR10, B3, B22, B27, C1 C13) et un témoin en sous parcelle. La quantité d’azote que contient le DAP a été déterminée et ajoutée aux parcelles fertilisées avec le PNT et aux parcelles témoins. Le PNT et le DAP ont été ajoutés avant de semer les graines de blé. Au champ, nous avons utilisé des parcelles de 31 m de longueur et 8 m de largeur. Chaque parcelle principale est divisée en neuf sous parcelles de 2,5 m de longueur et 2m de largeur, distant de 1m. Chaque sous parcelle contient 4 rangées, sous forme de buttes espacées de 50 cm. Sur chaque rangée, 2 graines de blé ont été semées tous les 20 cm. Les deux rangées du centre ont reçu les graines enrobées de microorganismes alors que les deux rangées extérieures ont été semées avec du blé non inoculé. Le blé a été semé le 4 décembre 2001. Avant semis, les graines de blé ont été désinfectées en surface et enrobées d’une solution de 1% de méthyle cellulose contenant les cellules lavées de l’inoculum. Les plants de blé ont été démariés 2 semaines après le semis pour garder 1 plante tous les 20 cm. La fertilisation azotée a été faite en trois étapes, 50 kg N/ha sous forme d’urée en début de tallage et de montaison et 40kg N/ha en début d’épiaison.

Le potassium a été ajouté sous forme de KCl à la dose de 80 kg/ha avant de semer. Le désherbage a été fait selon la méthode traditionnelle qui consiste à effectuer trois sarclages. Du début à la fin de l’expérience, nous avons effectué 10 irrigations à raison de 500m3/ha par irrigation. Après 30 jours de croissance, les tailles (Taille1) de trois plantes de blé, choisies aléatoirement sur les deux rangées du centre de chaque sous parcelle, ont été mesurées. Après 45 jours de croissance, les racines de 2 plantes choisies aléatoirement sur les rangées du centre de chaque sous parcelle ont été délicatement excavées des 30 premiers cm du sol et lavées. Des échantillons ont été aléatoirement prélevés des racines lavées pour la détermination du taux de colonisation des racines du blé par les champignons mycorhiziens. Les tailles et le nombre de feuilles des mêmes plantes ont été déterminés après 60 jours de croissance (taille 2) et toutes les plantes ont été fauchées, séchées et leurs poids déterminés.

Les parcelles expérimentales ont été mises au point au cours de l’année agricole 2001-2002 à Koygour (Diré). Le loam limono-argileux utilisé a un pH de 6,7 et contient 0.17% de matière organique. Les éléments assimilables (kg/ha) déterminés par la méthode de Mehlich 3 (Mehlich, 1984) sont les suivants : P, 6.25 ; K, 240 ; Ca, 803.53 ; Mg, 217.01 ; Fe, 42,68 ; et Al, 254.55. Le dispositif expérimental utilisé au cours de cet essai est un split split plot. Les parcelles principales sont fertilisées avec le PNT ou le phosphate biammoniacal (DAP) appliqué à 30 kg P/ha et un contrôle non fertilisé, arrangés en blocs complets aléatoires. Le supplément d’azote, apporté aux parcelles fertilisées avec le DAP, a été calculé et ajouté à tous les autres traitements. Les sous parcelles ont été inoculées ou non avec le champignon endomycorhizien Glomus intraradices . Les sous sous parcelles incluent les traitements avec les microorganismes solubilisant le PNT (MSP) : Pseudomonas sp. (BR2), Aspergillus amowari nakazawa (C1), Penicillium chrysogenum thom (C13), BR2+C1, BR2+C13, et un contrôle non inoculé. Au champ, nous avons utilisé des parcelles principales (Fertilisation avec PNT ou DAP) de 15 m de longueur et 5 m de largeur. Chaque parcelle est divisée en deux sous parcelles (Inoculation ou non avec Gi) de 15 m de longueur et 2m de largeur distant de 1m. Chaque sous parcelle a été divisé en six sous sous parcelles de 2 m de large et 2m de long séparées par 60 cm et contenant 4 rangées espacées de 50 cm. Sur chaque rang 2 graines de blé ont été semées tous les 20 cm. Les deux rangées du centre reçoivent les graines enrobées de microorganismes alors que les deux rangées extérieures ont été semées avec du blé non inoculé. Pour tous les traitements nous avons 4 répétitions. Avant semis, les graines de blé ont été désinfectées en surface et enrobées d’une solution de 1% de méthyle cellulose contenant les cellules lavées de l’inoculum, tel que décrit par Chabot et al. (1993). Le blé a été semé le 20 novembre 2001. Les plants de blé ont été démariés 2 semaines après le semis pour garder 1 pied tous les 20 cm. L’azote a été ajouté sous forme d’urée comme suit : deux applications de 50 kg N/ha au début du tallage et en début de montaison, et une dernière application de 40 kg N/ha en début d’épiaison. Les stades de croissance ont été déterminés à partir du graphique de Large (1954). Toutes les parcelles ont reçu 80 kg K/ha sous forme de KCl. Le désherbage a été fait selon la méthode traditionnelle qui consiste à effectuer trois sarclages. Du début à la fin de l’expérience, nous avons effectué 10 irrigations (à raison d’à peu près 500m3 d’eau/ha par irrigation).

Après 30 jours de croissance, les tailles (Taille1) de trois plantes de blé, choisies aléatoirement sur les deux rangées du centre de chaque sous parcelle, ont été mesurées. Les tailles et le nombre de feuilles des mêmes plantes ont été déterminés après 60 jours de croissance (taille 2). Après 45 jours de croissance, les racines de 2 plantes choisies aléatoirement sur les rangées du centre de chaque sous sous parcelle ont été délicatement excavées des 30 premiers cm du sol et lavées. Des échantillons ont été aléatoirement prélevés des racines lavées pour la détermination du taux de colonisation des racines du blé par les champignons mycorhiziens. A maturité (Après 88 jours de croissance), toutes les plantes ont été fauchées, séchées et leur poids déterminé.

La bactérie solubilisant le phosphore Pseudomonas sp. (BR2) a été isolée de la rhizosphère du blé du Mali. Des souches de Pseudomonas sp. qui résistent spontanément à la Rifampicine (BR2rif+) ont été isolées sur milieu TSA solide contenant 100 µg de rifampicine (provenant de Sigma Chemical Co., St. Louis, Missouri, USA)/ml en étalant 100µl de milieu de culture vieille de 24heures, contenant la bactérie Pseudomonas sp. . La solution de rifampicine a été préparée en dissolvant 0,20 g de rifampicine dans 10 ml d’alcool 70%. Avant d’ajouter la solution de rifampicine au milieu de culture, elle a été stérilisée par filtration. Des milieux solides contenant des concentrations de rifampicine variant entre 50 et 200 µg/ml ont été préparées et inoculés pour l’isolement. Nous avons utilisé cette technique car selon Kluepfel (1993) elle est simple, rapide, sensitive, non

coûteuse et a été utilisée avec succès avec plusieurs échantillons venant d’environnements variés. Les bactéries, BR2rif+, montrant des croissances et une activité de solubilisation comparables aux souches mères, sur milieu solide et en milieu liquide NBRIP avec le PNT comme source de P, contenant 100 µg de rifampicine et maintenant cette résistance à la rifampicine après plusieurs sous cultures ont été utilisées dans cette expérience. L’inoculation des graines de blé a été faite comme décrite à la section 2.2.3.1.2

Des graines, traitées avec des concentrations de BR2rif+ allant de 1,2 x 103 à 2,4 x 108 cfu/graine, ont été semées dans un sol non stérile ou dans un sol autoclavé ( 1heure à 121oC pendant 2 jours consécutifs) dans essai en tubes sable-sol (Scher et al., 1984). Le sable, les graines et les tubes ont été stérilisés dans l’essai en sol stérile. Les tubes ont été incubés à 30oC pendant 30 jours et les densités de BR2rif+ ont été déterminées sur milieux solides contenant de la rifampicine à 100µg/ml.

L’expérience a été faite selon la méthode standard en tubes (Scher et al., 1984) avec deux blocs constitués des traitements de fertilisation : fertilisé (+ PNT) et non fertilisé (Sol uniquement = contrôle) et quatre traitements d’inoculations : Pseudomonas sp . rif + (BR2rif+), Glomus intraradices (Gi), BR2rif+ + Gi et un contrôle non inoculé. Nous avons effectué six répétitions pour chaque traitement. Les blocs combinés aux traitements ont donné 12 unités expérimentales dans lesquelles les traitements ont été aléatoirement répartis.

La colonisation des racines par les mycorhizes indigènes et introduites a été estimée par observation microscopique de segments de racines de 1cm de long, colorés selon la méthode de (Vierheilig et al., 1998). Les racines ont été coupées en segments de 1 cm de long, qu’on a fait bouillir dans du KOH à 10% pendant 3 minutes et rincés à plusieurs reprises avec l’eau du robinet. Les segments ainsi éclaircis ont été bouillis pendant 3 minutes dans une solution ancre-vinaigre à 5%, préparé avec du vinaigre pur (contenant 5% d’acide acétique). Les racines ont été décolorées par rinçage pendant 20 mn dans l’eau du robinet acidifié par ajout de quelques gouttes de vinaigre. 10 segments, sélectionnés aléatoirement par traitement, ont été placés les uns parallèlement aux autres, sur une lame de microscope et le pourcentage de segments colonisés par les mycorhizes déterminé au microscope à ×100 (Bierman et Linderman, 1981). Une section de segment est considérée comme infectée lorsque des hyphes, des vésicules ou des arbuscules sont observés.

L’homogénéité des variances a été testée pour toutes les variables en utilisant le test de Bartlett (Steel and Torrie, 1980). Les traitements avec des moyennes non homogènes ont subit une transformation avant analyse. Ainsi, les populations de microorganismes (Nombre d’unité de microorganismes formant des colonies) des sols et de la rhizosphère ont subit une transformation logarithmique log(ufc), parce que nous avons observé que l’écart type augmente proportionnellement à la moyenne. Les valeurs exprimant le pourcentage de la longueur des racines colonisée ont subit une transformation racine carrée, parce que ces données suivent la distribution de Poisson. Les valeurs nulles ont été utilisées dans les analyses (Kloepper et Beauchamp, 1992), parce qu’ aucune bactérie Pseudomonas sp. résistante (BR2rif+) à la rifampicine n’a été détectée chez les plantes non inoculées. Les populations de BR2rif+ log(ufc+1) ont été présentée pour donner une tendance, puisque les variations entres les traitements étaient très larges pour valider le test de Bartlett. Les effets des traitements (microorganismes et sources de phosphore) ont été comparés par analyse de la variance. Le logiciel SAS (Statistical Analysis System Institute, inc., 1985) avec le programme GLM (General Linear Model) a été utilisé pour augmenter la précision des procédures de l’ANOVA. Chaque fois que le F calculé était significatif, le test de la plus petite différence significative (LSD) protégé de Fisher, a été utilisé pour comparer les moyennes pour cette expérience.