Chapitre 3 : Résultats et discussions

Table des matières

Les MSP du sol et de la rhizosphère du blé ont été isolés à partir de quatre types de sols et de cultivars de blé provenant du Mali. Les caractéristiques physico-chimiques des sols utilisés sont présentées dans le Tableau 1. Le test de Bartlett a été utilisé pour vérifier l’homogénéité de la variance des résultats obtenus. Ce test s’étant révélé significatif, nous avons procédé à la transformation logarithmique des données avant d’effectuer l’analyse de la variance sur les données transformées.

Les microorganismes (bactéries + champignons) solubilisant le PNT, ont été trouvés dans tous les sols utilisés de cet essai Tableau 2.

Note : La microflore totale est la somme des ufc comptées sur les milieux TSA 0,1× (bactéries) et RBM (Champignons). Les MSP ont été dénombrés sur milieux NBRIP avec PNT comme seule source de phosphore. Les résultats correspondent aux moyennes de trois répétitions * ufc.g-1, unités formant des colonies par gramme de sol sec.

** Microorganismes solubilisant le phosphate naturel de Tilemsi.

L’analyse de la variance effectuée sur les valeurs transformées des différentes variables a donné les résultas présentées dans le tableau 3.

MSP : microorganismes solubilisant le phosphore BSP : Bactéries solubilisant le phosphore CSP : Champignons solubilisant le phosphore * ** *** Significatifs aux seuils de 0,05, 0,01 et 0,00 respectivement

Ces résultats indiquent qu’il y a une différence globale dans le contenu en microorganismes totaux (MT) et solubilisant le P (MSP) des différents sols (Tableau 3). Le test du LSD protégé de Fisher nous a permis de diviser les sols en deux groupes homogènes quant à leur contenu en microorganismes solubilisant le phosphore (Tableau 4). Les sols du même groupe ne diffèrent pas entre eux, mais leur contenu en MSP diffère de celui des sols des autres groupes. En accord avec les résultats ci-haut mentionnés, nous pouvons déduire que les sols S, S1 et S2 semblent avoir les mêmes populations microbiennes (en quantité), mais contiennent moins de microorganismes solubilisant le phosphore que le sol S3. Nous pouvons déduire de ces observations que le contenu en microorganismes solubilisant le P d’un sol ne dépend pas toujours de son contenu en microorganismes totaux.

α Unités formant des colonies par gramme de sol sec. β Microorganismes solubilisant le phosphore * ** Significatisf aux seuils de probabilité de 0.05 et 0.01 respectivement

Le Tableau 5, donne la composition quantitative des populations bactériennes totales et solubilisant le phosphore des différents sols à l’étude.

Ufc : Unité formant des colonies. BSP : Bactéries solubilisant le phosphore

L’analyse de la variance a montré des différences significatives quand au contenu des sols en bactéries totales et solubilisant le P (Tableau 2). Le test du LSD protégé de Fisher nous a permis d’affiner cette conclusion. En accord avec les résultats de ce test, nous avons divisé les sols en trois groupes homogènes quant au contenu en bactéries solubilisant le P (Tableau 6). Ainsi, malgré que les sols n’ont pas la quantité totale de bactéries, ils diffèrent significativement du sol S3 quant à leur contenu en bactéries solubilisant le P (BSP). Le sol S3 une fois de plus a le plus fort nombre de BSP et ce, malgré qu’il ait le plus bas nombre de bactéries totales. Dans le sol S3 on retrouve le plus de matière organique (Tableau 1) pouvant supporter la croissance des BSP, ce qui peut expliquer le fait que c’est dans ce sol qu’on retrouve le plus de BSP.

α Bactéries solubilisant le phosphate naturel de Tilemsi.

** Significatifs aux seuils de probabilité de 0.00, selon le test de fisher.

Les populations de champignons totaux et solubilisant le phosphore sont consignées dans le tableau 7.

CSP : Champignons solubilisant le phosphate naturel de Tilemsi

L’analyse de la variance a montré des différences significatives quand au contenu des sols en champignons totaux et solubilisant le P (Tableau 2). Le test du LSD protégé de Fisher a permis de confirmer que les quatre sols sont totalement différents quant à leurs contenus en champignons totaux et solubilisant le phosphore (Tableau 8). Cependant, contrairement aux observations précédentes, le sol S3 contient la plus basse population de champignons totaux et solubilisant le phosphore.

αa Champignons solubilisant le phosphate naturel de Tilemsi.

*** Significatif au seuil de probabilité de 0.00

Figure 1 : Relations entre le phosphore assimilable, le pH et les champignons totaux des sols.

Les résultats de l’isolement des microorganismes, consignés dans le tableau 9, indiquent des variation dans les populations de microorganismes solubilisant le phosphore, allant de 2,38 x 106 ufc pour Hindi tosson à 3,50 x 106 ufc/gramme de sol rhizosphérique pour Alkama béri (tableau 9).

MSP : Microorgnismes solubilisant le phosphore

L’analyse de la variance des données transformées a montré que les trois cultivars de blé contiennent selon toute vraisemblance des quantités différentes de microorganismes solubilisant le phosphore, mais qu’ils ne diffèrent pas significativement quant à leur contenu en microorganismes totaux. Cependant, en tenant compte de la zone d’isolement (rhizosphère, rhizoplan et sol non rhizosphérique), Les différents cultivars apparaîssent différents quant aux populations de microorganismes totaux et solubilisant le phosphore (Tableau 10).

Zone : lieu d’isolement (rhizosphère, rhizoplan ou sol non rhizosphérique)

Le test du LSD protégé de fisher a été utilisé pour affiner les conclusions de cette analyse. Ce test a permis de repartir les cultivars en deux groupes en se référant au contenu en microorganismes rhizosphériques solubilisant le phosphore (Tableau 11). La plus forte population de microorganismes rhizosphériques solubilisant le P a été trouvé dans la rhizosphère de tétra, tandis que, les populations de MSP des deux autres cultivars ne diffèrent pas significativement (Tableau 11).

Note : La microflore totale est la somme des ufc comptées sur les milieux TSA 0,1× (bactéries) et RBM (Champignons). Les MSP ont été dénombrés sur milieux NBRIP avec PNT comme seule source de P. Les résultats correspondent aux moyennes de trois répétitions.

ns : Non significatif au seuil de 0,05

*** Significatif au seuil de probabilité de 0.00, selon le test de Fisher.

La comparaison des données dans le tableau 12 prévoit un avenir interéssant pour Tétra et Alkama béri avec un pourcentage d’incidence pour les MSP supérieur à celui dans le sol non rhizosphérique. Tétra et Alkama béri semblent exercer un effet stimulateur sur les MSP au niveau du rhizoplane et de la rhizosphère. Hindi tosson, quand à lui semble avoir un effet moins prononcé sur les MSP au niveau de la rhizosphère. L’incidence des BSP et celui des CSP dans la rhizosphère des cultivars de blé étudiés, présenté dans le tableau 2.6, montre une grande différence entre les cultivars testés. Au niveau de la rhizosphère, Alkama béri a le plus fort pourcentage de BSP (12,01% des bactéries totales), tandis que, Tétra a le plus fort pourcentage de CSP (40% par rapport au champignons totaux). Cependant, malgré la différence observée entre eux, les trois cultivars de blé de cette étude ont montré un effet stimulateur des MSP au niveau du rhizoplane, comparativement au sol non rhizosphérique et à la rhizosphère.

α Pourcentages calculés à partir des données non transformées.

Malgré le fait que les pourcentages d’incidence des MSP dans la rhizosphère de tétra et de Alkama béri soient différents, la population de MSP dans la rhizosphère d’alkama béri 3,49 x 106 ufc.g-1 de sol rhizosphérique est presque égale en valeur absolue à celle de tétra 3,40 x1 06 ufc.g-1 de sol rhizosphérique (Tableau 13). La population de MSP dans la rhizosphère de toutes les variétés de blé testées étaient supérieures à celle du sol non rhizosphérique.

* Millions par gramme de sol rhizosphérique sec. .

A partir des milieux d’isolement, 44 bactéries et 18 champignons ont été retenus en premier pour leur grande activité de solubilisation du PNT. Après plusieurs repiquages sur milieu solide (tableau 14) et liquide contenant le PNT comme seule source de phosphore, nous avons retenus les microorganismes les plus performants. Ainsi, le nombre de microorganismes solubilisant efficacement le PNT a été réduit à 6 bactéries et 2 champignons.

Selon les données du Tableau 14, les champignons semblent être plus efficaces que les bactéries dans la solubilisation du PNT. Le champignon, C1 avec un halo de solubilisation de 17 mm, semble solubiliser plus efficacement le PNT comparé aux autres isolats testés. La bactérie B27 avec un halo de 5 mm, a été la plus efficace des bactéries sur milieu solide, tandis qu’aucun halo n’a été observé autour des bactéries BR2 et B3 qui, auparavant, avaient été isolées sur cette base.

* Les valeurs sont les moyennes de trois répétitions.

** Diamètre des colonies incluant le halo de solubilisation.

La conservation du pouvoir de solubilisation du phosphore, par un isolat, est un critère essentiel dont il faut tenir compte en choisissant un organisme à utiliser comme inoculant. Ainsi, Nous avons inoculé les isolats retenus sur milieux solides NBRIP contenant de l’alizarine rouge comme indicateur de la production d’acide. Nous avons effectué 20 répétitions pour chaque isolat et à chaque génération, nous avons vérifié la croissance et la production d’acide sur 10 générations pour chaque isolat. La bactéries BR2 (en milieu liquide) et les champignons C1 et C13 (sur milieu solide) ont été très stables dans la production d’acide sur les 10 générations comme nous pouvons le constaté dans le Tableau 15. La bactérie BR2, vue qu’elle ne produit pas de halo sur milieu solide avec le PNT, a été en plus testée en milieu liquide et elle s’est montrée très stable, en ce qui a trait à son pouvoir de solubilisation du P après 10 inoculations successives.

* Chaque valeur représente la moyenne de 20 répétitions.

** Halo incluant la colonie

L’analyse de la variance (Tableau 16), montre qu’il y a une différence d’efficacité entre les isolats quant à leur capacité à solubiliser le P, à baisser du pH du milieu de culture et à produire des acides organiques.

ns : Non significatif au seuil de probabilité de 0.05

*** Significatif au seuil de probabilité de 0.00

La quantité de P solubilisé par les isolats, les changements dans le pH, l’acidité titrable du milieu de culture, la concentration en protéines bactériennes et le poids sec du mycélium des champignons, sont présentés dans le Tableau 17. Ces données indiquent que malgré qu’aucun halo de solubilisation n’ait été observé autours des colonies de BR2 et de B3 sur milieu solide, ces deux bactéries ont pu solubiliser le PNT en milieu liquide. BR2 a même solubilisé plus de phosphore que toutes les autres bactéries.

α Quantité de P solubilisé après 14 jours d’incubations. Les valeurs originales ont subies une transformation logarithmique et chaque valeur représente la moyenne de trois répétitions β pH du milieu de culture après 14 jours de croissance.

*** Significatif au seuil de 0.00. .

Dans la même colonne les moyennes suivies de la même lettre ne sont pas significativement différentes au seuil de probabilité de 0.05, selon le test de Fisher.

La quantité maximale de P solubilisé et le temps nécessaire pour solubiliser le maximum de P, varient en fonction des isolats. Les quantités de P solubilisé par les bactéries varient entre 19 à 90 mg P/ml. Mis à part la bactérie BR2, toutes les autres bactéries atteignent leur efficacité maximale après 7 jours d’incubation (figure 2). La bactérie BR2 qui apparaît la plus efficace solubilise 90 mg P/ml en 15 jours. Le champignon C1 a solubilisé la plus grande quantité de P (296 mg P/ml ± 2,6) en seulement 5 jours, il est suivi de C13 (174 mg P/ml ± 1) en 7 jours (figure 3).

Figure 3 : Quantité de phosphore solubilisé par les champignons en fonction de la durée d’incubation

Figure 2 : Quantité de phosphore solubilisé par les bactéries en fonction de la durée d’incubation

Figure 3 : Quantité de phosphore solubilisé par les champignons en fonction de la durée d’incubation

La solubilisation du PNT est généralement accompagnée d’une croissance importante de l’isolat présent (tableau 17) dans le milieu et d’une production d’un ou d’un mélange de plusieurs acides organiques dont les qualités et les quantités varient selon l’isolat présent. Cependant, l’acide gluconique, l’acide oxalique et l’acide citrique sont produits par la majorité des isolats. L’acide citrique et l’acide gluconique, les plus performant dans la solubilisation du PNT, sont produits en plus grande quantité par les isolats C1, C13 et BR2. Une corrélation positive significative (r = 0,9 ***) a été observée entre la production d’acide citrique et la quantité de P solubilisé dans les milieux de culture (Figure 4).

Figure 4 : Relation entre la production d’acide citrique et la solubilisation du P du phosphate naturel de Tilemsi.

La Figure 5, montre les relations entre la quantité d’acide citrique produite, la baisse du pH et la solubilisation du P du PNT. Il apparaît que plus il y a production d’acide citrique, plus le pH du milieu baisse et plus il y a de P en solution dans le milieu. En plus, la bactérie BR2 et les champignons C1 et C13 qui ont produit les plus fortes quantités d’acide citrique ont aussi solubilisé le plus de P. Dans cette expérience, nous avons observé la production d’acide gluconique, mais en quantité moins importante que l’acide citrique.

Figure 5 : Évolution de la quantité de P en fonction de la production d’acide citrique et de la baisse du pH.

La croissance, en milieu liquide, des isolats retenus est toujours accompagnée d’une baisse de pH du milieu et d’une hausse de l’acidité titrable. Le pH du milieu dans lequel croît le champignon C1 a baissé jusqu’à 2,55 qui est le pH le plus bas observé dans cet essai. Des études de corrélation, effectuées entre le pH, l’acidité titrable et la quantité de P solubilisé par les isolats ont montré, d’une part, une relation négative significative (r = -0,76 ***) entre le P solubilisé et le pH du milieu et, d’autre part, une relation positive significative (r = 0,97 ***) entre le P solubilisé et l’acidité titrable (Figure 6 et Figure 7).

Figure 6 : Corrélation entre le pH du milieu de culture et la solubilisation du phosphore

Figure 7 : Corrélation entre l’acidité titrable et la solubilisation du phosphore.

En milieu liquide, la corrélation entre le pH et la quantité de P solubilisé avait déjà été rapportée par Kucey et al. (1983). Pour les champignons, tel que Aspergillus, le pH 4 a été longtemps reconnu comme pH optimum pour solubiliser les phosphates inorganiques Dans cette étude, le pH a baissé jusqu’à des limites variant entre 2,6 et 5,4 selon les isolats alors que le pH initial de tous les milieux de culture était de 6,8. La croissance de plusieurs bactéries et champignons s’accompagnent d’une baisse du pH du milieu de culture. Dans cette étude, nous avons constaté une relation évidente entre la baisse du pH et la solubilisation du P, entre la production d’acides et l’acidité titrable et entre l’augmentation de l’acidité titrable et la solubilisation du P. Ces relations significatives font ressortir le rôle important des acides dans la solubilisation des phosphates naturels.

Afin de déterminer l’effet de la concentration de PNT dans le milieu, du pH et de la température d’incubation sur la capacité des isolats à solubiliser le PNT, nous avons fait croître les isolats sur milieux solides NBRIP de pH 5,6 et 7, préparés à partir de milieux liquides contenant 2, 4 et 8g de PNT/l. Les différents milieux inoculés par les isolats, ont été incubés à 30, 37 et 45oC pendant 15 jours. Les données issues de cette expérience sont présentées dans le Tableau 18.

L’analyse de ces données montre que la croissance et la capacité des isolats à solubiliser le PNT dépendent en grande partie du pH initial du milieu de culture et de l’isolat en présence. À pH initial 7, les bactéries solubilisent efficacement le PNT, plus le pH initial est bas, moins sont efficaces les bactéries testées. Les champignons quant à eux, bien que très peu sensibles aux variations de pH solubilisent plus efficacement le PNT quand on les fait croître dans un milieu de pH initial 6. L’interaction entre la concentration de PNT et le pH constitue également un élément important dans l’activité des isolats testés. Ainsi, une concentration de PNT de 4g/l donne un très bon résultat avec les isolats à pH 7, les champignons étant plus efficaces que les bactéries. Plus on augmente la concentration de PNT dans le milieu, plus il y a de P solubilisé par les isolats (Tableau 14). Cependant, à une concentration de PNT supérieure à 2 g/l, plus le pH est bas, moins il y a de P solubilisé par les bactéries.

Comme le pH et la concentration de PNT, la température d’incubation apparaît comme un facteur agissant sur la capacité des isolats à solubiliser efficacement le PNT. Les bactéries B22 et B27 se sont montrés efficaces à 30 et 37oC, tandis que, les autres bactéries le sont seulement à 30oC. A 45oC, nous n’avons observé aucun halo de solubilisation chez les bactéries qui ont néanmoins pu croître dans la majorité des cas.

Les champignons, isolés du sol provenant du site d’extraction du PNT avec un pH acide (pH 5,89) et une température pouvant dépasser 45oC en été et une très forte concentration en PNT, se sont montrés plus efficaces que les bactéries à toutes les températures d’incubation. Ces champignons semblent généralement biens adaptés à l’environnement d’où ils ont été isolés, chaud, acide avec une forte concentration de PNT. Les bactéries ont montré des capacités différentes dans la solubilisation du PNT sous conditions stressantes. Cependant, les champignons, quant à eux, semblent posséder un potentiel génétique leur permettant de solubiliser le PNT quelle que soit la concentration de phosphate naturel et dans des conditions de température et de pH stressantes.

de solubiliser efficacement le phosphate naturel de Tilemsi.

*Chaque valeur (diamètre des halos de solubilisation en mm), représente la moyenne de trois répétitions

Parmi les microorganismes évalués, seules les bactéries BR2 et BR10 croient sur milieu solide CAS en produisant des halos de couleur orange très foncée. Ce qui veut dire que, ces bactéries produisent des sidérophores en grande quantité (Tableau 19). La bactérie B3, aussi, produit des sidérophores mais en quantité plus faible que BR2 et BR10. Plusieurs chercheurs ont rapporté la production de sidérophores par certaines bactéries rhizosphériques appelées rhizobactéries favorisant la croissance des plantes (RFCP) (Beauchamp, 1992). Les sidérophores sont des substances qui favorisent la croissance des plantes en inhibant les organismes phytopathogènes ou délétères. En plus de la production de sidérophores, les bactéries BR2, B22, BR10 et B3 produisent de l’acide indole acétique (A.I.A). Au cours de ces tests, aucune bactérie n’a pu produire de l’acide cyanhydrique. De même aucun cas d’antagonisme n’a été observé entre les isolats testés.

Tableau 19 : Production de sidérophores, d’acide cyanhydrique (HCN) ou d’acides indole acétique (A.I.A.) par les isolats retenus après 12 jours de croissance sur milieu solide.

++ Production modéré de la substance considérée + Faible production de la substance considérée - Aucune production de la substance

*** significatif au seuil de probabilité de 0,00 ns : Non significatif au seuil de 0.05 α Nombre de jours passés avant la vérification de la germination

En effet, seule la bactérie BR2 a été la seule, des neufs isolats testés a avoir stimulé la germination des graines pendant les 5 premiers jours (Tableau 21).

Les meilleurs taux de germination ont été obtenus avec les plantes inoculées avec les bactéries BR2 BR10 et B3. Après seulement 5 jours de croissance, l’isolat B27 semble ralentir l’émergence du blé, tandis qu’avec C1 et C13 on observe la même situation après 10 et 15 jours (il faut noter que cette expérience est indépendante de la grande expérience, mais a lieu en même temps et sur le même site dans les mêmes conditions de fertilisation).

Tableau 21 : Influence de l’inoculation avec les MSP sur la germination des graines (exprimé en nombre de graines germées sur 10 graines) α.

**, *** Significatifs au seuil de probabilité de 0,01 et 0.00 ns : Non significatif au seuil de 0.05

Dans une même colonne, les moyennes suivies de las même lettre ne sont pas significativement différentes.

α Moyenne de 10 répétitions

La fertilisation phosphatée et l’inoculation avec les microorganismes solubilisant le phosphore (MSP) ont significativement affecté la colonisation des racines de la variété de blé Tétra par les mycorhizes indigènes (Tableau 22). Toutes les interactions entre les sources de phosphores et les MSP étaient significatives (p<0.0001). Ce qui indique par exemple, que les sources de phosphore affectent différemment la colonisation des racines par les mycorhizes indigènes, ce en fonction du microorganisme.

Variables mesurées  : colonisation des racines, taille, nombre de feuille et production de matière sèche végétale (paille et racines) de la variété de blé Tétra inoculée avec les microorganismes solubilisant le phosphore (MSP) et fertilisé avec le PNT et le DAP.

*, **, *** Signifificatifs au seuil de probabilité de 0.05, 0.01 et 0.00. ns : Non significatif au seuil de 0.05 taille du blé après 30 jours de croissance.

c Taille du blé après 60 jours de croissance

. Dans les parcelles non fertilisées et non inoculées, seulement 2,6% de la longueur totale des racines ont été colonisés par les mycorhizes indigènes, 45 jours après semis (Tableau 23). La fertilisation avec le PNT a amélioré de 5% la colonisation des racines du blé comparé au témoin non fertilisé, tandis que, l’application de DAP a occasionné une baisse du taux de colonisation des racines du blé de 1,2% suggérant ainsi que la pauvreté du sol en phosphore serait, au moins en partie, cause de la faiblesse de la colonisation des racines par les mycorhizes indigènes.

*** Significatif au seuil se probabilité de 0,00. ns : non significatif au seuil de 0,05. Dans la même ligne, les moyennes suivies de la même lettre ne sont pas statistiquement différentes au seuil de 0.05.

Une autre cause de la faiblesse de la colonisation des racines pourrait être le nombre de spores viables de mycorhize dans les sols. En effet, les perturbations des sols dues à des pratiques telles que le labour, les rotations des cultures et la forte érosion auxquels sont soumis les sols tropicaux, entraînent une forte diminution du nombre de progagules et de spores viables de mycorhizes indigènes des sols et réduit, par conséquent, le taux d’infection des racines du blé par les MVA (Diop et al., 1994 ; Gavito et Miller, 1998). Une réduction de l’incidence des mycorhizes dans les sols en jachère a été aussi reportée (Vivekanandan et Fixen, 1991 ; Arihara et Karazawa, 2000).

Dans le sol non fertilisé, l’inoculation avec les microorganismes solubilisant le P (MSP) a significativement amélioré le taux de colonisation (Tableau 24). L’inoculation avec les MSP a augmenté de 3,9% le taux de colonisation des racines en présence de PNT comparativement aux plantes non fertilisées, suggérant ainsi, une solubilisation du PNT par les MSP avec pour conséquences la hausse de la concentration du P du sol à des niveaux l’amélioration de la croissance et du taux d’infection des racines (Tableau 24). En présence de DAP, l’inoculation avec les MSP n’a pas eu d’effet significatif sur la colonisation des racines, ce qui est en accord avec l’observation générale selon laquelle le taux de colonisation des racines par les champignons MVA est plus élevé aux faibles doses de phosphore disponibles (Khaliq et Sanders, 2000 ; Zhu et al., 2001).

Dans une même colonne, les chiffres suivis de la même lettre ne sont pas significativement différents au seuil de probabilité de 0.05, selon le test de fisher.

L’amélioration de la colonisation des racines observée avec le PNT est l’œuvre des bactéries solubilisant le P (BSP). En effet, les bactéries BR2, BR10 et B3 sont les seules, parmi les isolats testés, à avoir significativement stimulé la colonisation des racines du blé (Tableau 24). Les bactéries BR2, BR10 et B3 produisent des sidérophores, en plus la bactérie BR2 produit de l’acide indole acétique, ce qui peut aussi expliquer l’effet positif de ces bactéries sur la colonisation des racines du blé. Les champignons C1 et C13 qui solubilisent plus efficacement le PNT mettent en disponibilité plus de P dans le sol et peuvent par la même occasion, défavorisent la colonisation des racines par les champignons mycorhiziens (Tableau 24). Le plus fort pourcentage de colonisation des racines par les mycorhizes indigènes a été obtenu avec la bactérie BR2 (33,5%) en présence de PNT.

Après 30 jours de croissance, les apports de PNT et de DAP ont significativement augmenté la taille du blé comparativement aux témoins non fertilisés (Tableau 25). Cependant, le blé fertilisé avec le DAP est de 4 cm plus haut que celui fertilisé avec le PNT, attestant de la pauvreté du sol (S3) en phosphore et la possibilité d’une faible disponibilité du phosphore du PNT. Toujours après 30 jours de croissance, l’inoculation avec les MSP en présence de PNT n’a pas amélioré la taille du blé, suggérant ainsi qu’en présence d’une faible source de phosphore, l’inoculation avec les MSP favorise le développement des racines au dépens des parties aériennes. Après 60 jours de croissance, en absence de MSP, l’application de DAP a significativement améliorée la croissance en hauteur du blé (Tableau 25). L’inoculation avec les MSP, a stimulé l’élongation du blé en présence de PNT. En effet les MSP ont occasionné, en présence de PNT, des élongations de la taille du blé de 6 à 25 cm. La bactérie BR2, après application de PNT, a augmenté la taille du blé de 25 cm comparé au témoin fertilisé et non inoculé.

* Taille après 30 jours de croissance

** taille après 60 jours de croissance

*** Nombre de feuilles par plante **,*** Significatifs aux seuils de probabilité de 0.01 et 0.00 respectivement ns : non significatif au seuil de 0.05. Les moyennes portant les mêmes lettres dans la même colonne ne sont pas significativement différentes au seuil de 0.05, selon le test de Fisher.

La stimulation de la croissance du blé, observées après 60 jours, indique que l’effet négatif de l’inoculation avec les MSP sur la taille du blé après les 30 premières jours de croissance, ne s’est pas traduit par une baisse de rendement. L’application du PNT ou du DAP n’a occasionné aucune amélioration significative du nombre de feuilles par plante (Tableau 23). Après fertilisation avec le PNT, l’inoculation avec les MSP n’a provoqué aucune augmentation significative du nombre de feuilles par plante comparativement aux témoins fertilisés et non inoculés (Tableau 25).

L’application de PNT et de DAP ainsi que l’inoculation avec les MSP ont eu un effet significatif sur la production en matière sèche (paille et racines) du blé. L’interaction entre les sources de phosphore et les MSP est significative pour les racines et non significative pour la production de paille (Tableau 22). La quantité de matière sèche (paille et racines) produite ainsi que les valeurs des rapports racines/paille pour les différents traitements sont présentés dans le Tableau 26. Les plus petites différences significatives (LSD 0.05) entre les résultats dus aux effets de l’inoculation avec les différents microorganismes pour chaque source de phosphore appliquée y sont également indiquées.

α Poids sec de la paille de blé

β Poids sec des racines de blé

γ  Rapport entre le poids sec des racines et le poids sec de la paille de blé. *,*** Significatifs aux seuils de probabilité de 0.05 et 0.00 respectivement ns : non significatif au seuil de 0.05. Les moyennes portant les mêmes lettres dans la même colonne ne sont pas significativement différentes au seuil de 0.05, selon le test de Fisher.

Une augmentation significative de la production de matière sèche (paille et racines) a été obtenue avec le blé fertilisé par le PNT ou le DAP (Tableau 23). La plus forte production de paille (2,80 t.ha-1) a été observée avec le DAP, tandis que, nous avons obtenu la plus forte production de racines (0,39 t.ha-1) avec le PNT. Ces résultats confirment la pauvreté du sol d’essai en phosphore. Les plantes inoculées avec les MSP, sans source de phosphore, ont vu leur production de paille et de racines augmentée par rapport au témoin non fertilisé et non inoculé (Tableau 26). En général, l’inoculation avec les MSP, après fertilisation a significativement augmenté la production de la paille du blé comparé aux témoins fertilisés et non inoculés. Ainsi, nous avons obtenu une hausse de la production de paille de 681 kg.ha-1 après inoculation avec les MSP en présence du PNT et de 740 kg.ha-1 en présence du DAP (Tableau 26).

De même, l’inoculation du blé avec les MSP a permis d’augmenter le contenu total en phosphore de la paille de blé. L’amélioration de l’absorption du P et de la production de matière sèche du blé inoculé par rapport aux contrôles fertilisés au PNT et non inoculés suggère une mise en disponibilité, aux plantes, du phosphore du PNT (Gain et Gaur, 1990; Singh et Amberger, 1998). Cependant, cet effet semble ne pas être directement lié à la solubilisation du PNT car la majorité des bactéries qui ont donné les meilleurs résultats au cours du test de solubilisation n’ont pas pu améliorer significativement la croissance des plantes. Les valeurs des rapports racines/paille des plantes inoculées avec les bactéries en présence de PNT sont plus élevées que ceux des plantes non inoculées (contrôles) à cause du développement plus important des racines de ces plantes. Les bactéries BR2, BR8, BR10 et B3 produisent des sidérophores, la présence de ces substances peut expliquer partiellement la stimulation de la croissance des racines du blé observée, ce qui est en accord avec les résultats de Chabot et al. (1993).

Les concentrations des minéraux ont plus augmenté chez les plantes fertilisées avec DAP comparativement à celles fertilisées avec le PNT (Figure 8). Chez les plantes fertilisées avec le PNT, mis à part le Zn, le Mn et le K qui ont sensiblement augmenté, les concentrations des autres minéraux dans le blé ont baissé.

Figure 8 : Effets de l’application du PNT et du DAP, sur l’assimilation totale des minéraux par le blé.

Tous les microorganismes ont provoqués une hausse de la concentration en éléments minéraux du blé. Cependant, c’est dans les plantes inoculées avec les bactéries BR2 et BR8 et les champignons C1 et C13 qu’ont a trouvé les plus fortes concentrations de minéraux (Figure 9). L’inoculation avec les isolats BR2, BR8, BR10, B22, C1 et C13, a augmenté la concentration en phosphore des plantes de 5 à 44% par rapport au témoin non inoculé. En plus du phosphore, l’inoculation a provoqué une hausse de la concentration dans les tissus foliaires du K (1 à 19 %), Ca (10 à 48 %), Mg (9 à 36 %), Zn (3 à 16 %), Fe (14 à 28 %), Al (27 à 64 %) et Mn (34 %). Ces résultats sont en accord avec ceux de Chabot et al. (1993) qui, dans un essai au champ avec le maïs, ont observé que l’inoculation avec des souches bactériennes semblent augmenter la concentration de la partie foliaire du maïs en K, Ca, Mg, Fe, Mn et Zn. Néanmoins, dans cet essai, seules les bactéries BR2, BR8 et B3 ont provoqué une hausse de la concentration en Zn du blé. De même, seule la bactérie B3 a occasionné une hausse du Mn dans le blé comparé aux plantes témoins non inoculées (Figure 9). Au contraire, les plus basses concentrations de Fe et d’Al ont été trouvées chez les plantes inoculées avec les bactéries B3, B22 et B27.

Les résultats de cet essai indiquent que les organismes évalués peuvent améliorer la germination, la croissance et la production du blé au champ, en mettant en solution le phosphore du phosphate naturel de Tilemsi (PNT). Cependant, vue que la stimulation de la germination et de la colonisation des racines du blé n’a été observée qu’en présence des bactéries et que les champignons solubilisent plus le phosphore que les bactéries, nous pensons que les stimulations observées ne sont pas uniquement dues à la solubilisation du phosphore, mais aussi à la production de substances de croissance, qui en favorisant la colonisation des racines par les mycorhizes indigènes, améliorent la nutrition des plantes. Plusieurs travaux restent à faire avant de formuler un inoculant biologique pour le blé. Ainsi, dans l’essai suivant nous donnerons les résultats, au champ, des effets de l’inoculation avec les trois organismes ayant donné les meilleurs résultats (BR2, C1 et C13) seuls ou en combinaison champignon bactérie avec ou sans mycorhize commerciale, sur la croissance, la production de graines et de paille, l’absorption du phosphore et la colonisation des racines du cultivar de blé Tétra.

La fertilisation phosphatée et l’inoculation avec les microorganismes solubilisant le phosphore (MSP) et Glomus intraradices (Gi) ont significativement affecté la colonisation des racines de la variété de blé Tétra par les mycorhizes indigènes (Tableau 27). Toutes les interactions entre les sources de phosphores, les MSP et l’inoculation avec G. intraradices étaient significatives (p<0.001). Ce qui indique par exemple, que les sources de phosphore affectent différemment la colonisation des racines par les mycorhizes indigènes, ce en fonction du microorganisme utilisé ou de l’inoculation ou non de G. intraradices .

Tableau 27 : Résumé des analyses de variance sur les variables mesurées sur le blé (cv. Tétra).

Variables mesurées : colonisation des racines par les mycorhizes, taille des plantes, production de graines et de paille et concentrations en phosphore du cultivar de blé Tétra inoculé avec les microorganismes solubilisant le phosphore (MSP) en présence ou non de G. intraradices (Gi) et fertilisé avec le phosphate naturel de Tilemsi (PNT) ou le phosphate biammoniacal (DAP).

*, **, *** Significatif à P<0.05, P<0.01 et P<0.001, respectivement.

a ns: statistiquement non significatif.

Dans les parcelles non fertilisées et non inoculées, seulement 5,5% de la longueur des racines ont été colonisés par les mycorhizes indigènes, 45 jours après semis (Tableau 28). L’inoculation avec G. intraradices en absence de traitement de fertilisation ou d’inoculation avec les MSP n’améliore pas significativement les 5,5% de colonisation racinaire précédemment observée (Tableau 28).

Blé inoculé avec Pseudomonas sp. (BR2), Aspergillus awamori (C1) et Penicillium seul ou en combinaison bactérie champignon avec ou sans Glomus intraradices (Gi) et fertilisé avec le phosphate naturel de Tilemsi (PNT) ou le phosphate biammoniacal (DAP)

Pour chaque traitement de champignon mycorhizien (inoculé avec Gi ou non) dans chaque colonne les moyennes suivies de la même lettre ne sont pas statistiquement différentes selon le test du lsd protégé de Fisher (P < 0.05).

L’addition de PNT augmente le taux de colonisation des racines qui passe de 5,5 à 8% dans le traitement contrôle non inoculé, mais une augmentation plus substantielle de 5,5 à 25,5% a été observée chez les plantes inoculées avec Gi (Tableau 28). Pour tous les traitements de fertilisation et de MSP, l’inoculation avec Gi augmente significativement la colonisation des racines du blé (Tableau 29). En général, en présence de phosphate biammoniacal (DAP), le pourcentage de racines colonisées aussi bien par les champignons mycorhiziens indigènes que ceux introduits était toujours inférieur à celui observé dans les parcelles fertilisées avec le PNT ou non fertilisées (Tableau 28 etTableau 31). Quelque soit la source de phosphore appliquée, l’inoculation avec la bactérie solubilisant le phosphore Pseudomonas sp. BR2 augmente significativement la colonisation des racines par les champignons mycorhiziens indigènes ou introduites. Le plus fort pourcentage de colonisation (62%) a été obtenu avec le blé fertilisé avec le PNT et inoculé avec Gi et BR2 (Tableau 28).

Tableau 29  : Effets de l’inoculation avec Glomus intraradices (Gi) sur la taille, la colonisation des racines par les mycorhizes, la production de graines et de paille et les concentrations en P du blé.

α Les valeurs représentent la moyenne pour tous les traitements de fertilisation

Dans chaque colonne les moyennes suivies de la même lettre ne sont pas statistiquement différentes selon le test du lsd protégé de Fisher (P < 0.05).

Après 60 jours de croissance, la fertilisation phosphatée et l’inoculation avec les MSP et G. intraradices influence significativement la taille des plantes de blé. A l’exception de l’interaction source de phosphore x Gi, toutes les autres interactions entre les sources de P et l’inoculation avec les MSP et Gi étaient hautement significatives (Tableau 27). Pour tous les traitements combinés, l’inoculation avec Gi et la fertilisation avec le PNT ou le DAP ont significativement augmenté la taille des plantes (Tableau 29 et Tableau 31). Dans les parcelles non fertilisées, les plantes de blé les plus hautes ont été obtenues lorsque le blé est inoculé avec Gi et la bactérie Pseudomonas sp. (BR2) ou Penicillium crysogenum C13 (Tableau 28). Ces différences, bien que transitoires affectent significativement la récolte finale en graines. Dans cette étude, la taille des plantes est significativement corrélée avec la production en paille (r = 0,70**, p<0,01) et en graines (r = 0,70**) du cultivars de blé Tétra (Figure 10).

Figure 10 : Relation entre la taille du blé et la production en graines

La production de graines et de paille et leurs concentrations en phosphore sont significativement affectées par la fertilisation phosphatée, l’inoculation avec les PSM et Gi (Tableau 27). L’interaction avec les trois traitements est significative pour la production de graines et de paille. Pour la concentration en P des graines, L’interaction Gi x MSP n’est pas significative. De même, toutes les interactions impliquant Gi ne sont pas significatives pour la concentration en P de la paille de blé (Tableau 27). Pour tous les traitements composés, l’inoculation avec Gi augmente significativement la production en graines et paille du blé et leurs concentrations en phosphore (Tableau 30).

Tableau 30 : Effets de l’inoculation avec les MSP sur la production en graines et paille et les concentrations en P de la variété de blé Tétra.

Le blé a été inoculé avec Pseudomonas sp. (BR2), Aspergillus awamori (C1) et Penicillium seul ou en combinaison bactérie champignon avec ou sans Glomus intraradices (Gi) et fertilisé avec le phosphate naturel de Tilemsi (PNT) ou le phosphate biammoniacal (DAP).

Pour chaque traitement de champignon mycorhizien (inoculé avec Gi ou non) dans chaque colonne les moyennes suivies de la même lettre ne sont pas statistiquement différentes selon le test du lsd protégé de Fisher (P < 0,05),

La fertilisation avec le DAP augmente ces quatre paramètres mesurés comparativement aux contrôles non fertilisés (Tableau 31). Exception faite de la production de graines, le DAP est toujours supérieur au PNT. La production de paille et la concentration en P des plantes de blé des parcelles contrôles ne sont pas significativement différentes de celles obtenues après fertilisation avec le PNT (Tableau 31).

α Les valeurs représentent la moyenne de tous les traitements d’inoculations.

Dans chaque ligne les moyennes suivies de la même lettre ne sont pas statistiquement différentes selon le test du lsd protégé de Fisher (P < 0.05).

En absence de tout traitement de fertilisation, l’inoculation du blé avec le champignon mycorhizien Gi a produit la plus basse production de graines de blé et concentration en P (Tableau 30). En moyenne, l’inoculation avec Gi a causé une augmentation de la production de graines (0,49 t/ha) et de paille (0,54 t/ha) pour tous les traitements de fertilisation et d’inoculation avec les PSM (Tableau 29). Après inoculation avec les microorganismes solubilisant le PNT, la production de graines obtenue avec le PNT était comparable à celle du DAP. En considérant tous les traitements de Gi et de MSP, l’addition de 30 kg de P/ha sous forme de fertilisation avec le PNT ou le DAP augmente de 0,42 t/ha la production de graines par rapport au contrôle non fertilisé (Tableau 30). La production de graines de blé est toujours améliorée par l’inoculation avec les MSP dans les parcelles contrôles et celles fertilisées par le PNT. A l’absence de Gi, l’inoculation avec les MSP et la fertilisation avec le DAP, n’a occasionné aucune amélioration de la production de graines (Tableau 30). En général la production de graines et de paille du blé inoculé avec Aspergillus amowari C1 ou Penicillium chrysogenum C13 étaient toujours plus fortes lorsque les plantes étaient inoculées avec Gi comparativement aux contrôles non inoculés (tableau 24).

En absence de fertilisation phosphatée, la plus forte production de graines a été obtenue avec le traitement composé BR2 + C1 avec ou sans Gi (Tableau 30). L’application du phosphate biammoniacal (DAP) n’a augmenté que d’à peu près 5% la quantité des différents minéraux absorbés par le blé comparativement aux plantes témoins non fertilisées (Figure 11). Contrairement au DAP, le phosphate naturel de Tilemsi (PNT) a, mis à part le K, entraîné une hausse du contenu du blé en Mg, Ca, Zn, Mn et Fe repectivement de 13, 17, 20, 26 et 20% par rapport aux témoins non fertilisés. En plus, le contenu du blé fertilisé avec le PNT a augmenté de 216 % comparé aux témoins non fertilisés.

Figure 11 : Effet de la fertilisation sur l’assimilation totale du Mg, Ca, Zn, Mn, K, P, Fe et Al par le blé.

Mis à part le contenu en K du blé qui n’a pas varié par rapport à celui des témoins non inoculés, l’inoculation avec G. intraradices a provoqué une augmentation d’à peu près 5 % du contenu en minéraux du blé comparativement aux témoins non inoculés (

Figure 12). L’Al est l’élément le plus absorbé en présence de G. intraradices (15 % de plus que chez les témoins non inoculés).

Figure 12 : Effet de l’inoculation du blé cultivé au champs, avec G. intraradices sur l’assimilation totale du Mg, Ca, Zn, Mn, K, P, Fe et Al.

En tenant compte de tous les traitements de fertilisation et d’inoculation mycorhizienne, l’inoculation avec les microorganismes solubilisant le P (MSP) augmenté de 8 à 54 % le contenu du blé en éléments minéraux du blé comparé aux témoins non fertilisés et non inoculés. Cependant, il est à noter que l’absorption des minéraux par le blé varie en fonction de l’interaction source de phosphore x mycorhise x MSP. Ainsi, en présence de PNT, l’inoculation avec les MSP et G. intraradices a occasionné une hausse du contenu en minéraux du blé avec une plus forte absorption de l’Al et du P. La

Figure 12, montre que l’accumulation de l’aluminium dans les feuilles de blé tend à augmenter le contenu total en P du blé. Le blé (cv. Tétra) a montré une forte capacité d’accumulation de l’aluminium en présence de la bactérie BR2 et de Gi, ce qui fait de lui un candidat potentiel pour détoxifier les sols contaminés par cet élément.

Figure 13 : Relation entre l’accumulation d’Al dans la paille du blé et l’absorption du phosphore par le blé fertilisé avec le phosphate naturel de Tilemsi (PNT) et inoculé avec G. intraradices et les MSP.

Cette étude montre qu’il est possible sous conditions de culture au champ au Mali d’obtenir des productions de graines de blé comparables à celles obtenues avec le DAP, en utilisant le phosphate naturel de Tilemsi (PNT) produit localement combiné aux MSP et aux champignons mycorhiziens.

La rhizobactérie Pseudomonas sp. améliore significativement la colonisation des racines par les champignons mycorhiziens, la croissance et la production du blé. Cependant, son efficacité dépend de son pouvoir à coloniser efficacement les racines. Aussi, nous présentons dans la section suivante, les résultats de l’essai d’inoculation du blé avec une souche de Pseudonymes sp . résistante à la rifampicine (BR2rif+) visant à vérifier la compétitivité de BR2rif+.

La bactérie Pseudomonas sp . BR2 résistante à la Rifampicine ( BR 2 rif+ ) issue de la culture de la bactérie Pseudomonas sp., isolée de la rhizosphère du blé du Mali, a été utilisée pour vérifier la capacité de la bactérie Pseudomonas sp à coloniser les racines du blé dans un essai en tube, effectué selon la méthode de Scher et al. (1984). Le taux d’inoculation de BR2rif+ varie entre 1,2 x 103 et 2,4 x 108 ufc/graine (Tableau 33). Le test de Bartlett a indiqué une hétérogénéité de la variance des données. Aussi, avant d’effectuer l’analyse de la variance, nous avons procédé à la transformation logarithmique ((log(ufc+1)) des données. L’analyse de la variance effectuée pour le taux de colonisation (Tableau 32) a montré que le taux d’inoculation des graines par la bactérie Pseudomonas sp (BR2rif+) affecte significativement la colonisation de la rhizosphère du blé par la bactérie introduite. L’interaction, entre le taux d’inoculation des graines et le type de sol, était très significative. Ce qui indique, qu’en fonction du type de sol, le taux d’inoculation des graines, affecte différemment la colonisation des racines du blé par la bactérie (Tableau 33).

* *** significatifs aux seuils de 0.05 et 0.00

Le test du LSD protégé de fisher a permis de constater que la bactérie est très efficace dans les deux sols si elle est inoculée au taux de 1,3 X 105 ufc/graine (Tableau 33). Aucune bactérie BR2rif+ n’a été détectée chez les plantes non inoculées dans les deux types de sol. De même, dans le sol non autoclavé, la bactérie Pseudonymes sp. Rif+ n’a pas été détectée lorsque les graines étaient inoculées au taux de 1,3 x 103. Cependant, BR2rif+ a été détectée dans le sol autoclavé à tous les taux d’inoculation, suggérant ainsi une faible compétitivité de cette bactérie si elle est inoculée à un taux inférieur ou égal à 1,3 x 103. Malgré tout, aucune différence significativement n’a été observée quand au comportement des deux types de sol (autoclavé ou non) sur la capacité de BR2rif+ à s’installer dans la rhizosphère du blé (Tableau 34).

Tableau 33 : Effet du taux d’inoculation de la bactérie Pseudomonas sp rif+ sur la colonisation des racines par la bactérie après 30 jours de croissance.

* Les valeurs représentent la moyenne de cinq répétitions.

α Bactérie non détectée *** Significatif au seuil de 0.00

ns : Non significatif au seuil de 0,05 Dans la même colonne, les moyennes suivies de la même lettre ne sont pas significativement différentes au seuil de probabilité de 0,05

Après 30 jours de croissance, les densités de BR2rif+ dans la rhizosphère du blé variaient de 2,7 x 104 à 1,8 x 106 cfu/gramme de sol rhizosphérique. En considérant qu’on a une bonne colonisation à chaque fois les valeurs obtenues sont ≥ 6 x 103 cfu/gramme de sol, BR2rif+ inoculé à des taux allant de 104 à 108 cfu/graine, s’est avéré bon colonisateur de la rhizosphère du blé (Tableau 35)

*Les valeurs représentent la moyenne de six répétitions. nd : Non détecté

Cependant nous avons constaté qu’à partir de 1,3 x 105, plus le taux d’inoculation augmente, plus la densité bactérienne par gramme de sol rhizosphérique baisse.

L’analyse de la variance effectuée sur les valeurs transformées des différentes variables mesurées sur le blé, a montré que les sources de phosphore affectent significativement toutes les variables mesurées, mis à part le contenu en phosphore de la paille de blé (Tableau 36). De même, les traitements affectent significativement les différentes variables mesurées sur le blé. Aussi, toutes les interactions sources de phosphore et traitements étaient significatives, indiquant que les effets des traitements variaient en fonction de la source de phosphore (Tableau 36).

* ** *** significatifs aux seuils de 0,05; 0,01 et 0,00

L’application de PNT a entraîné une augmentation significative de population bactérienne totale et solubilisant le phosphore comparativement au témoin non fertilisé (Figure 14). De même, les champignons totaux et solubilisant le phosphore ont significativement augmenté après application du phosphate naturel de Tilemsi (Figure 15).

Figure 14 : Effet du phosphate naturel de Tilemsi sur microorganismes rhizosphériques totaux

Figure 15 : Effet du phosphate naturel de Tilemsi sur microorganismes rhizosphériques solubilisant le phosphore.

En absence de fertilisation phosphatée, l’inoculation avec Pseudomonas sp. (BR2) seul ou combiné à Gi, n’a occasionné aucune augmentation significative de la population bactérienne totale, mais a provoqué une hausse significative des microorganismes solubilisant le phosphore, comparativement au témoin non inoculé (Figure 16). La population bactérienne totale a significativement baissé en présence de Gi. Après application du phosphate naturel de Tilemsi, l’inoculation avec BR2rif+, seul ou combiné à Gi, a entrainé une hausse significative de la population bactérienne totale et solubilisant le phosphore. Le traitement combinant BR2rif+ et Gi a donné la plus forte augmentation de la population bactérienne solubilisant le phosphore (Figure 16).

Figure 16 : Effet de l’inoculation avec Pseudomonas sp. (BR2 rif+) et Glomus intraradices (Gi) sur le nombre de bactéries totales et solubilisant le phosphore.

Dans le sol non fertilisé, l’inoculation avec BR2rif+ n’a occasionné aucune augmentation significative des champignons totaux, mais a provoqué une hausse de la population des champignons solubilisant le phosphore (Figure 17). Inoculé seul, Glomus intraradices (Gi), n’a pas eu d’effet significatif sur les champignons totaux, mais, a provoqué une augmentation significative des champignons solubilisant le phosphore (Figure 17). Cependant, malgré la baisse significative des champignons rhizosphériques totaux qu’elle occasionne, l’inoculation avec BR2 en présence de Gi a significativement augmentée le nombre de champignons solubilisant le phosphore. Aucun effet significatif des traitements d’inoculation sur la population totale des champignons, n’a été observé après application de PNT (Figure 17). Cependant, la plus forte augmentation des champignons solubilisant le phosphore a été observée après application du PNT et inoculation avec BR2rif+ + Gi, confirmant l’effet positif de la symbiose mycorhizienne sur les microorganismes solubilisant le phosphore.

Figure 17  : Effet de L’inoculation avec Pseudomonas sp. (BR2rif+) et Glomus intraradices (Gi) sur les champignons rhizosphériques totaux et solubilisant le phosphore présentes dans la rhizosphère du blé après 6 semaines de croissance. Les valeurs (cfu/g de sol sec) représentent la moyenne de six répétitions.

En absence de fertilisation, les mycorhizes indigènes colonisent seulement 6,75% de la longueur des racines du blé. Après 30 jours de croissance, ce très faible taux de colonisation a été significativement amélioré par l’application du PNT (Tableau 37).

BR2rif+ : Bactérie Pseudomonas sp. résistante à la rifampicine. Racine (%colonisation) : Valeurs du pourcentage de colonisation des racines par les mycorhizes ayant subies une transformation racine carrée. Ppaille : P total de la paille de blé. MS : Matière sèche végétale.

Généralement l’inoculation avec Pseudomonas sp. a permis d’augmenter le pourcentage de racines colonisées (Tableau 38). Après application de PNT, l’inoculation avec Pseudomonas sp. rif+ a significativement augmenté le pourcentage de colonisation des racines du blé par les champignons mycorhiziens, comparativement au sol fertilisé et non inoculé. Le potentiel de mycorhisation naturel du sol d’expérience est très faible, cependant, l’inoculation avec Pseudomonas sp. dans le sol contrôle non fertilisé ou le sol fertilisé avec le PNT a provoqué une amélioration significative de la colonisation des racines. Dans les sols inoculés avec Glomus intraradices, l’inoculation avec Pseudomonas sp., n’a pas amélioré la colonisation des racines, comparativement à l’inoculation avec BR2 seul (Tableau 38). Cependant, l’inoculation avec la bactérie Pseudomonas sp (BR2) + Glomus intraradices en présence de PNT a donné le plus fort taux de colonisation des racines de blé par les mycorhizes qui est de 67,25%, soit une augmentation de 52% par rapport au témoin fertilisé et non inoculé.

a Chaque valeur représentent la moyenne de six répétitions Dans la même colonne, les différences significatives observées entre les traitements selon le test du LSD à p≤0,05 sont indiquées par des lettres différentes.

La comparaison des données présentées dans le Tableau 39, montre les relations entre l’établissement de Pseudomonas sp. dans la rhizosphère et la réponse du blé. L’analyse de ces données montre que l’inoculation avec Pseudomonas sp. sans application de PNT provoque une augmentation de 0,700g/tube et de 0,11mg de P/tube, respectivement de la biomasse et du contenu total en P du blé comparé au témoin non inoculé. Des augmentations plus importantes de la biomasse et du contenu total en P du blé ont été observées après inoculation avec Pseudomonas sp. et application de PNT. Sundara et al. (2002), étudiant l’influence des bactéries solubilisant le phosphore (BSP) sur le contenu en phosphore soluble du sol, ont montré que l’influence des BSP est plus importante lorsque la fertilisation phosphatée est, en partie, constituée de roche phosphatée. L’inoculation avec G. intraradices et Pseudomonas sp. en présence de PNT a été le traitement ayant le plus amélioré la biomasse et le contenu total en phosphore de la paille de blé.

contenu en phosphore total de la variété de blé Tétra, après 6 semaines de croissancea.

a Les valeurs de la réponse pour chaque variable représentent la moyenne de six répétitions.

Dans la même colonne, les différences significatives observées entre les traitements selon le test du LSD à p≤0,05 sont indiquées par des lettres différentes.

MS : Matière sèche. Ufc : Unité formant des colonies

L’amélioration de l’absorption du phosphore par le blé semble être due à l’amélioration de la colonisation des racines par les champignons mycorhiziens. En effet l’analyse de la Figure 18, montre que les augmentations du taux de colonisation des racines par les champignons mycorhiziens comptent pour une part importante dans l’amélioration du contenu total en phosphore de la paille de blé déterminé après 30 jours de croissance.

Figure 18 : Relation entre le pourcentage de la longueur des racines colonisées par les champignons mycorhiziens et l’absorption du phosphore par la variété de blé Tétra

En absence de fertilisation phosphatée, la colonisation des racines du blé par G. intraradices, n’a occasionné aucune amélioration significative de la population de Pseudomonas sp. rhizosphériques, comparativement aux témoins inoculés avec la bactérie en absence du champignon mycorhizien. Cependant, Villegas et al. (1996), ont montré que G. intraradices peut fortement augmenter, localement, le pH du milieu créant ainsi une importante différence entre le compartiment contenant uniquement le mycélium extra radial de G. intraradices (pH supérieur à 9).

La bactérie Pseudomonas sp. a stimulé l’absorption du phosphore et la production de la biomasse du blé, aussi bien, dans les parcelles fertilisées, que, dans les parcelles non fertilisées, suggérant ainsi que cette rhizobactérie agit probablement en mettant le phosphore du sol ou du PNT à la disposition des plantes ou en produisant des acides aminés, des vitamines ou des hormones qui favorisent la croissance des plantes en luttant contre certaines maladies fongiques ou en facilitant l’absorption du P. Les rapports de plusieurs chercheurs ont montré que les interactions observées entre bactéries et champignons, associés à la rhizosphère des plantes, améliorent fortement la mise en disponibilité du phosphore en contribuant grandement à son recyclage biogéochimique. Ainsi, Toro et al. (1997), étudiant l’effet interactif des bactéries solubilisant le phosphore et les mycorhizes à vésicules et arbuscules sur l’utilisation des sources de P faiblement bio disponibles (endogènes ou ajoutées sous forme de roche phosphatée), ont montré que plus de 75% du phosphore obtenu après bi inoculation des plantes dérivent de la roche phosphatée appliquée.

Les microorganismes solubilisant le phosphore ont été trouvés dans tous les sols de cette étude, mais leur nombre varie d’un sol à l’autre. Les populations bactériennes de tous les sols étaient supérieures à celle du sol S3, malgré tout c’est dans ce sol qu’on retrouve le plus de bactéries solubilisant le phosphore, indiquant que la quantité de bactéries solubilisant le phosphore (BSP), ne dépend pas toujours de l’importance de la microflore totale. L’importance des bactéries solubilisant le P dans le sol S3 par rapport aux autres sols peut s’expliquer par le fait que, c’est dans ce sol qu’on retrouve le plus de matière organique pouvant supporter la croissance de ces bactéries. En plus, le pH très bas des autres sols, peut défavoriser la croissance des bactéries solubilisant le phosphore. Néanmoins, l’incidence des bactéries solubilisant le phosphore dans la microflore totale de tous les sols, était toujours supérieure à celle des champignons solubilisant le phosphore. Cependant, malgré la faiblesse du pourcentage de champignons solubilisant le phosphore (CSP) par rapport à la microflore totale, la quantité de phosphore assimilable des sols, varie plus en fonction du nombre de CSP, ce qui peut s’expliquer, en partie, par la plus grande biomasse produite par les champignons comparés aux bactérie. Les précédents rapports de plusieurs chercheurs ont montré que les champignons sont plus efficaces dans la solubilisation des phosphates naturels que les bactéries (Kucey, 1983). Les populations de MSP dans la rhizosphère (Zone d’interactions intenses entre les racines et les microorganismes) de tous les cultivars de blé testés étaient supérieures à celle du sol non rhizosphérique (sol qui se trouve en dehors de la zone d’interactions intenses entre les racines et les microorganismes), indiquant que les 3 cultivars de blé utilisés dans cet essai semblent stimuler les populations de microorganismes rhizosphériques solubilisant le phosphore (MSP). Ces résultats sont accord avec ceux de plusieurs chercheurs qui ont montré que les racines des plantes stimulent préférentiellement les microorganismes solubilisant le phosphore et que l’intensité de la stimulation est fonction de la plante cultivée et des conditions du milieu (Asea et al., 1988; Cunningham et Kuick, 1992).

Aucun halo de solubilisation n’a été détecté autour des colonies de BR2 et de B3 au cours du test de solubilisation effectué sur milieu solide malgré que, ces bactéries aient été isolées sur cette base. Ce qui peut s’expliquer par la faible diffusion dans le milieu solide, des acides produits par ces bactéries au cours de leurs croissances. Cependant, malgré l’absence de l’halo de solubilisation autour des colonies de BR2 et B3, ces deux bactéries ont pu solubiliser le phosphore en milieu liquide. BR2 a même solubilisé plus de phosphore que toutes les autres bactéries, suggérant qu’il serait préférable, avant de sélectionner les microorganismes à utiliser comme inoculant de mesurer en plus du halo de solubilisation sur milieu solide, la quantité de P solubilisé en milieu liquide. Ces résultats appuient ceux de Nautiyal (1999) et de Johri et al. (1999), qui indiquent que le critère d’isolement des MSP sur la base de la formation du halo de solubilisation sur milieu solide, n’est pas un critère infaillible. Au cours de cette expérience, tous les isolats testés produisent un ou des mélanges d’acides organiques à faible poids moléculaire. Cependant, les isolats qui produisent plus d’acide citrique ont plus solubilisé le phosphore du phosphate naturel de Tilemsi que les autres, suggérant que cet acide est le plus efficace dans la solubilisation du PNT. Ces résultats sont en accord avec ceux de Reyes et al. (1999a et 2001), indiquant que la solubilisation de différentes sources de phosphore par Penicillium rugulosum et sa souche mutante Mps ++ , est principalement due à la production d’acides organiques à faible poids moléculaire. Ils ont aussi indiqué que l’acide citrique semblait être le principal acide en cause. De même, Fenice et al. (2000) ont observé la production, en grande quantité, d’acide gluconique et la solubilisation des phosphates inorganiques par Penicillium variable P16 encapsulé.

L’inoculation des graines de blé par les microorganismes solubilisant le P, a significativement affectée la germination du blé. En effet, la plupart des bactéries ont stimulé la germination des graines. En plus, nous avons observé que, toutes les bactéries qui ont stimulé la germination du blé, dans cet essai, produisent en grande quantité des sidérophores ou de l’acide indole acétique. Dommergues et al. (1999), ont rapporté que certains microorganismes de la rhizosphère produisent des vitamines comme la thiamine, l’acide nicotinique, l’acide pantothénique et autres, qui stimulent la germination et la croissance des plantes. Il serait donc possible que la stimulation de la germination observée avec ces bactéries, soit due à la production de ces substances ou à l’augmentation de la concentration de P du sol par ces organismes. Cependant, Rodriguez et al. (1998), ont montré que la déficience en phosphore augmente, non seulement, le temps de germination, mais aussi, le temps séparant l’émergence des premières feuilles et le tallage. Ce qui peut expliquer le temps de latence observé avec la majorité de nos isolats.

Dans les parcelles non fertilisées et non inoculées, la colonisation des racines du blé par les champignons mycorhiziens, après 45 jours de croissance, était très faible. Dans les écosystèmes semi-arides, la perturbation des sols (pâturage, érosion) entraîne une perte des propagules de mycorhize et une importante diminution des spores de mycorhize viables (Diop et al., 1994, McGee, 1989). L’inoculation avec Glomus intraradices (Gi), en absence de tout traitement, n’a pas amélioré le taux de colonisation des racines du blé par les mycorhizes. Dans une expérience en pot, Singh et Kapoor (1999) ont obtenu une augmentation significative de la colonisation des racines de blé avec le champignon mycorhizien Glomus sp. 88, appliqué sous forme de mélange fragments de racines mycorhizées de sorgho ( Pennisetum thyphoides ) et de sol. Cette procédure d’inoculation apporte probablement quelques substances nutritives non présentes dans la suspension pure de spores utilisée dans cet essai. La fertilisation avec le phosphate naturel de Tilemsi a augmenté le taux de colonisation des racines par les mycorhizes dans le traitement contrôle non inoculé, mais une augmentation plus substantielle a été observée chez les plantes inoculées avec Gi. Pour tous les traitements de fertilisation et d’inoculation avec les microorganismes solubilisant le phosphore, l’inoculation avec Glomus intraradices, a significativement augmenté la colonisation des racines du blé. En général, en présence de phosphate biammoniacal (DAP), le pourcentage de racines colonisées aussi bien par les champignons mycorhiziens indigènes que ceux introduits était toujours inférieur à celui observé dans les parcelles fertilisées avec le PNT ou non fertilisées. Nos résultats sont en accord avec les observations faites par Graham et Abbott (2000) indiquant que l’application d’une source de phosphore avec une grande quantité de phosphore soluble réduit le pourcentage des racines colonisées de plantes de blé de 42 jours. En plus, Ruotsalainen et al. (2002), étudiant la saisonnalité de la colonisation des racines des herbes qui croient en milieu pauvre, ont rapporté l’existence d’une corrélation positive significative entre la colonisation des racines et la concentration en P du sol. De même, des réductions considérables du pourcentage de colonisation des racines en fonction de la fertilisation phosphatée dans tous les systèmes culturaux avaient été rapportés (Zhu et Smith, 2001 ; Zhu et al., 2001). Nos résultats sont, aussi, en accord avec les trouvailles de Barea et al. (1980) indiquant que les roches phosphatées ne réduisent pas le niveau d’infection par les champignons mycorhiziens. Quelque soit la source de phosphore appliquée, l’inoculation avec la bactérie solubilisant le phosphore Pseudomonas sp. BR2 augmente significativement la colonisation des racines par les champignons mycorhiziens indigènes ou introduites. Le plus fort pourcentage de colonisation a été obtenu avec le blé fertilisé avec le PNT et inoculé avec Glomus intraradices et la bactérie Pseudomonas sp. (BR2). Ces résultats suggèrent que BR2 est une rhizobactérie qui favorise l’installation des mycorhizes. Des interactions synergiques entre bactéries et champignons mycorhiziens comme celle là sont bien documentées dans la littérature (Barea et al. 2002).

La fertilisation phosphatée et l’inoculation avec les microorganismes solubilisant le phosphore (MSP) et G. intraradices, ont significativement influencé la taille du blé. Pour tous les traitements combinés, la taille des plantes de blé a significativement augmenté après inoculation avec Gi et fertilisation avec le PNT ou le DAP. Dans les parcelles non fertilisées, les plantes de blé les plus hautes ont été obtenues lorsque le blé est inoculé avec Gi et la bactérie Pseudomonas sp. (BR2) ou Penicillium chrysogenum (C13). Germida et Walley (1996) ont observé que le poids sec des feuilles du blé de printemps cultivé au champ et inoculé avec les bactéries favorisant la croissance des plantes (BFCP), augmente ou diminue significativement en fonction des dates de récolte, de la location et du genre de bactérie utilisée. Ces différences, bien que transitoires affectent significativement la récolte finale en graines.

En absence de tout traitement de fertilisation, l’inoculation du blé avec le champignon mycorhizien Glomus intraradices a produit la plus basse production de graines de blé et concentration en P. Dans les sols faibles en phosphore, l’inoculation avec des champignons mycorhiziens réduit la croissance du blé (Graham et Abbott, 2000). Dans notre étude, cet effet non bénéfique est corrigé par l’application du phosphate naturel de Tilsit (PNT) ou du phosphate ammoniacal (DAP) ou par l’inoculation avec les microorganismes solubilisant le phosphore (MSP) testés. L’interaction positive observée entre le champignon mycorhizien G. intraradices et les MSP pour la production de paille est comparable à celui observé avec le blé cultivé au champ en Egypte, fertilisé avec le phosphate naturel et inoculé avec Glomus constrictum et deux champignons solubilisant le phosphore Aspergillus niger et Penicillium citinum (Omar, 1998). Les poils absorbants des racines peuvent augmenter de façon substantielle le contact racine sol, et jouer un rôle déterminant dans l’acquisition du P. Gahoonia et al. (1997) a trouvé que le nombre, la longueur et la surface occupée par les poils absorbants varient fortement d’un cultivar à l’autre. Gulden et vessey (2000) ont aussi observé que l’inoculation du pois ( Pisum sativum , L) cultivé au champ avec Penicillium bilaii a eu pour résultat une augmentation de 22% de la proportion de racines contenant des poils absorbants et une augmentation de 33% de la moyenne de la longueur des poils absorbants des plants de blé. Dans le futur, des travaux doivent être réalisés dans le but de déterminer les effets de l’inoculation avec les MSP et les champignons mycorhiziens sur le développement des poils absorbants chez différents cultivars de blé. En absence de traitement de fertilisation, l’inoculation avec la combinaison BR2 + C1 avec ou sans G. intraradices , à donné les meilleures résultats quant à la production de graines et à la concentration en P. Cette combinaison de MSP est aussi la meilleure pour la production de graines dans les parcelles fertilisées avec le PNT. En plus de son potentiel de bactérie favorisant l’installation des mycorhizes, la bactérie Pseudomonas sp. (BR2), comme d’autres MSP utilisés dans cet essai, est probablement une rhizobactérie favorisant la croissance des plantes (RFCP). Comme les plus fortes concentrations de P dans les graines ont été observées avec Gi + BR2 + Ci dans les parcelles non fertilisées ou fertilisées avec le PNT, la solubilisation du phosphore est probablement le mécanisme le plus important impliqué dans l’amélioration observée au niveau de la croissance. En effet, une augmentation significative de la solubilisation du phosphore a été observée après inoculation des racines de carottes transformées avec une bactérie solubilisant le P Pseudomonas aeruginosa et le champignon mycorhizien Gi (Villegas et fortin 2001). Différentes espèces de Pseudomonas ont stimulé la croissance du mycélium de spores de Glomus mosseae en germination dans un essai de colonisation des racines de tomate (Barea et al., 1998). D’autres études doivent être conduites pour évaluer la performance de la combinaison Gi + BR2 + C1 dans différents types de sols et avec différents cultivars de blé. En effet, certains inoculant de rhizobactéries favorisant la croissance des plantes (RFCP), peuvent différemment influencer les associations entre le blé et les champignons mycorhiziens aux champs (Germida et Walley, 1996). Le genre et l’espèce de champignons mycorhiziens impliqués (Graham et Abbott, 2000), le cultivar de blé (Zhu et al., 2001), et le contenu en P des graines (Zhu et Smith, 2001) constituent des facteurs additionnels qui peuvent significativement influencer cette symbiose. En tenant compte de tous les traitements de fertilisation et d’inoculation avec G. intraradices , l’inoculation avec les micoorganismes solubilisant le P (MSP) a significativement augmenté le contenu du blé en éléments minéraux, comparativement aux non inoculés. Cependant, en présence de PNT, l’inoculation avec les MSP et G. intraradices a occasionné une hausse du contenu en minéraux du blé avec une plus forte absorption de l’Al et du P. En plus, en présence de PNT, une forte corrélation positive entre la quantité d’Al absorbée et le contenu en P du blé a été observée. Selon Kochian et Jones (1997), La toxicité de l’Al constitue un des facteurs les plus limitant de la production agricole dans le monde et est caractérisé par une inhibition de l’élongation et même de la division cellulaire. Ainsi, la stimulation de l’absorption de l’Al par les MSP constitue un élément très important car le sol de l’essai et le phosphate naturel de Tilemsi, contiennent des quantités importantes de cet élément pouvant empêcher l’absorption du phosphore en agissant sur le développement normal des racines. Aussi, en favorisant l’absorption de l’Al, les MSP offrent aux plantes un mécanisme de résistance à l’Al qui est toxique pour la plupart des plantes à une concentration ≥ 5 μM. Plusieurs chercheurs ont montré que l’excrétion d’acides organiques est le mécanisme essentiel de résistance utilisé par les plantes exposées à l’Al (Delhaise et al., 1993 ; Pellet et al., 1995). Les racines du blé exposées à des doses toxiques d’Al (spécialement sous forme Al3-), sécrètent du malate dans l’apoplaste et la solution externe. Le malate sécrété forme rapidement des complexes avec l’Al dans l’apoplaste et dans la solution du sol, rendant ainsi l’Al non toxique et les racines 5 à 20 fois plus résistantes (Delhaise et al., 1993). Dans cet essai, ce mécanisme semble être en cause. En effet, dans les parcelles non fertilisées ou fertilisées avec le DAP, qui n’apportent pas des quantités supplémentaires d’Al au sol, la concentration d’Al dans les plantes de blé est très faible.

Pour qu’une bactérie soit efficace, elle doit pouvoir coloniser efficacement la rhizosphère. Aussi, nous avons effectué un test pour vérifier la capacité de la bactérie Pseudomonas sp. à coloniser la rhizosphère du blé. Les résultats obtenus ont montré que le taux d’inoculation des graines par la bactérie Pseudomonas sp. (BR2rif+) affecte significativement la colonisation de la rhizosphère du blé. Une interaction très significative a été observée entre le taux d’inoculation des graines et le type de sol (autoclavé ou non). Ce qui indique, qu’en fonction du type de sol, le taux d’inoculation des graines affecte différemment la colonisation des racines du blé par la bactérie. Dans cet essai, nous avons constaté qu’à partir d’une concentration bactérienne de 1,3 x 105 sur les graines de blé, plus le taux d’inoculation augmente, plus la densité bactérienne par gramme de sol rhizosphérique baisse, suggérant qu’à partir de cette densité initiale sur les graines, la bactérie n’arrivent pas à coloniser efficacement la rhizosphère du blé. Ce manque d’efficacité, peut s’expliquer par le fait que la bactérie n’arrive pas à bien se multiplier à partir de cette concentration, cela, à cause du manque d’éléments nutritifs ou de la présence dans la rhizosphère de substances défavorisant sa croissance. Les bactéries qui colonisent la rhizosphère directement après l’émergence de la plante, ont plus de chance de continuer à coloniser la coloniser durant toute la période de culture. En effet, La multiplication rapide des bactéries est nécessaire pour qu’elles puissent coloniser efficacement la rhizosphère directement après l’émergence des plantes. En plus, Les travaux de plusieurs chercheurs ont montré que la qualité et la quantité des éléments nutritifs déversés dans la rhizosphère peuvent sélectivement favoriser la croissance et la multiplication de certaines rhizobactéries (Atkinson et al., 1975; Miller et al., 1989). La méthode de détection utilisée pour détecter la bactérie, peut aussi expliquer le fait que BR2 soit faiblement détecté dans la rhizosphère du blé à certains taux d’inoculation. En effet, le volume utilisé pour détecter la bactérie, dans la méthode de dilution étalement, peut dans certain cas être un facteur limitant du compte bactérien (Kloepper et Beauchamp, 1992). Malgré tout, ce résultat ne concorde pas avec celui de Scher et al. (1984), qui n’ont obtenu aucune corrélation entre la densité de la population bactérienne des graines (entre 104-109cfu/graine) et la densité de la population bactérienne rhizosphérique.

En absence de fertilisation phosphatée, l’inoculation avec BR2 seul, Gi seul ou les deux combinés n’a pas amélioré la population microbienne totale (bactéries + champignons). En plus, la présence de Gi a significativement baissé la population microbienne totale suggérant ainsi, une compétition entre les microorganismes rhizosphériques pour le peu d’éléments nutritifs présents dans le sol. La capacité des microorganismes indigènes et introduits à coloniser la rhizosphère des plantes, dépend de leur capacité à utiliser différents substrats du sol. Malgré la baisse de la population microbienne observée, l’inoculation avec Gi seul ou combiné à BR2, a significativement augmenté la population des microorganismes (Bactéries et champignons) solubilisant le phosphore, probablement parce que Glomus intraradices apporte des substances nutritives à la bactérie BR2 qui à son tour met le P du sol à sa disponibilité, malgré que ce dernier puisse probablement solubiliser le P. L’effet négatif de Gi sur la population bactérienne totale a été corrigé par l’application du phosphate naturel de Tilemsi,

qui a entraîné une augmentation significative des microorganismes (bactéries et champignons) totaux et solubilisant le phosphore. Ce résultat est en accord avec ceux généralement obtenus faisant état d’une fluctuation de la population de champignons du sol après fertilisation (Sarathchandra et al., 1993). Cependant, au cours d’une expérience en serre, Lima et al. (1996) n’ont observé aucune variation de la population des champignons due à l’application de fertilisants. Le traitement combinant BR2rif+ et Gi a donné la plus forte augmentation de la population microbienne totale et solubilisant le phosphore. Puppi et al. (1994) ont indiqué que les microorganismes du sol stimulent la formation de symbioses mycorhiziennes et agissent sur les fonctions de celles-ci, tandis que, Jeffries et Barea (1994), annonçaient que la symbiose mycorhizienne peut contribuer à la mise en disponibilité d’éléments nutritifs pour les microorganismes de la rhizosphère. La bactérie Pseudomonas sp. en s’installant dans la rhizosphère du blé favorise la colonisation des racines du blé par les champignons mycorhiziens. Les taux de colonisation des racines du blé par les mycorhizes, étaient plus élevés après co-inoculation avec BR2 + Gi en présence ou non du phosphate naturel de Tilemsi. Ces résultats sont en accord avec ceux de Prathibha et al. (1995) qui ont observé que le nombre de spores et le pourcentage de colonisation des racines, étaient plus élevés chez les plantes inoculées avec G. fasciculatum + Azospirillium que chez celles, non inoculées, et ce, en présence ou non d’une source de phosphore. De même, Toro et al. (1997) ont pu augmenter de façon significative, le taux de colonisation des racines avec G. intraradices par l’addition de roche phosphatée et l’inoculation avec B. subtilis .