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1 Introduction

Table des matières

La vie sur terre telle que nous la connaissons actuellement est le fruit de milliards d’années d’évolution et l’apparition de la première bactérie a certainement marqué le début de ce qui est devenu une lutte perpétuelle pour l’existence. Dans son traité historique L’Origine des espèces [1992 (1859)], Charles Darwin nous rappelle fort à propos que cette lutte pour la vie résulte nécessairement en la mort de certains individus, puisqu’il en naît plus que n’en peut supporter un territoire donné. Ainsi, bien que cela soit plutôt paradoxal, la mort est essentielle au maintien de la vie.

Si les observations de Darwin se limitaient aux organismes entiers, le même constat peut toutefois être appliqué à une échelle inférieure aux organes et aux cellules d’un être vivant. En effet, c’est la balance entre les différents choix qui s’offrent à chaque cellule (mitose, différenciation ou mort) qui fait en sorte qu’un organisme adulte et ses différents organes présentent un nombre constant de cellules (Melino, 2002). Bien que les deux premières options fassent l’objet d’intenses recherches depuis plus d’un siècle, ce n’est que depuis le milieu des années ‘80 que les scientifiques s’intéressent activement au sort ultime réservé à toutes ces cellules, la mort. Comme le faisait remarquer Leopold dans un article avant-gardiste traitant des fonctions de la sénescence dans le développement végétal, « cet événement du cycle de vie des plantes n’est discuté dans aucun ouvrage de physiologie végétale » (Leopold, 1961).

Le fait que la mort de certains tissus puisse être normale avait toutefois été reconnu au cours de la renaissance avec l’observation de la métamorphose des insectes et des amphibiens, mais il a fallu attendre l’essor du microscope (fin du XIXe siècle et début du XXe siècle) pour que des études de biologie du développement et de phytopathologie permettent l’apparition d’un concept de mort cellulaire physiologique et active. Et puisque le concept de mort cellulaire a d’abord nécessité la considération de la cellule comme étant l’unité de base de la vie, rappelons que le mot « cellule » a été utilisé pour la première fois dans un sens biologique par Robert Hooke, alors qu’il décrivait en 1665 dans son traité Micrographica les éléments microscopiques constituant le liège et d’autres tissus végétaux (faisant alors référence à des « petites cavités séparées de murs »). Les premières cellules dont l’observation est rapportée dans l’histoire (bien que la théorie cellulaire en tant que telle n’ait été élaborée que 150 ans plus tard) étaient donc des cellules végétales mortes dont il ne restait que la paroi, suite à l’exécution d’un programme de mort. Jones (2001) nous rappelle que les premières preuves que la mort est un programme actif nous viennent entre autres des végétaux ; d’abord par l’exemple de cellules végétales infectées par un champignon, où la cellule participe activement à sa propre destruction (Allen, 1923), puis par des travaux sur la sénescence foliaire montrant que le noyau est requis pour la désintégration cellulaire (Yoshida, 1961). Leopold a également fait valoir auprès de la communauté scientifique la nécessité de la mort dans le développement végétal et les avantages évolutifs qu’elle concède (Leopold, 1961). Mais ce sont Lockshin et Williams, étudiant alors la métamorphose des papillons, qui ont reconnu ces événements de mort associés au développement comme étant « programmés » et nécessitant l’utilisation d’énergie et la transcription de gènes (Lockshin et Williams, 1965a, b, c). Ces travaux furent ainsi les premières fois où l’on parla de la « mort cellulaire programmée » (PCD) comme étant l’élimination délibérée de certaines cellules pour le mieux-être de tout l’organisme, nécessitant une participation cellulaire active. Par la suite, le terme « apoptose » a été proposé par Kerr et collaborateurs suite à l’observation des nombreuses similarités morphologiques lors de la mort de plusieurs types de cellules de mammifère, que ce soit au cours du développement normal ou dans des situations pathologiques (Kerr et al. , 1972 ; voir aussi la rétrospective de Kerr, 2002). Le terme « nécrose », habituellement utilisé à l’époque pour identifier tous les types de mort, a été restreint à une mort cellulaire accidentelle causée par des perturbations environnementales « qui doivent être violentes et mener à une interruption rapide des fonctions majeures et à l’effondrement de l’homéostasie interne ». L’utilisation du terme « apoptose » a été introduite pour décrire un type de PCD qui « semble jouer un rôle opposé mais complémentaire à la mitose dans la régulation des populations cellulaires animales. Ses caractéristiques morphologiques suggèrent un phénomène actif, intrinsèquement programmé qui peut être initié ou inhibé par une variété de stimuli environnementaux, physiologiques ou pathologiques » (Kerr et al. , 1972, cité par Bursch et al. , 2000). Les caractéristiques morphologiques en question, que l’on considère encore aujourd’hui comme caractéristiques de l’apoptose, sont la condensation du cytoplasme, le détachement des autres cellules dans les tissus, la fragmentation de la cellule (y compris le noyau) en « corps apoptotiques » délimités par une membrane sans qu’il y ait fuite du contenu cellulaire, suivi de la phagocytose des corps apoptotiques par les cellules avoisinantes ou des macrophages.

Bien que les propositions de Kerr et collaborateurs, basées sur des données morphologiques, aient permis une plus grande reconnaissance scientifique de l’importance du suicide cellulaire, l’intérêt pour l’apoptose et la PCD en général est demeuré plutôt faible, de sorte qu’il a fallu attendre l’établissement, dans les années ‘80, de bases génétiques du phénomène pour qu’il devienne un domaine de recherche en soi (Vaux, 2002). Ces bases sont venues de travaux avec le nématode Caenorhabditis elegans (chez lequel exactement 131 des 1090 cellules somatiques initiales meurent lors de son développement hermaphrodite), qui ont conduit à l’identification de toute une gamme de gènes spécifiques à la PCD du nématode et parallèlement des mammifères. À ce stade-ci, notons seulement le gène humain Bcl-2 , qui est structurellement et fonctionnellement homologue à Ced-4 du nématode (Vaux et al. , 1992) et le premier régulateur de l’apoptose à avoir été reconnu. Initialement identifié à cause de sa translocation chromosomique dans les lymphomes folliculaires humains, il a d’abord été assumé que Bcl-2 , tout comme les autres oncogènes impliqués dans les translocations (e.g. c-Myc ), stimulait la prolifération cellulaire. Or, des études de surexpression ont plutôt montré qu’il prévenait la mort, entre autres lors du retrait d’un facteur de croissance (Vaux et al. , 1988), démontrant ainsi non seulement le rôle de Bcl-2 dans l’apoptose, mais également que les cancers humains pouvaient résulter de l’inhibition de la mort cellulaire et pas seulement de la stimulation de la prolifération. Les acteurs génétiques de la PCD chez C. elegans s’étant révélés conservés dans l’évolution, les découvertes chez le nématode ont été appliquées aux mammifères. Les années ‘90 devinrent alors « l’âge d’or » de l’apoptose, cette dernière se retrouvant impliquée dans des maladies auto-immunes et le développement général du système immunitaire (Strasser et al. , 1991), puis dans le SIDA et des maladies neuro-dégénératives, comme le Parkinson et l’Alzheimer (revu par Duke et al. , 1996).

Chez les végétaux, l’étude de la PCD n’a pas connu le même essor fantastique, mais a fait son bout de chemin. Étant donné son importance à toutes les étapes du développement de même qu’en réaction de défense envers les phytopathogènes, la PCD végétale est maintenant un domaine de recherche à part entière. La section suivante définira de façon globale les mécanismes moléculaires de la PCD animale et plus particulièrement l’apoptose (section 1.3), qui constituent en partie les bases de son pendant végétal. La PCD végétale sera ensuite survolée, autant d’un point de vue développemental que pathologique, avant de s’attaquer un peu plus en détails à certains paradigmes de cette science encore jeune (section 1.4).

Le concept de mort cellulaire « programmée » est en fait une définition opérationnelle qui implique la participation active de la cellule dans sa propre destruction (Tableau 1-1). Bien que ce processus requiert l’activité de gènes spécifiques, il faut cependant noter qu’il n’implique pas nécessairement la transcription et/ou la traduction de novo , mais peut simplement compter dans certains cas sur l’activation de protéines déjà synthétisées et conservées dans un état de latence, ou sur le recrutement de protéines occupées à d’autres fonctions.

Par opposition, la nécrose est le résultat d’une perte de contrôle rapide et/ou massive des ressources énergétiques ou de l’intégrité des barrières membranaires. Typiquement, elle est accompagnée d’un gonflement osmotique de la cellule et de ses organites (communément les mitochondries), puis éventuellement de la lyse et de l’arrachement des composés cytoplasmiques (voir entre autres les revues de Lockshin et Zakeri, 2002, 2004). La morphologie associée à ce type de mort est variable et mal définie, peut-être due à l’absence de participation active de la part de la cellule. En effet, contrairement à la PCD, la nécrose est un événement que la cellule subit et non un phénomène induit délibérément. Considérant que la nécrose, contrairement à la PCD, entraîne le relâchement du contenu cellulaire dans l’espace intercellulaire (et conséquemment le recrutement du système immunitaire et une réponse inflammatoire), il n’est pas surprenant que la PCD soit la finalité la plus répandue. La nécrose est donc l’exception plutôt que la règle chez les animaux et de ce fait nous n’en traiterons pas plus longuement.

Adapté de Lockshin et Zakeri, 2004.

Comme cela est mentionné au Tableau 1-1, la PCD est associée à certaines étapes du développement normal des animaux, mais peut aussi être activée dans des situations pathologiques diverses. Par exemple, des cellules du système immunitaire reconnaissant des cellules infectées par un pathogène vont stimuler chez ces cellules corrompues l’activation d’un programme de mort (dans ce cas-ci l’apoptose). Dans d’autres cas, l’activation incontrôlée de la PCD dans les cellules neuronales peut être responsable de certaines maladies neurodégénératives. La PCD associée aux pathologies peut donc être à la fois bénéfique et détrimentale, selon les cas.

Nous avons déjà spécifié dans notre aperçu historique (section 1.1) le contexte dans lequel le mot apoptose a été associé à la PCD. Ainsi, la définition de l’apoptose reposait à l’origine strictement sur des caractères morphologiques spécifiques (Kerr et al. , 1972). Ultérieurement, l’extériorisation active des phosphatidylsérines a été identifiée comme étant l’un des signaux pour la phagocytose et ainsi considérée comme l’un des marqueurs de l’apoptose. De même, la marginalisation de la chromatine a été associée à un clivage contrôlé de l’ADN au niveau internucléosomal, qui peut être détecté par gel d’électrophorèse (produisant des « échelles d’ADN » caractéristiques dues à la génération de fragments étant des multiples de 180-190 pb) ou par marquage in situ ( terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated dUTP nick end labeling ; TUNEL). La fragmentation du génome est considérée comme un moyen de rendre le programme de mort irréversible et facilite par le fait même le démantèlement du noyau pour son incorporation dans les corps apoptotiques. Le démantèlement du reste de la cellule et la morphologie typique qui l’accompagne sont quant à eux assurés entre autres par les caspases, une classe de cystéine protéases dont l’activation est presque considérée comme synonyme de l’apoptose (voir section 1.3.2). Il est à noter que lorsque observée dans des cellules cultivées in vitro , l’apoptose se termine par une phase nécrotique, puisque la phagocytose par les macrophages ou les cellules avoisinantes n’a pas lieu (Kaufmann et Hengartner, 2001; Vaux, 2002).

La PCD peut aussi se présenter sous d’autres formes, en l’occurrence la PCD dite lysosomale, de type II ou autophagique, ces trois termes désignant tous un même type de PCD (Tableau 1-1). En réalité, avant la découverte des caspases et leur étroite association avec l’apoptose, la plupart des cas de mort cellulaire étudiés étaient considérés comme étant lysosomaux (Lockshin, 1969) ou de « Type II » (Schweichel et Merker, 1973), nécessitant l’activation du compartiment lysosomal. Appelé ultérieurement mort cellulaire autophagique, ce type de mort cellulaire est caractérisé morphologiquement par une abondante formation de vacuoles autophagiques (autophagosomes) qui résultent de la séquestration de portions du cytoplasme (incluant des organelles) à l’intérieur d’une vésicule pourvue d’une double membrane, et de sa fusion subséquente aux lysosomes, qui fournissent les hydrolases (voir Figure 1-1).

La formation de vacuoles autophagiques (autophagosomes) résulte de la séquestration de portions du cytoplasme (incluant des organelles) à l’intérieur d’une vésicule pourvue d’une double membrane (en rose). Les autophagosomes fusionnent ensuite aux lysosomes (en violet), qui fournissent les hydrolases (en vert), pour former des autolysosomes. Chez la levure et les végétaux, l’autophagosome fusionne plutôt avec la vacuole. Tiré de Yoshimori (2004).

La mort autophagique ne répondant pas à tous les critères de l’apoptose, elle a souvent été cataloguée à tord de nécrose, amenant certaines confusions. De même, de nombreux cas de PCD animale ont été qualifiés d’apoptose sur la simple base qu’ils impliquaient l’activation de processus cellulaires, alors qu’il pourrait s’agir en fait de mort par autophagie (voir les revues de Sloviter, 2002; Abraham et Shaham, 2004; Lockshin et Zakeri, 2004). Ces confusions proviennent du fait que la découverte des caspases et de leur activation pour le démantèlement cellulaire apoptotique a imposé le dogme de l’apoptose pendant les années ‘80 et ‘90. La prépondérance a été telle que le mot apoptose était (et est parfois encore, surtout chez les végétaux) négligemment utilisé pour désigner la PCD. Ainsi, au moment où la présente thèse a été entreprise en 1999, il n’était pas rare de retrouver dans la littérature scientifique, les ouvrages de référence ou les catalogues de différentes compagnies l’utilisation du mot apoptose pour désigner la PCD. La formule «  Programmed cell death, or apoptosis, is … » a été malheureusement très répandue, laissant un lecteur non averti croire que les deux termes étaient synonymes, ce qui est faux. Bien que l’apoptose constitue indubitablement une forme de PCD, la définition de la PCD ne se limite pas à celle de l’apoptose, comme en témoigne l’existence de l’autophagie. En réalité, certains cas de PCD classiquement considérés autophagiques semblent avoir recours à l’apoptose dans les derniers stades, y compris l’activation des caspases, et le premier stade autophagique pourrait constituer un moyen de diminuer la masse cellulaire à éliminer (Abraham et Shaham, 2004; Lockshin et Zakeri, 2004). Il a ainsi été suggéré que l’apoptose et l’autophagie pourraient constituer les deux extrêmes de la PCD entre lesquels se retrouverait un continuum de différentes formes ayant recours à certains éléments de l’un et l’autre de ces extrêmes (voir entre autres Guimarães et Linden, 2004; Lockshin et Zakeri, 2004).

Le paradigme de l’apoptose, cette forme très répandue mais surtout très étudiée de PCD animale, est un incontournable pour quiconque s’intéresse de près ou de loin à la PCD. Dans cette section, les mécanismes moléculaires régissant le contrôle et l’exécution de l’apoptose chez les mammifères seront présentés de façon succincte et non exhaustive de façon à être ensuite en mesure d’apprécier toute la complexité de la PCD végétale.

Les caspases sont caractérisées par la présence d’un résidu cystéine dans leur site actif, de même que par le clivage de leur substrat après un résidu aspartate (une spécificité très rare chez les autres classes de protéases), de sorte qu’elles ont été désignées sous le terme « caspases ». De même, la détermination de leur structure tertiaire a révélé une topologie unique désignée repliement caspase-hémoglobinase. Les caspases impliquées dans l’apoptose peuvent être subdivisées en deux classes, soit les caspases initiatrices (caspase-2, -8, -9 et -10), responsables du déclenchement des cascades d’activation des caspases, et en caspases effectrices (caspases-3, -6 et -7), véritables responsables de la destruction cellulaire au cours de l’apoptose. Elles sont toutes produites sous forme d’un grand précurseur inactif (procaspase) qui demeure latent dans la cellule, et elles sont activées lorsque nécessaire par clivage (voir Figure 1-2). Les procaspases contiennent trois domaines : un pro-domaine en N-terminal, une grosse sous-unité d’environ 20 kDa (p20) et une petite sous-unité d’environ 10 kDa (p10). Suite à la libération par clivage des sous-unités p10 et p20, celles-ci s’associent en complexes comprenant chacun deux grosses et deux petites sous-unités, qui constituent la forme active des caspases. Contrairement aux caspases effectrices, les caspases initiatrices ont généralement un long pro-domaine qui est impliqué dans les interactions protéine-protéine nécessaires au recrutement des procaspases dans un complexe d’activation. La proximité des procaspases dans ces complexes suffit pour que leur faible activité protéolytique intrinsèque permette leur clivage mutuel et la libération de leurs sous-unités. Une fois activées, les caspases initiatrices activent à leur tour les caspases effectrices, ces dernières pouvant contribuer à amplifier le signal apoptotique par le clivage d’autres procaspases initiatrices. Les caspases effectrices ont entre autres pour cible les lamines nucléaires, les protéines du cytosquelette, la CAD ( caspase-activated DNase , responsable de la fragmentation internucléosomale de l’ADN nucléaire), etc. (voir les revues de Salvesen et Dixit, 1999; Chang et Yang, 2000; Creagh et Martin, 2001; Degterev et al. , 2003).

Les caspases initiatrices sont activées soit par la proximité induite lors de la multimérisation d’un récepteur (en haut à gauche), soit par l’activation par une sous-unité régulatrice, comme le complexe (apoptosome) formé d’Apaf-1 et du cytochrome c (Cyt c ) suite à leur sortie des mitochondries (à droite). En présence de leur ligand, les récepteurs de mort s’agglomèrent en trimères et recrutent à leur face cytoplasmique la procaspase-8 ou -10 via l’intermédiaire de protéines adaptatrices (telles que TRADD et FADD). L’activation des caspases (sauf dans le cas de la procaspase-9 au sein de l’apoptosome) implique leur clivage en deux sous-unités (une grande p20 et une petite p10) qui s’associent en complexes comprenant chacun deux grosses et deux petites sous-unités. Une fois activées, les caspases initiatrices amorcent une cascade d’activation de caspases qui s’amplifie et permet l’attaque d’une variété de cibles cellulaires. Voir le texte pour d’autres détails. Tiré de Ouellet (2004)avec modifications.

D’autre part, le sentier intrinsèque (« de l’intérieur ») menant à l’activation de la cascade de caspases a comme point central l’établissement d’un complexe d’activation de la caspase-9, l’apoptosome, dont la formation est régulée par les mitochondries. Celles-ci jouent un rôle clé dans la régulation de l’apoptose (et dans la mort cellulaire en général). Elles collectent de l’information sur différents aspects du métabolisme cellulaire et des cascades de transduction de signal, intègrent cette information, puis décident du sort de la cellule et participent à l’exécution des condamnations à mort (Ferri et Kroemer, 2001). Suivant l’intégration de différents « stimuli de mort » (comme par exemple la perception de drogues cytotoxiques, des radiations UV, l’absence de cytokines ou de facteurs de croissance, le détachement de la cellule de la matrice extracellulaire, etc.), la membrane mitochondriale externe (MME) devient perforée due à la formation de pores (voir un peu plus loin dans cette section) et donc perméable à certaines protéines normalement séquestrées dans l’espace intermembranaire (EIM). Parmi celles-ci se trouve entre autres le cytochrome c (cyt c ) qui en présence d’ATP peut se lier avec Apaf1 ( apoptotic protease activating factor-1 ) pour le recrutement de procaspases-9, formant un très gros complexe appelé apoptosome (Figure 1-2). C’est au sein de l’apoptosome que la procaspase-9 peut être activée, grâce à l’interaction de son domaine CARD ( N-terminal caspase-recruitment domain ) avec celui d’Apaf1, sans nécessiter le clivage de l’holoenzyme (revu par Saelens et al. , 2004).

L’intégrité de la MME est contrôlée entre autres par les protéines membres de la famille Bcl-2 (voir les revues de Gross et al. , 1999; Adams et Cory, 2001; Antonsson, 2001; Borner, 2003). L’implication de la protéine Bcl-2 dans la régulation de l’apoptose a été brièvement mentionnée à la section 1.1. En fait, la découverte de Bcl-2 a pavé la voie à l’identification de toute une famille de gènes codant pour des protéines impliquées dans la régulation positive ou négative de l’apoptose. Ces protéines sont caractérisées par des homologies de séquence dans de courtes régions conservées nommées domaines BH ( Bcl-2 homology ) (Figure 1-3). Alors que C. elegans ne possède que deux membres de cette famille, une trentaine de membres ont été identifiés chez les mammifères, témoignant d’une régulation de l’apoptose beaucoup plus complexe. Les protéines de la famille Bcl-2 sont classées selon leur fonction pro- ou anti-apoptotique et selon le nombre de domaine BH dont elles disposent. Elles ont ainsi été classées en trois catégories ; l’une est formée des protéines anti-apoptotiques et les deux autres catégories se partagent les pro-apoptotiques « multidomaines » et les pro-apoptotiques « BH3 seulement » (Figure 1-3). Comme leur nom l’indique, ces dernières ne possèdent que le domaine BH3. Plusieurs protéines de la famille possèdent en plus un domaine transmembranaire (TM) en C-terminal (α9) qui permet leur localisation aux membranes des organites, comme la mitochondrie et le réticulum endoplasmique (RE), où elles exercent leur action. Malgré une quantité impressionnante de publications à ce sujet, les mécanismes exacts par lesquels les membres de la famille Bcl-2 contrôlent la perméabilité membranaire mitochondriale font encore l’objet de controverses (voir les revues de Gross et al. , 1999; Borner, 2003; Petros et al. , 2004, et le paragraphe suivant).

Seulement certains membres représentatifs sont montrés et sont retrouvés chez les mammifères, sauf mention contraire. Les domaines Bcl-2 homology (BH) et les segments transmembranaires (TM) sont indiqués. La position des hélices α est montrée pour Bcl-2, ainsi que la région responsable de la formation de pores au sein des membranes. Voir le texte pour d’autres détails. Tiré de Ouellet (2004).

Quoi que la similarité entre les différents membres de la famille Bcl-2 soit restreinte aux domaines BH, il n’en demeure pas moins que ces protéines possèdent des structures tridimensionnelles remarquablement similaires. Brièvement, cette structure consiste en deux hélices hydrophobes centrales (α5 etα6) entourées de six ou sept hélices amphipathiques, formant une structure étrangement similaire à celle des domaines de formation de pores de certaines toxines bactériennes. En fait, les protéines anti-apoptotiques Bcl-2 et Bcl-XLet la pro-apoptotique Bax peuvent toutes former des pores au sein de membranes artificielles, et ce grâce aux hélices hydrophobesα5 etα6, mais il n’est tout de même pas clair si un tel processus a vraiment lieu in vivo . Il faut également souligner qu’outre leur capacité à former des canaux ioniques membranaires de novo , les membres pro-apoptotiques tels que Bax et Bid (tBid) pourraient aussi contribuer à la perméabilisation de la MME via la déstabilisation de la structure lipidique. Un autre modèle populaire est celui où les pro-apoptotiques (multidomaines) collaboreraient plutôt avec d’autres protéines de la membrane mitochondriale pour former des canaux chimériques. Dans ce modèle, certains membres de la famille Bcl-2 pourraient réguler de façon positive (pro-apoptotiques) ou négative (anti-apoptotiques) l’activité du PTP ( permeability transition pore ) mitochondrial. Le PTP traverse les deux membranes mitochondriales aux sites de contact et transporte l’ADP, l’ATP et d’autres petites molécules (<1500 Da). Bien que les composantes moléculaires de ce pore soient encore imprécises, il est à tout le moins composé du VDAC ( voltage-dependent anion channel ) à la MME, du ANT ( adenine nucleotide transporter ) à la membrane mitochondriale interne (MMI) et de la cyclophiline D dans la matrice mitochondriale (Figure 1-4). L’ouverture du PTP peut entraîner le gonflement de la mitochondrie, la dépolarisation de la MMI et le découplement de la phosphorylation oxydative résultant en la perte de la synthèse d’ATP et la production de formes réactives de l’oxygène ( reactive oxygen species ; ROS). Les pro-apoptotiques pourraient s’associer au PTP et permettre ainsi le passage de molécules beaucoup plus grosses qu’à l’habitude (Brookes et al. , 2004).

Les composantes putatives du pore sont présentées, bien que leur arrangement exact les unes par rapport aux autres ne soit pas connues. ANT : adenine nucleotide transporter; PBR : peripheral benzodiazepine receptor ; VDAC : voltage-dependent anion channel; Cyp-D : cyclophiline D. MME : membrane mitochondriale externe; MMI : membrane mitochondriale interne. Tiré de Brookes et al . (2004).

Plusieurs protéines de l’espace intermembranaire sont effectivement relâchées durant l’apoptose, possiblement mais pas nécessairement via le PTP. Outre le cyt c dont il a déjà été mention, notons AIF ( apoptosis-inducing factor ) et l’endonucléase G, toutes deux contribuant aux dommages à l’ADN nucléaire de façon indépendante des caspases. Notons également Smac/DIABLO et la sérine protéase HtrA2/OMI, qui antagonisent les inhibiteurs de caspases IAPs ( inhibitor of apoptosis ), favorisant ainsi l’activation des caspases. Cependant, ces deux protéines peuvent aussi provoquer la PCD indépendamment des caspases via des mécanismes encore inconnus (voir les revues de Borner, 2003; Saelens et al. , 2004; Sharpe et al. , 2004).

Les interactions protéine-protéine entre les différents membres de la famille sont aussi très importantes pour leur activité. L’exemple classique est celui où un excès de Bax entraîne la cellule vers la mort, mais la co-expression de Bcl-2 ou Bcl-XLneutralise cet effet. Il a donc été suggéré que les niveaux relatifs des membres pro- et anti-apoptotiques pourraient constituer un « rhéostat » régulant le seuil apoptotique de la cellule. La formation d’homo- ou hétérodimères entre les membres de la famille a lieu au sein des membranes, et ce via le domaine BH3. Les anti-apoptotiques présentent un sillon hydrophobe proéminent à leur surface, qui est le site de liaison du domaine BH3 de différentes protéines pro-apoptotiques telles que Bax et Bad. Les pro-apoptotiques qui ne sont pourvus que d’un domaine BH3 pourraient donc avoir évolué de façon à réguler (neutraliser) les membres anti-apoptotiques (voir les revues de Gross et al. , 1999; Borner, 2003; Petros et al. , 2004).

Le cas du pro-apoptotique Bax constitue un bon exemple de la régulation de la perméabilité membranaire par des interactions protéine-protéine. Dans les cellules saines, Bax se retrouve principalement sous forme de monomère dans le cytosol (environ 60%) ou attaché lâchement à la MME. Suivant un signal apoptotique, il y a translocation de la protéine à la mitochondrie grâce à un changement de conformation qui résulte en la libération de son domaine TM (α9) et l’insertion de celui-ci dans la MME. Le domaine C-terminal (TM) est normalement replié dans le sillon hydrophobe de Bax, mais le changement de conformation associé à son déploiement expose le domaine BH3, permettant la formation d’oligomères, ou sa liaison à un anti-apoptotique ou à d’autres pro-apoptotiques (Borner, 2003; Petros et al. , 2004).

Il apparaît donc que les mécanismes moléculaires responsables des activités pro- et anti-apoptotiques des membres de la famille Bcl-2 pourraient être une combinaison d’interactions protéine-protéine et de la formation/modulation de pores ou canaux membranaires. Étant donné que plusieurs membres de la famille partagent une structure similaire, il est fort probable que ce soit leur diversité de séquence qui détermine leur préférence quant au choix de leurs partenaires protéiques.

En tant que réservoir de Ca2+(concentration d’environ 1 mM), le RE joue un rôle majeur dans les flux de Ca2+associés à l’apoptose. De prime abord, rappelons que le RE constitue un organite hautement dynamique impliqué non seulement dans la synthèse et le repliement des protéines, mais aussi dans la signalisation associée à de nombreuses fonctions cellulaires. La signalisation par le Ca2+associée au RE est assurée par la présence de récepteurs de ryanodine (RyR) et d’inositol-3-phosphate (IP3R), qui constituent des canaux calciques permettant le passage du Ca2+lorsqu’en présence des seconds messagers ADP-ribose cyclique (ADPRc; pour les RyR) et IP3(pour les IP3R; Berridge, 2002). Le Ca2+peut également s’échapper du RE par des fuites ( leak pathway ) attribuables à la présence de pores servant à l’insertion des protéines nouvellement synthétisées à l’intérieur du RE (ces pores sont fermés de façon plus ou moins étanche par la présence d’un ribosome du côté cytosolique et la chaperonne BIP dans le lumen; Camello et al. , 2002). La sortie de Ca2+du RE est contrebalancée grâce à la pompe sarco-endoplasmic reticulum Ca 2+ –ATPase (SERCA; Berridge, 2002).

Dans des conditions physiologiques, les mitochondries contribuent à la régulation de la [Ca2+]cen important celui-ci grâce à la force motrice provenant de leur différence de potentiel membranaire (Δψm) négatif interne maintenu par la chaîne respiratoire (Carafoli, 2004; Szabadkai et Rizzuto, 2004). Ce cycle du Ca2+dans les mitochondries est nécessaire au métabolisme mitochondrial, entre autres pour le bon fonctionnement de certaines déshydrogénases localisées dans la matrice et impliquées dans le cycle des acides tricarboxyliques et la phosphorylation oxydative (Carafoli, 2004). Une élévation de la concentration de Ca2+dans les mitochondries ([Ca2+]m) aura donc pour effet de favoriser l’activité de la chaîne respiratoire et conséquemment la génération d’ATP. Il semble donc que certains stimuli entraînant une hausse de la [Ca2+]csoient perçus au niveau mitochondrial via une hausse de la [Ca2+]m, ce qui entraîne une augmentation de la production d’ATP pour répondre aux besoins cellulaires, comme c’est le cas par exemple lors de la stimulation de cellules du cœur (cardiomyocytes) par les β-adrénergiques, où l’élévation de la [Ca2+]mfournit l’ATP nécessaire à la force contractile (Brookes et al. , 2004).

Bien que l’élévation de la [Ca2+]msoit généralement bénéfique pour la cellule, il arrive qu’elle ait aussi des effets négatifs, particulièrement en conditions pathologiques où la [Ca2+]c, et conséquemment la [Ca2+]m, deviennent très élevées. Le canal responsable de l’entrée du Ca2+dans la mitochondrie (dont la nature moléculaire est encore inconnue) est très sélectif, mais n’a que peu d’affinité pour l’ion, de sorte que la concentration périmitochondriale en Ca2+doit être de l’ordre du μM pour permettre l’ouverture du canal. Or, les mitochondries sont physiquement localisées tout près du RE (ou de la membrane plasmique où se trouvent d’autres canaux), se retrouvant ainsi au cœur de microdomaines cytosoliques où la [Ca2+]cpeut être très élevée (Carafoli, 2004; Szabadkai et Rizzuto, 2004). Lorsque la cellule est soumise à des stress apoptotiques conduisant à la présence soutenue de tels microdomaines, la matrice mitochondriale ne fournit plus à tamponner tout ce Ca2+; le PTP s’ouvre alors et laisse fuir non seulement ce surplus de Ca2+mais aussi plusieurs protéines cytotoxiques telles que le cyt c (voir section 1.3.4 et la Figure 1-5) qui participe à la formation de l’apoptosome et incidemment à l’activation de la cascade des caspases. De plus, le cyt c peut aussi transloquer vers le RE et interagir avec les IP3R de façon à favoriser la sortie de Ca2+par ces canaux, générant ainsi une boucle de rétroaction positive menant à un relâchement généralisé du cyt c et l’induction de l’apoptose (Boehning et al. , 2003). Les ROS générés par les dysfonctions mitochondriales peuvent aussi modifier la répartition du Ca2+cellulaire en activant les récepteurs RyR du RE par l’oxydation d’un résidu thiol, générant là encore une boucle d’autoamplification (Brookes et al. , 2004). Il faut cependant noter qu’il est possible que le cyt c soit évacué des mitochondries par d’autres moyens que le PTP. De plus, bien que l’ouverture du PTP in vitro entraîne le gonflement des mitochondries et la rupture de la membrane externe, il est peu probable que cela entraîne la sortie du cyt c in vivo , car ce gonflement des mitochondries n’est pas typiquement observé pendant l’apoptose (Brookes et al. , 2004).

La circulation du Ca2+entre le RE et les mitochondries fait partie des processus cellulaires normaux. Cette circulation repose sur la participation des canaux à Ca2+de la mitochondrie et du RE, dont IP3R et RyR, et la pompe Ca2+/ATPase du RE (SERCA). Lors de signaux apoptotiques affectant le RE, les canaux peuvent laisser sortir beaucoup de Ca2+, créant ainsi des microdomaines où la [Ca2+]cest suffisamment élevée pour permettre l’ouverture, au niveau des mitochondries, d’unipoteurs calciques de faible affinité. Un surplus soutenu de Ca2+entraîne l’ouverture du PTP mitochondrial, et conséquemment la sortie du cyt c vers le cytosol où il va participer à la formation de l’apoptosome (voir section 1.3.2; le PTP ne semble pas avoir l’exclusivité pour le passage du cyt c ). Le cyt c peut aussi interagir avec les IP3R pour augmenter la sortie de Ca2+du RE. L’entrée de Ca2+dans la mitochondrie de même que l’ouverture du PTP contribuent à dissiper le Δψmet à générer des ROS, lesquels peuvent activer les RyR et amplifier la sortie de Ca2+du RE. La quantité de Ca2+en réserve au RE reflète la balance entre les membres pro- et anti-apoptotiques. D’une part, Bcl-2 contribue à diminuer la [Ca2+]REalors que Bax l’augmente, de sorte que la quantité de Ca2+pouvant être évacuée du RE en situation de stress se trouve respectivement diminuée et augmentée. Bcl-2 pourrait agir entre autres en diminuant l’activité de la SERCA ou en modifiant l’état de phosphorylation de IP3R. Consulter le texte pour plus de détails. Figure adaptée de Ouellet (2004).

Le fait que l’apoptose puisse être induite par une altération du flux de Ca2+entre le RE et les mitochondries nous ramène aux fonctions régulatrices des protéines membres de la famille Bcl-2. En effet, plusieurs d’entre elles sont localisées et exercent leur fonction à la fois à la mitochondrie et au RE. Par exemple, Bax et Bak peuvent favoriser l’ouverture du PTP directement à partir de la MME (voir section 1.3.4). Cependant, 10-15% de ces deux pro-apoptotiques sont aussi localisées au RE, d’où elles peuvent favoriser la modulation à la hausse du niveau normal ( steady-state level ) de Ca2+([Ca2+]RE) (Nutt et al. , 2002a; Nutt et al. , 2002b; Scorrano et al. , 2003; voir aussi la revue récente de Annis et al. , 2004). Conséquemment, une plus grande quantité de Ca2+peut être relâchée du RE en situation de stress, et donc l’importation de Ca2+par les mitochondries s’en trouve favorisée, augmentant les risques de saturation et d’ouverture du PTP menant à l’induction de l’apoptose (voir Figure 1-5).

À l’inverse, des antagonistes de l’apoptose tels que Bcl-2 et Bcl-XLpréviennent la formation du PTP en réponse à de nombreux signaux apoptotiques. Or, Bcl-2 peut être tout aussi efficace (dépendamment du stress) lorsque exprimée spécifiquement à la mitochondrie ou au RE (Rudner et al. , 2001). Considérant qu’environ le deux tiers de Bcl-2 endogène est localisée à la membrane du RE (Annis et al. , 2004), il n’est pas si surprenant qu’elle puisse exercer certaines de ses fonctions à partir de cet organite. En outre, l’action de Bcl-2 au RE implique une altération de la [Ca2+]RE. Contrairement au pro-apoptotique Bax, qui contribuerait à maintenir à la hausse la [Ca2+]RE, Bcl-2 favoriserait plutôt un niveau plus faible (Foyouzi-Youssefi et al. , 2000; Pinton et al. , 2000; Vanden Abeele et al. , 2002; Breckenridge et al. , 2003b), ce qui aiderait à limiter la quantité de Ca2+pouvant être évacuéedu RE en situation de stress, et par conséquent pourrait aussi empêcher les surplus de Ca2+aux mitochondries (voir les revues de Ferrari et al. , 2002; Rizzuto et al. , 2003).

Cette plus faible [Ca2+]REengendrée par la présence de la protéine anti-apoptotique Bcl-2 au RE serait due à un effet indirect de Bcl-2 sur l’homéostasie du Ca2+. En effet, des changements dans l’expression ou l’activité de certaines protéines impliquées dans la signalisation par le Ca2+entraînent une augmentation de la perméabilité membranaire ( leak ) du RE envers le Ca2+(revu par Distelhorst et Shore, 2004). Par exemple, Vanden Abeele et collaborateurs (2002) ont montré que la surexpression de Bcl-2 est associée à une plus faible expression de la pompe SERCA (voir la section 1.3.5.2) et de la calréticuline, cette dernière séquestrant dans le lumen du RE de grandes quantités de Ca2+. D’ailleurs, Bcl-2 peut interagir directement avec la SERCA et diminuer son activité, possiblement grâce à un changement de conformation de la SERCA (Dremina et al. , 2004). Plus récemment, Oakes et collaborateurs (2005) ont rapporté que les fuites de Ca2+du RE pouvaient être le résultat d’un état d’hyperphosphorylation de IP3R, une modification qui entraîne une augmentation la conductivité de ce canal envers le Ca2+. Bcl-2 peut interagir directement avec ce canal, et la liaison est augmentée en l’absence de Bax et Bak, suggérant que les membres de la famille Bcl-2 puissent contrôler les fuites de Ca2+du RE via la régulation du statut de phosphorylation de IP3R (Oakes et al. , 2005).

Il est cependant important de noter que la modulation à la baisse de la [Ca2+]REpar Bcl-2 demeure encore quelque peu controversée dû au fait que plusieurs études rapportent au contraire que Bcl-2 pourrait favoriser une augmentation de la [Ca2+]RE(voir la rétrospective de Distelhorst et Shore, 2004). Ces différences peuvent potentiellement s’expliquer par l’utilisation de lignées cellulaires différentes, des différences dans les niveaux d’expression de Bcl-2, ou l’utilisation de méthodologies pouvant altérer différents aspects de la physiologie cellulaire (Annis et al. , 2004; Distelhorst et Shore, 2004). Au-delà de ces différences, des expériences connexes non reliées à Bcl-2 tendent à favoriser la première hypothèse (soit une diminution de la [Ca2+]REpar Bcl-2). Ainsi, l’utilisation de la thapsigargine pour inhiber la SERCA au RE entraîne la sortie massive et rapide du Ca2+, et par le fait même induit rapidement la PCD. De même, des manipulations qui provoquent une augmentation de la [Ca2+]RE, comme la surexpression de la calréticuline ou de la SERCA, rendent les cellules plus susceptibles à des stress apoptotiques (Ma et al. , 1999; Nakamura et al. , 2000; Arnaudeau et al. , 2002). Finalement, l’un des antagonistes préféré de Bcl-2, soit la protéine pro-apoptotique Bax, produit au contraire de Bcl-2 une augmentation de la [Ca2+]RE. À ce sujet, les travaux de Scorrano et collaborateurs (2003) méritent d’être mentionnés plus en détails. En effet, ces auteurs ont déterminé que des fibroblastes dérivés d’embryons de souris knock-out pour les gènes bax et bak présentent une plus faible [Ca2+]REque chez leur équivalent sauvage. Conséquemment, ces cellules sont plus résistantes à de nombreux stress dont le mécanisme d’induction de la mort passe par l’augmentation de la [Ca2+]c(e.g. les second messagers lipidiques céramide et acide arachidonique, ou des stress oxydatifs). La surexpression de Bax ou de la pompe SERCA dans ces cellules knock-out permet de rétablir le niveau habituel de la [Ca2+]RE, mais lorsque Bax est spécifiquement dirigé à la mitochondrie, la [Ca2+]REne peut être rétablie, témoignant de l’importance de sa localisation pour l’exercice de ses fonctions. Sans entrer dans tous les détails, ajoutons toutefois que ces travaux ont permis non seulement de clarifier le rôle de Bax dans la régulation de la [Ca2+]RE, mais aussi de définir trois catégories de signaux apoptotiques en fonction de leur dépendance ou non envers le Ca2+ : 1) ceux (comme le stress oxydatif ou les second messagers lipidiques) nécessitant seulement le flux de Ca2+aux mitochondries (bien que Bax puisse amplifier cet effet via sa localisation mitochondriale); 2) ceux qui impliquent directement les mitochondries et dépendent de la participation de Bax mais pas de la participation du Ca2+(comme l’effet dirigé par la protéine pro-apoptotique Bid, qui doit interagir avec Bax à la mitochondrie pour exercer sa fonction létale); 3) et les signaux qui déclenchent à la fois les deux sentiers précédents, comme la staurosporine et l’étoposide (Scorrano et al. , 2003 et le commentaire de Demaurex et Distelhorst, 2003).

Certains membres pro- et anti-apoptotiques de la famille Bcl-2 exercent donc une partie de leurs activités au niveau du RE en modulant respectivement à la hausse ou à la baisse la [Ca2+]RE. Le niveau de Ca2+au RE influence en retour la quantité pouvant être relâchée par les canaux calciques en situation de stress; plus la quantité évacuée est importante, plus grands sont les risques de saturation au niveau des mitochondries, ces dernières tamponnant les excès de Ca2+ c. Un surplus soutenu de Ca2+dans les mitochondries entraîne l’ouverture du PTP et potentiellement l’induction de l’apoptose (voir la Figure 1-5).

D’autres protéines localisées au RE peuvent aussi avoir un effet pro- ou anti-apoptotique, en lien ou non avec la modulation de la [Ca2+]RE(voir les revues de Breckenridge et al. , 2003a; Annis et al. , 2004). Parmi celles-ci se trouve Bax inhibitor-1 ( BI-1 ), un gène originellement identifié chez l’humain grâce à la capacité de sa contrepartie protéique à inhiber la mort cellulaire induite par Bax chez Saccharomyces cerevisiae (Xu et Reed, 1998).Avant cette étude par l’équipe de Reed, le gène BI-1 était déjà reconnu sous le nom de TEGT ( testis enhanced gene transcript ), mais sa fonction n’avait pas été élucidée (Walter et al. , 1994; Walter et al. , 1995).Chez les levures S. cerevisiae et Schizosaccharomyces pombe , la surexpression de certaines protéines pro-apoptotiques telles que Bax ou Bak produit un phénotype létal qui peut être inhibé par la coexpression de membres anti-apoptotiques comme Bcl-2 ou Bcl- XL(Zha et al. , 1996; Ink et al. , 1997). C’est par le criblage d’une banque d’ADNc humain transformée dans une souche de S. cerevisiae exprimant Bax sous le contrôle d’un promoteur inductible que l’effet anti-Bax de BI-1 a été révélé.En plus de contrecarrer l’action létale de Bax dans la levure, BI-1 exerce le même effet dans des cellules humaines en culture, similairement à Bcl-2 (Xu et Reed, 1998). Il est maintenant connu que ce gène code pour une protéine anti-apoptotique conférant non seulement une protection contre la surexpression de Bax, mais aussi envers un certain nombre de stimuli apoptotiques (Xu et Reed, 1998). Ce gène est surexprimé dans plusieurs cas de tumeurs malignes (Walter et al. , 1994; Jean et al. , 1999; Welsh et al. , 2001; Schmits et al. , 2002; van 't Veer et al. , 2002; Villalva et al. , 2002; Grzmil et al. , 2003), l’étiquetant ainsi en tant que régulateur de la mort cellulaire potentiellement impliqué dans la dérégulation de l’apoptose dans les cellules tumorales (Hückelhoven, 2004).

BI-1 est une protéine membranaire intégrale contenant six ou sept domaines transmembranaires. Elle est localisée principalement au niveau du RE et de l’enveloppe nucléaire et en plus faible proportion dans les membranes mitochondriales. D’autre part, BI-1 ne contient aucun des domaines conservés BH et peut s’associer in vivo avec Bcl-2 et Bcl-XL, mais non avec Bax ou Bak (Xu et Reed, 1998). Il apparaît donc que BI-1 n’inhibe pas Bax directement mais intervient plutôt dans un sentier en amont ou en aval de Bax. Cette protéine est particulièrement intéressante non seulement à cause de sa localisation au RE, qui suggère un rôle dans la signalisation par le Ca2+, mais aussi à cause de sa conservation évolutive. En effet, des homologues végétaux (fonctionnellement équivalents à la protéine retrouvée chez les mammifères) ont été identifiés et caractérisés au cours des dernières années et certains domaines de la protéine sont même conservés chez les procaryotes (voir la revue récente de Hückelhoven, 2004). Le fait que cette protéine soit présente chez les végétaux, pourtant dépourvus de Bax (voir section 1.4.4) laisse supposer qu’elle pourrait faire partie d’un sentier de mort conservé dans l’évolution. Ce sentier pourrait potentiellement mettre en vedette le Ca2+et le RE, puisque l’équipe de Reed a démontré que BI-1 peut moduler la régulation du Ca2+au niveau du RE similairement à ce qui est observé lors de la surexpression de Bcl-2 ou en l’absence de Bax et Bak (voir section 1.3.5.3), c’est-à-dire que cette protéine contribue à diminuer la [Ca2+]RE(Chae et al. , 2004). Cet aspect sera abordé plus longuement au chapitre 5.

La PCD fait partie intégrante du mode de vie des végétaux et est ainsi essentielle au développement et à la survie au même titre que chez les mammifères, que ce soit au cours du développement normal ou pour faire face à des stress biotiques et abiotiques (Jones, 2001). L’effervescence dans ce domaine de recherche chez les animaux a lentement mais sûrement gagné l’intérêt des biologistes végétaux, de sorte que la PCD végétale reçoit maintenant l’intérêt qu’elle mérite. Cela n’a évidemment rien à voir avec la « ruée vers l’or » dont la PCD animale a été et est toujours l’objet, mais la PCD végétale constitue maintenant un champs de recherche de la biologie végétale. Au-delà de certaines visées nobles que sont l’élargissement des connaissances amenées par des recherches fondamentales (en particulier concernant l’évolution de la PCD chez les eucaryotes), cette recherche vise en particulier à améliorer notre capacité de réguler la mort chez les végétaux pour des applications en agriculture et dans l’industrie post-récolte (Lam et al. , 1999).

La section 1.4.1 présentera un survol de l’implication de la PCD dans la vie d’une plante, puis la section suivante (1.4.2) sera consacrée à la transduction de signal impliquée dans la PCD végétale. Finalement, la section 1.4.3 abordera brièvement la question de l’existence de caspases végétales avant de nous tourner vers les régulateurs potentiels de la PCD chez les plantes (section 1.4.4).

Chez les angiospermes, la PCD est essentielle à pratiquement toutes les étapes du développement, de la germination de la graine jusqu’à l’obtention d’une plante mature, sa fertilisation puis la formation et la maturation de graines par cette plante. Les différentes étapes du développement ayant recours à la PCD sont résumées à la Figure 1-6, alors que la Figure 1-7 présente les structures macroscopiques typiques des angiospermes afin de permettre au lecteur de s’y familiariser si nécessaire.

Les structures où se produit la PCD sont parfois illustrées en bleu, sauf dans la PCD associée à la reproduction sexuelle, où le bleu est associé aux structures mâles, et l’orange et le rouge aux structures femelles. Lors de la germination, l’aleurone (en bleu) ou les cotylédons fournissent l’énergie nécessaire au développement de l’embryon. Les TEs ( tracheary elements pour le transport de l’eau des racines aux feuilles) et la coiffe des racines (protection contre l’abrasion) sont des structures différenciées faites de cellules mortes ou en voie de l’être. Le méristème apical floral peut donner naissance aux primordia des étamines (mâles, région bleue) et du carpelle (femelle, zone orange). Chez la femelle (flèche orange), une mégaspore haploïde formera le gamétophyte alors que les trois autres meurent. Dans les anthères (mâle, flèche bleue), le tapetum dégénère pour compléter la formation du pollen et la mort du stomium en permet la dispersion. Au cours de la pollinisation, l’arrivée sur le pistil d’un pollen incompatible provoque la mort du tube pollinique. Au contraire, un pollen compatible entraîne la croissance du tube pollinique,dont le passage est facilité par la mort du tissu avoisinant (orange). Le tube pollinique entre dans l’ovule grâce à l’ouverture faite par la mort d’une des deux cellules qui l’entoure (rouge); suite à la fécondation, les cellules à l’opposé (orange) meurent aussi. La production de la graine implique la PCD massive de cellules de l’endosperme. Tout au long de leur vie (encadré du centre), les plantes utilisent aussi la PCD pour résister aux pathogènes (réponse hypersensible; HR) ou s’adapter au manque de nutriments ou d’oxygène. Consulter le texte pour d’autres détails. Tiré de Ouellet (2004) .

La plupart des angiospermes sont hermaphrodites, c’est-à-dire qu’elles produisent des fleurs portant à la fois les organes de reproduction mâles et femelles. Cependant, environ 10% sont plutôt unisexuées, c’est-à-dire porteuses des éléments mâles et femelles sur des fleurs différentes, et ce soit sur des plantes différentes (monoïques) ou sur la même plante (dioïques; revu par Wu et Cheung, 2000). Parmi les plantes monoïques bien connues figurent celles du genre Cannabis , alors que le maïs ( Zea mays ) constitue une plante dioïque chez laquelle les structures mâles sont situées à l’extrémité supérieure de la plante, tandis que les structures femelles sont réparties le long de la tige. Le concombre ( Cucumis sativus ) est un autre exemple agronomique répandu de plante dioïque. Or, chez certaines plantes comme le maïs, tous les méristèmes floraux produisent des primordia pour les structures des deux sexes, mais l’unisexualité survient par son élimination subséquente ou l’inhibition de sa différenciation. Dans les deux cas, l’avortement du primordium est précédé d’une vacuolisation de la cellule et de la perte de l’intégrité des organelles et du cytoplasme, suggérant une PCD de type autophagie (Cheng et al. , 1983). De plus, certaines phytohormones comme le GA, les brassinostéroïdes (Wu et Cheung, 2000) ou même les cytokinines (Young et al. , 2004a) pourraient être impliquées dans le processus (voir la revue de Khryanin, 2002). Tout comme plusieurs autres modèles de PCD végétale, celle-ci se trouve sous contrôle génétique (revu par Tanurdzic et Banks, 2004). Par exemple, le gène TS1 semble conférer au pistil une protection contre l’avortement dans l’inflorescence femelle, possiblement en interférant avec le gène TS2 , dont l’activité dans les cellules du pistil est nécessaire à son avortement (Calderon-Urrea et Dellaporta, 1999).

A) Structures florales principales telles que présentes chez le lys. Le pistil inclut également l’ovaire, qui est situé à sa base (non visible sur la photo) et qui contient les sacs embryonnaires. Le pistil est constitué des structures de reproduction femelles, alors que les étamines sont le pendant mâle, porteuses du pollen au niveau des anthères. Tiré du site web « http://www.aujardin.info/fiches/structure-fleur.php ». B) Papaver rhoeas . Les structures jaunes et orange (flèche bleue) sont les filets et anthères qui constituent les abondantes étamines typiques des pavots. Les traces jaunes sur les pétales (flèche verte) sont des grains de pollen tombés des anthères, alors que d’autres tentent leur chance sur le stigmate du pistil (la portion brune-noire au centre de la fleur, flèche blanche. Tiré de McClure (2004).

Dans les anthères (les structures de reproduction mâles, Figure 1-7), la production de grains de pollen fonctionnels et leur dispersion reposent sur la PCD du tapetum et du stomium, respectivement (revu par Wu et Cheung, 2000). Le tapetum est une assise (monocouche) de cellules entourant le tissu sporogène (i.e. les sacs polliniques), qui exerce une fonction nutritive pour le développement et la maturation des grains de pollen. À un stade spécifique de la maturation, les cellules du tapetum dégénèrent et meurent (voir la fin du paragraphe), contribuant ainsi à compléter la maturation du pollen en lui fournissant certaines molécules extracellulaires de nature protéique et lipidique importantes pour les interactions entre le pollen et le pistil au cours de la pollinisation. D’un point de vue morphologique, la dégénération du tapetum est associée entre autres à une forte vacuolisation du cytoplasme et à sa rétraction ainsi qu’à l’amincissement de la paroi cellulaire déjà peu développée, permettant la rupture éventuelle de ces cellules au profit du pollen (Bedinger, 1992).

D’autre part, l’ouverture du stomium est essentielle pour la dispersion du pollen. Le stomium consiste en une structure spécialisée se retrouvant en continuum avec l’épiderme, positionnée latéralement de chaque côté de l’anthère (voir Figure 1-6). La PCD au niveau des cellules du stomium permet la rupture de l’anthère et conséquemment l’ouverture des sacs polliniques, une étape indispensable pour le relâchement du pollen (revu par Wu et Cheung, 2000).

L’organe femelle de la plante doit également avoir recours à la PCD en de nombreuses occasions pendant son existence. Ainsi, la formation du gamétophyte, ou sac embryonnaire, débute typiquement au sein de l’ovaire par une mégaspore diploïde qui, suite à la méïose, donne naissance à quatre mégaspores haploïdes, dont trois meurent par PCD (Figure 1-6). La mégaspore restante entreprend ensuite trois rondes de mitose, accompagnées de fusion et migration nucléaire produisant le sac embryonnaire typique à sept cellules et huit noyaux (gamétophyte). Certaines de ces cellules, appelées synergides, sont positionnées de façon à bloquer l’entrée (micropyle) du sac embryonnaire, et l’une d’entre elles meure éventuellement par PCD pour permettre le passage du tube pollinique. D’autre part, à l’opposé du micropyle se trouvent les cellules antipodales, qui dégénèrent également après la fertilisation (revu par Wu et Cheung, 2000).

La fertilisation en question implique évidemment la rencontre d’un grain de pollen et de l’ovule. Or, ce dernier est bien encastré dans le sac embryonnaire, à la base du pistil (structure de reproduction femelle), alors que le réceptacle attitré du pollen est le stigmate, localisé à l’autre extrémité du pistil, les deux étant connectés par le style (Figures 1-6 et 1-7). Suivant la rencontre du grain de pollen et du stigmate, le pollen germe de façon à produire un tube pollinique qui pénètre le tissu stigmatique puis s’allonge à travers la matrice extracellulaire du style, dans un tissu particulier au centre du style appelé tissu de transmission. Le tube pollinique atteint éventuellement l’ovaire, puis l’entrée du sac embryonnaire où une cellule (synergide) se sacrifie pour le laisser entrer (voir ci-haut).

La croissance du tube pollinique s’accompagne de dégénération cellulaire dans le tissu de transmission (revu par Cheung, 1996; Wu et Cheung, 2000). En effet, les cellules de ce dernier deviennent très désorganisées et se remplissent d’une large vacuole, sans aucune présence visible de cytoplasme. D’autres cellules présentant un cytoplasme sont toutefois très déformées (Cheung, 1996; Wang et al. , 1996b) Cette désorganisation massive semble spécifique aux cellules du tissu de transmission, puisque les cellules avoisinantes du tissu cortical demeurent intactes. Elle génère suffisamment d’espace pour le passage du tube pollinique dans l’espace intercellulaire, qui se remplit également de matériel cytosolique relargué des cellules du tissu de transmission en dégénérescence. Ce matériel fournit un environnement accueillant pour le passage du tube pollinique, qui y retrouve un milieu physiquement propice mais aussi biochimiquement attrayant grâce à des facteurs de croissance et d’attraction (adhésion) qui lui permettent de se développer adéquatement jusqu’à l’ovaire et le sac embryonnaire (Cheung, 1996; Wang et al. , 1996b; Lord, 2000). En fait, ces facteurs semblent importants pour assurer l’élongation pollinique vers la bonne direction, ce qui ne peut être obtenue par culture in vitro (Cheung, 1996). Le sacrifice des cellules du tissu de transmission pourrait donc fournir les nutriments, le support mécanique et les indications directionnelles nécessaires à la croissance du tube pollinique. Il a également été suggéré que la mort de ces cellules empêche l’invasion de l’ovaire par des pathogènes (Wu et Cheung, 2000). Ce type de mort est hors de tout doute programmé puisque développemental, bien qu’aucune des caractéristiques typiques de la PCD n’aient été rapportées dans la littérature.

Il arrive souvent qu’un grain de pollen de l’anthère tombe sur le stigmate de la même fleur, et dépendamment des espèces, il existe un mécanisme qui permet de reconnaître le grain comme étant incompatible et ainsi empêche son développement jusqu’à l’ovaire. Il s’agit d’une réponse dite d’auto-incompatibilité ( self-incompatibility , SI), l’un des plus importants mécanismes de prévention de l’auto-croisement ( inbreeding ). La SI est contrôlée par un unique locus S multiallélique extrêmement polymorphique, portant des gènes de spécificité, l’un exprimé sur le pollen et l’autre sur le pistil, permettant au pistil de reconnaître le soi du non-soi, et de rejeter le soi en favorisant la mort du grain de pollen en germination (Rudd et Franklin-Tong, 2003; Kao et Tsukamoto, 2004). Certains résultats suggèrent que cette mort relève de la PCD, entre autres parce qu’elle implique la fragmentation de l’ADN nucléaire chez le pavot Papaver rhoeas (Jordan et al. , 2000). Cependant, comme la fragmentation a été détectée via une méthode de marquage in situ , il n’a pas été possible de déterminer si la dégradation était internucléosomale. Quoi qu’il en soit, d’autres caractéristiques typiques de la PCD ont été observées pour le même système, soit la sortie du cyt c des mitochondries et des activités caspase-like (caractéristiques qui seront abordées plus en détails à la section 1.4.3), démontrant des ressemblances étonnantes avec la PCD de type HR (Thomas et Franklin-Tong, 2004).

Les angiospermes sont divisées en deux catégories, soit les monocotylédones et les dicotylédones (Raven et al. , 1999). Comme leur nom l’indique, ces plantes, ou plutôt l’embryon contenu dans la graine, sont pourvues respectivement d’un seul ou de deux cotylédons. Les cotylédons représentent donc les feuilles de l’embryon. Chez les dicotylédones, ces deux feuilles constituent les réserves énergétiques de la jeune plantule, qui les utilisera pour assurer les premiers stades de son développement, en attendant la formation des premières « vraies feuilles » qui leur permettront, via la photosynthèse, d’être autonomes quant à leur source de carbone. L’intérieur de la graine est donc majoritairement rempli par les cotylédons.

Cependant, chez les monocotylédones, la feuille ne dispose que de peu de réserves, celles-ci étant majoritairement localisées dans l’endosperme. Celui-ci est constitué principalement de l’endosperme amylacé, très riche en amidon, et minoritairement d’une mince couche de cellules spécialisées appelée aleurone. La PCD fait partie intégrante du développement de ces deux types de tissus, bien que leur mort soit temporellement distinctes. Ainsi, au cours du processus de formation de la graine, l’endosperme amylacé meurt après que le grain ait terminé son emmagasinement énergétique ( grain filling ). Au contraire, les cellules de la couche de l’aleurone qui entoure l’endosperme demeurent bien vivantes dans la graine mature, et ce jusqu’à quelques jours après la germination. Voyons avec un peu plus de détails ces processus qui ont été relativement bien caractérisés chez les céréales telles que le maïs et le blé, en particulier dans les cellules de l’aleurone (voir les revues de Fath et al. , 2000; Young et Gallie, 2000).

La fonction de l’endosperme est de fournir l’embryon en nutriments au cours de la germination. Au cours du processus de maturation de la graine, la division cellulaire est d’abord très active, puis cesse pour faire place surtout à la synthèse protéique, lipidique et amylacée. La phase terminale de la maturation implique l’arrêt des processus biosynthétiques, l’induction de la dessiccation et finalement la dormance. De façon coordonnée avec le début de la phase terminale, la PCD est induite progressivement jusqu’à absorber tout le tissu, ne laissant que la couche de l’aleurone intacte. Il est intéressant de mentionner que chez le maïs, l’orchestration temporelle de la mort semble être en fonction de l’âge développemental des cellules, les premières cellules à mourir étant les plus vieilles, et les dernières étant celles adjacentes à la couche de l’aleurone, donc les plus jeunes. Il est évident que la régulation du programme de mort doit être très stricte, car une induction prématurée pourrait limiter la déposition de réserve et donc compromettre la germination, tel que révélé par l’existence de nombreux mutants (revu par Young et Gallie, 2000).

La régulation de la PCD dans l’endosperme est sous l’emprise de l’éthylène, une phytohormone très sollicitée par différentes formes de PCD végétales. En effet, la production d’éthylène se présente en deux phases au cours de la formation de la graine; la deuxième phase coïncide avec une augmentation d’activités nucléases et la détection de la fragmentation internucléosomale de l’ADN nucléaire, qui surviennent vers la fin de la phase terminale. L’application exogène d’éthylène au cours du développement de la graine contribue également à accélérer l’induction et l’intensité de la PCD, qui est alors accompagnée d’une fragmentation de l’ADN encore plus prononcée. Au contraire, l’application d’inhibiteurs de la synthèse de l’éthylène ou de sa perception réduit la mort cellulaire et la fragmentation de l’ADN. Des mutants ont révélé l’importance de l’éthylène ou de d’autres facteurs qui affectent la production ou la perception de l’éthylène dans la régulation de la PCD (voir entre autres Gallie et Young, 2004). En outre, une autre phytohormone, l’acide abcissique (ABA), régule négativement la production d’éthylène (revu par Young et Gallie, 2000).

Outre la dégénérescence des cellules constituant l’endosperme, la formation de l’embryon nécessite elle aussi de la PCD pour mener à terme le développement des graines. Par exemple, les cellules du suspenseur supportent les premières étapes du développement embryonnaire en fournissant nutriments et régulateurs de croissance. Le suspenseur agit véritablement en tant que conduit pour le transport des nutriments et aide l’embryon dans l’établissement et le maintien de sa polarité (tige vs racine) (revu par Jones et Dangl, 1996; Buckner et al. , 1998). Lorsque l’embryon atteint le « stade cœur », le suspenseur n’est plus nécessaire et dégénère par PCD, dont la description morphologique rappelle étrangement l’autophagie (Jones et Dangl, 1996). Il est d’ailleurs fort probable que la dégénérescence du suspenseur ait effectivement recours à l’autophagie, puisqu’il semble que ces cellules développent des organelles spécialisées contenant des activités hydrolytiques, et ce bien avant les premiers signes de dégénérescence (Jones et Dangl, 1996). Cependant, ce n’est que récemment que la fragmentation de l’ADN des cellules du suspenseur a été rapportée, de même que celle de d’autres structures temporaires de l’embryon (Giuliani et al. , 2002).

Comme nous l’avons souligné plus haut (1.4.1.4.1), les cellules de la couche de l’aleurone sont bien vivantes dans la graine mature, car elles ont un rôle actif à jouer au cours de la germination. En effet, ces cellules synthétisent et sécrètent des enzymes hydrolytiques qui dégradent les réserves de l’endosperme amylacé au profit de l’embryon en développement. À la fin de leur mandat, ces cellules exécutent un programme de mort pouvant être décrit comme de l’autodigestion, afin de contribuer une dernière fois à la croissance de l’embryon via le sacrifice de leurs propres constituants (revu par Fath et al. , 2000; Fath et al. , 2001). Chez la plupart des céréales, la couche de l’aleurone entoure l’endosperme et n’est constituée que d’une seule assise de cellules, dont le cytoplasme est constitué principalement de vacuoles d’entreposage des protéines ( protein storage vacuoles ; PSV). Ces vacuoles, qui sont dérivées du RE, constituent un entrepôt pour les réserves en acides aminés nécessaires à la synthèse des enzymes hydrolytiques, mais aussi des hydrates de carbones non amylacés ainsi que des minéraux.

Comme dans le cas de l’endosperme amylacé, le sort des cellules de l’aleurone dépend de l’action de phytohormones, soit l’acide gibbérellique (GA) et l’ABA. Suite à l’initiation de la germination par l’imbibition (absorption d’eau), l’embryon produit le GA, qui stimule les cellules de l’aleurone à synthétiser des hydrolases (surtout desα-amylases) et à les sécréter vers l’endosperme amylacé. Toutes ces enzymes sont synthétisées de novo suite à l’hydrolyse des protéines de réserve des PSV, qui fusionnent et éventuellement forment une seule grande vacuole hydrolytique. Certaines des enzymes synthétisées sont donc confinées aux PSV devenues, sous l’action du GA, des organelles hydrolytiques. Au bout d’un certain temps, la sécrétion des hydrolases cesse, coïncidant avec les premières observations de cellules mortes. Au contraire, l’ABA agit en tant qu’antagoniste du GA et ainsi prévient la synthèse d’hydrolases et la PCD (Fath et al. , 2001).

La morphologie associée à la PCD des cellules de l’aleurone ressemble à celle retrouvée dans le cas de l’autophagie, soit le confinement du cytoplasme à une zone étroite entre la membrane plasmique et la vacuole. Les autres organelles, réduites en nombre, s’accumulent autour du noyau. La mort en tant que telle semble aléatoire, survenant brusquement suite à la perte de l’intégrité de la membrane plasmique, qui est rapidement suivie du rétrécissement du corps cellulaire (Fath et al. , 2001). Les données concernant la dégradation de l’ADN indiquent qu’il serait bel et bien dégradé, mais l’échelle apoptotique représentative de la dégradation internucléosomale n’aurait pas été détectée (Bethke et al. , 1999; Fath et al. , 1999; Fath et al. , 2001).

Bien que les cellules de l’aleurone puissent sembler mourir dû à l’épuisement des ressources de la cellule survenant suite à une intense production d’hydrolases, différentes expérimentations mettant en vedette l’ABA ont permis de découpler la mort de la synthèse d’enzymes. En effet, non seulement l’ABA retarde dramatiquement la PCD des cellules de l’aleurone non stimulées par le GA, mais elle peut également retarder la mort de cellules pré-stimulées, bien que la synthèse d’hydrolases ne soit pas inhibée (Fath et al. , 2000; Fath et al. , 2001). De nombreux indices suggèrent que les ROS (dont il sera question à la section 1.4.2.1) seraient les grands responsables de l’exécution de la PCD. Ainsi, les cellules incubées dans le GA sont plus sensibles à l’induction de la PCD par le H2O2que celles incubées dans l’ABA (Bethke et Jones, 2001; Fath et al. , 2001). Cette sensibilité serait possiblement due à une faible expression des enzymes métabolisant les ROS, telles que la catalase, l’ascorbate peroxidase et la superoxidedismutase, qui sont au contraire fortement exprimées dans les cellules de l’aleurone incubées dans l’ABA (Fath et al. , 2002).

La racine en croissance doit parfois faire face à des conditions environnementales qui n’ont rien à voir avec les géloses douces et humides de nos laboratoires. La nature faisant bien les choses, elle a pourvu le système racinaire de structures de protection et de mécanismes d’adaptation qui lui sont propres. À l’extrémité apicale de la racine, la coiffe qui la recouvre est en quelque sorte une gaine cellulaire lui assurant protection et souplesse. En effet, les cellules de la coiffe sont constamment produites par le méristème apical, de sorte qu’elles sont continuellement déplacées en périphérie, où elles finissent par mourir et se désintégrer suite à l’abrasion par le sol. Le contenu cellulaire ainsi libéré dans l’environnement de la coiffe contribue à enrichir le mucilage recouvrant l’extrémité de la racine. Ce mucilage contribue à diminuer la friction entre la racine et le sol (Buckner et al. , 1998; Raven et al. , 1999).

Les racines qui se développent dans l’eau présentent aussi de la mortalité, de sorte que l’on ne peut pas argumenter que les cellules de la coiffe meurent dû à la friction pendant la pénétration dans le sol (Pennell et Lamb, 1997). Les cellules en périphérie de la coiffe sont hautement vacuolisées, présentant des signes d’autophagie (observations personnelles), et l’on observe également de la fragmentation de l’ADN nucléaire par des méthodes de marquage in situ (TUNEL) dans la coiffe de racines d’oignon (Wang et al. , 1996a) et de maïs (L. Brisson et al ., résultats non publiés). L’ensemble de ces observations porte à croire que les cellules de la coiffe meurent par PCD.

Les racines peuvent également activer la PCD dans certaines de leurs cellules lorsqu’elles se trouvent en hypoxie, comme par exemple lorsque le sol est très compact, se retrouvant alors dans l’incapacité de se procurer dans leur environnement immédiat l’oxygène dont elles ont besoin. Ce phénomène est la formation de l’aérenchyme, générant un tissu poreux (voir Figure 1-8) dont la fonction est de faciliter le transport de l’oxygène de la tige vers les cellules des racines, mais aussi de réduire le nombre de cellules consommant le précieux gaz. Ce phénomène est très courant chez les plantes exposées à des inondations fréquentes et il est constitutif chez certaines comme le riz, dont les racines sont toujours en hypoxie (Drew et al. , 2000).

L’hypoxie stimule la synthèse de la phytohormone éthylène et certains gènes de la famille des ACC synthétases (enzymes impliquées dans la synthèse de l’éthylène) sont spécifiquement induits par une déficience en oxygène. Des inhibiteurs de l’action ou de la synthèse de l’éthylène bloquent la formation de l’aérenchyme en hypoxie. De plus, la formation de l’aérenchyme peut être induite en milieu bien oxygéné par une privation transitoire en azote ou en phosphore. Ce processus est aussi dépendant de l’éthylène, mais ne requiert pas d’augmentation de la production mais plutôt une augmentation de la sensibilité envers l’éthylène. Toutes ces données pointent en faveur de l’éthylène comme inducteur de la PCD dans la formation de l’aérenchyme, qui passerait par une transduction de signal impliquant les protéines G, une modulation du [Ca2+]cytet des protéines phosphatases (revu par Drew et al. , 2000). De plus, la rupture de la vacuole serait un événement précoce dans ce type de PCD (Campbell et Drew, 1983), rappelant le cas des tissus vasculaires (voir section suivante).

A) Dans les racines de maïs en hypoxie, certaines cellules meurent pour former l’aérenchyme, des cavités (grandes zones noires) facilitant l’apport d’oxygène aux cellules restantes. La barre vaut 0,1 mm (tiré de Drew et al. , 2000). B) Les éléments conducteurs (TE) du xylème sont en fait des cellules mortes dont la paroi secondaire est renforcie. Il s’agit ici de la tige chez Zinnia (tiré de Roberts et McCann, 2000).

La xylogenèse (formation du xylème) représente l’une des formes les plus dramatiques de la PCD végétale, mais figure aussi parmi les mieux caractérisées. Le xylème est un tissu complexe servant au transport de l’eau et des minéraux à travers la plante. Il est constitué essentiellement de cellules mortes (voir Figure 1-8) associées bout à bout de façon à former de longs tuyaux vides. Ces cellules peuvent être des trachéides ou des éléments de vaisseau et sont regroupées sous l’appellation générale de vaisseaux ou éléments conducteurs, mais nous utiliserons l’appellation anglaise tracheary elements (TE) pour plus de commodité. Les cellules destinées à former les futurs TE entreprennent une différenciation dépendant entre autres de plusieurs phytohormones (auxines, cytokinines et brassinostéroïdes) et au cours de laquelle elles synthétisent une paroi secondaire qui assurera la rigidité nécessaire pour supporter la très forte pression que l’on retrouve dans ces conduits. La dernière étape du processus de différenciation est la PCD, qui permet l’élimination du contenu cellulaire. La PCD dans les TE semble intimement reliée à la formation de la paroi secondaire, puisque jusqu’à présent, aucun agent ou mutation n’a permis d’inhiber la PCD sans affecter la formation de cette paroi, et vice versa (voir les revues de Fukuda, 2000, 2004). Cette forme de PCD est spéciale et semble à peu près unique chez les végétaux et la forme qui semble le plus s’en rapprocher est la formation de l’aérenchyme (section 1.4.1.5), abstraction faite de la formation de la paroi secondaire.

L’étude de ce type de PCD a beaucoup profité du développement d’un modèle in vitro permettant la transdifférenciation en TE à partir de cellules isolées du mésophile foliaire, et ce sans division cellulaire (Fukuda et Komamine, 1980b, a). Tel que présenté à la Figure 1-9, le processus de différenciation entraîne la synthèse et l’accumulation dans la vacuole d’enzymes hydrolytiques dont les activités sont optimales en conditions acides. Notons des cystéine et sérine protéases, des RNases, des nucléases ( S1-type , exprimées spécifiquement dans cette forme de PCD), des phosphatases acides et des lipases (Demura et al. , 2002; Fukuda, 2004). La vacuole prend alors de l’expansion et se transforme en compartiment à activité lytique très élevée, un peu comme le sont les lysosomes animaux. L’autolyse dans les TE, qui débute par la rupture de la vacuole, est extrêmement rapide; la dégradation de l’ADN nucléaire et chloroplastique est complétée en moins de 15 minutes et l’ensemble de la digestion est terminée en moins de 6 h (Obara et al. , 2001; Fukuda, 2004). Un fait intéressant à souligner est l’ordre dans lequel les organites sont dégradés. En effet, tel que mentionné précédemment, la vacuole est le premier organite à montrer des signes de dégénération, puis les organites à membrane simple (RE et Golgi) gonflent avant de disparaître. Peu de temps après vient le tour des organites à double membrane, la dégénération commençant par leur matrice avant d’atteindre les membranes (Groover et Jones, 1997).

Dans les TEs en formation, des enzymes hydrolytiques spécifiquement exprimées pendant la PCD (telles que la S1-nucléase ZEN1 , la RNase ZRNase1 et la cystéine protéase ZCP4 ) s’accumulent dans la vacuole (I). Celle-ci prend de l’expansion jusqu’à ce qu’elle éclate et les enzymes ainsi libérées procèdent à l’autolyse du contenu cytoplasmique (II). Finalement, la perforation de la paroi mène à la perte du contenu cellulaire, ne laissant que la paroi renforcie (III). Tiré de Fukuda (2004).

La sénescence est probablement l’une des manifestations les plus évidentes de la PCD végétale. Par exemple, après la pollinisation, les pétales ne sont plus nécessaires et entament rapidement un programme de sénescence (Rubinstein, 2000). Ce phénomène peut être particulièrement drastique chez les monocotylédones de la famille des orchidées, comme par exemple chez les représentants du genre Phalaenopsis , qui sont très populaires entre autres dû au fait que leurs fleurs peuvent vivre jusqu’à trois mois. Or, leurs pétales commencent à mourir moins d’un jour après la pollinisation. De son côté, la sénescence foliaire se remarque assez facilement par le jaunissement des feuilles, le plus souvent les plus vieilles à la base de la plante. Certaines plantes, surtout des annuelles comme par exemple les plantes fourragères, sénescent entièrement à la fin de leur cycle de vie, consacrant toute leur énergie à la production de leurs graines (Noodén et al. , 1997). La sénescence est donc une forme de PCD particulière puisque le recyclage des nutriments y est un facteur fondamental. De plus, elle n’affecte pas seulement un petit groupe de cellules mais plutôt un organe complet (et dans certains cas l’organisme entier à l’exception des graines). Cette PCD permet non seulement le recyclage des nutriments mais également l’élimination d’un organe puits (voir paragraphe suivant), de sorte que l’on peut considérer que la plante fait des économies énergétiques tout en récupérant des matériaux de construction. Il est à noter que certains auteurs ont établi une distinction entre les étapes de recyclage et la mort en tant que tel (voir le commentaire de van Doorn et Woltering, 2004). Ainsi, sous prétexte que les premières phases sont réversibles, elles se sont vues associées à la sénescence et le terme PCD a été confiné aux dernières étapes, à partir du point de non-retour. Or, dans la nature, il est plutôt rare que le processus retourne en arrière et la décision d’en arriver ultimement à la PCD a été prise bien avant que ne commence le processus de mobilisation des nutriments (les premières étapes réversibles). Nous préférons donc, en accord avec van Doorn et Woltering (2004), associer la PCD à l’ensemble du processus de sénescence, et ce tout au long de cet ouvrage.

Les feuilles sont des organes spécialisés dans la photosynthèse et la plante investit beaucoup d’énergie et de nutriments dans leur production initiale (Quirino et al. , 2000). Les feuilles peuvent même être considérées comme une forme d’entreposage de l’azote, disponible en quantité limitée dans le sol, en vue des besoins futurs (Chandlee, 2001). Après une période de productivité où la feuille est une source d’énergie, sa contribution en photosynthétats diminue éventuellement, jusqu’au point où la feuille devient plutôt un puits, ne produisant même plus assez d’énergie pour se suffire à elle-même (la relation source-puits entre les différents organes de la plante est un concept fondamental en physiologie végétale; voir Raven et al., 1999). Elle entreprend alors la dernière étape de son développement, la sénescence. Au cours de ce lent processus de démantèlement, les nutriments comme l’azote, le phosphore et différents minéraux qui avaient été initialement investis dans la feuille sont recyclés vers d’autres organes en développement, tels que les jeunes feuilles, les fleurs, les graines en développement, ou sont entreposés dans des rhizomes ou tubercules en vue de la prochaine saison de croissance (Quirino et al. , 2000).

Au niveau macroscopique, la sénescence est caractérisée par le jaunissement (résultant de la perte de la chlorophylle) qui culmine avec le dessèchement complet et souvent l’abscission de la feuille. Au niveau cellulaire, le démantèlement est exécuté dans un ordre très précis (Butler et Simon, 1971). Les chloroplastes sont les premières cibles, ce qui n’est pas étonnant considérant que la majeure partie des protéines foliaires y est accumulée et que ces organelles ne sont plus nécessaires au fonctionnement cellulaire. Le noyau, requis pour la transcription des gènes nécessaires à l’exécution de la sénescence (par exemple des protéases, des RNases et des glutamine synthétases), et les mitochondries, essentielles pour la production de l’énergie requise au processus, sont naturellement les derniers éléments affectés (voir les revues de Butler et Simon, 1971; Quirino et al. , 2000; Yoshida, 2003). Les données relatives à la dégradation de l’ADN pendant la sénescence sont peu nombreuses et contradictoires, une étude rapportant de la dégradation au niveau internucléosomal (Yen et Yang, 1998) et l’autre pas (Lee et Chen, 2002). Des études de la sénescence florale ont toutefois rapporté l’occurrence de la fragmentation de l’ADN (Orzaez et Granell, 1997; Rubinstein, 2000; Yamada et al. , 2003). La sénescence peut également être observée dans des cultures in vitro de cellules végétales lorsqu’elles atteignent la phase stationnaire. Ainsi, la sénescence peut être induite autant in vitro que chez des plantes entières par une carence en nutriments (comme l’azote ou le carbone; voir Aubert et al. , 1996; Moriyasu et Ohsumi, 1996).

La vacuolisation du cytoplasme est immanquable dans ce processus, qui relève définitivement de l’autophagie (Butler et Simon, 1971; Lee et Chen, 2002). D’ailleurs, l’autophagie chez les végétaux relève des gènes ATG , conservés entre les plantes, les animaux et la levure (Yoshimoto et al. , 2004). L’analyse phénotypique de mutants d’ Arabidopsis chez lesquels un gène ATG est inactivé par l’insertion d’un T-DNA a révélé que l’autophagie est requise pour l’établissement de la sénescence et un recyclage efficace des nutriments, mis en évidence entre autres par une sénescence plus rapide accompagnée d’une plus faible production de graines, particulièrement lorsque les nutriments se font rares (Hanaoka et al. , 2002; Doelling et al. , 2002). Il est probable que l’autophagie, par le recyclage des nutriments qu’elle confère, aide à la survie en conditions de disette.

L’initiation et la progression de la sénescence peuvent donc être influencées par différents facteurs externes et internes. Les facteurs internes concernent essentiellement la balance hormonale. Il est bien connu que le niveau de cytokinines diminue pendant la sénescence, et une application exogène peut la retarder (Mok, 1994; Raven et al. , 1999). Au contraire, l’éthylène favorise la sénescence et l’application d’inhibiteurs de la synthèse de l’éthylène la retarde (Chandlee, 2001; Young et al. , 2004b). En fait, il semblerait que la majorité des phytohormones puissent jouer un rôle dans la sénescence, y compris l’acide jasmonique (AJ) et l’ABA, mais ces rôles n’ont pas été clairement définis. Par exemple, des mutants ayant une déficience dans le sentier de signalisation de l’acide salicylique (AS) ne semblent pas exécuter le processus de mort aussi efficacement que les plantes sauvages, leurs feuilles demeurant jaunes sans devenir nécrotiques (Buchanan-Wollaston et al. , 2003). Parmi les facteurs externes pouvant affecter la sénescence, notons la température, l’humidité, les infections microbiennes, l’intensité lumineuse et bien sûr la disponibilité en minéraux (Chandlee, 2001).

Un grand nombre de gènes voient leur expression favorisée pendant la sénescence et sont ainsi affublés du titre de senescence-associated genes ( SAG ). De façon générale, ils codent pour des protéines pourvues d’activité catabolique et impliquées dans la remobilisation des nutriments ou sont associées au stress ou à la synthèse hormonale (en particulier l’éthylène). Ainsi, outre des protéases et des RNases, on retrouve entre autres la phospholipase D, probablement impliquée dans la dégradation des membranes cellulaires et en particulier celles des thylakoïdes, retrouvées en abondance dans les chloroplastes. De même, l’expression de superoxyde dismutases et de catalases a certainement pour objectif de minimiser les stress associés à la production de ROS au cours du processus de dégradation. L’expression de protéines de défense PR (voir section 1.4.1.8), habituellement associées spécifiquement à l’attaque par des pathogènes, pourrait également s’inscrire dans un dernier effort de protection afin d’assurer la survie de ces cellules jusqu’à ce que tous les nutriments aient été récupérés (voir à ce sujet le paragraphe suivant). Il est à noter que plusieurs protéines codées par les SAG n’ont pas de fonction connue et la plupart ne sont pas nécessairement spécifiques à la sénescence, mais sont aussi exprimées à d’autres stades du développement foliaire (Chandlee, 2001).

La HR est habituellement définie comme « la mort rapide des cellules végétales en association avec la restriction de la croissance du pathogène » (Goodman et Novacky, 1994, cité dans Heath, 2000a). Elle survient donc lors de l’invasion par un pathogène et est étroitement associée à la réaction de défense (RD) de la plante. La RD consiste en l’activation de plusieurs lignes de défense visant l’arrêt de la propagation du pathogène, entre autres via la mort d’un petit groupe de cellules formant une zone de nécrose à la superficie plus ou moins grande, selon le cas (Heath, 2000b). Outre l’activation de la HR, la RD implique également d’autres mécanismes de défense. Par exemple, la déposition de callose, l’incrustation de lignine et de subérine et l’infiltration de composés phénoliques dans la paroi cellulaire contribuent à son renforcement et ainsi diminuent la pénétration du pathogène, la diffusion de toxines ou l’action d’enzymes microbiennes. Au niveau du cytosol, la synthèse de phytoalexines (des composés antimicrobiens issus du métabolisme secondaire) et de protéines associées à la pathogenèse ( pathogenesis-related , PR), dont certaines ont des activités enzymatiques anti-fongiques (chitinases, β-1,3-glucanases) susceptibles de dégrader les composés majeurs de la plupart des champignons pathogènes, font aussi partie de l’arsenal défensif (Benhamou et Picard, 2000).

La HR joue un rôle particulièrement important dans le cas des pathogènes biotrophes, c’est-à-dire qui ont obligatoirement besoin d’une cellule vivante pour se multiplier, dont les virus sont un exemple évident (par opposition aux pathogènes nécrotrophes, habituellement des champignons, qui ont besoin d’un tissu mort pour compléter leur cycle de reproduction). En effet, l’induction de la mort de la cellule hôte empêche le pathogène de se multiplier puis d’envahir les cellules avoisinantes. Cependant, il existe aussi plusieurs cas documentés où l’activation de la HR n’empêche pas la progression du pathogène et d’autres cas où le pathogène est arrêté sans qu’il y ait trace de HR (revu par Heath, 2000a; Greenberg et Yao, 2004). Il y a donc des cas où l’ « association avec la restriction de la croissance du pathogène » est fausse.

Dans plusieurs cas où la HR est déclenchée par la reconnaissance d’un agent pathogène particulier, nous avons affaire à ce que l’on appelle une interaction « gène-pour-gène » (revu par Heath, 2000a; Gomez-Gomez, 2004). Cet événement nécessite la présence chez le pathogène d’un caractère de virulence spécifique, le produit d’un gène d’avirulence ( Avr ), et chez la plante une allèle spécifique d’un gène de résistance ( R ). Il a été assumé pendant longtemps que les gènes R codaient des récepteurs des produits des gènes Avr , dans un modèle où il n’y aurait qu’un seul gène impliqué autant du coté de l’agresseur que du défendeur. Cependant, ce modèle a été récemment remis en question, considérant le fait que très peu de cas où il y a une interaction directe ont pu être identifiés (revu par Gomez-Gomez, 2004). De même, les gènes Avr codent des facteurs de virulence permettant à l’agent infectieux une pathogénécité maximale en labsence du gène R chez la plante. Or, les gènes Avr sont très peu conservés, alors que les produits des gènes R sont limités à quelques motifs protéiques (dont certains sont conservés chez les mammifères, voir section 1.4.4.1). L’hypothèse du « gardien » a donc été proposée, où les protéines R seraient impliquées dans la surveillance d’un nombre limité de composants cellulaires constituant les cibles des protéines Avr. Cette hypothèse expliquerait la diversité des gènes Avr et la conservation des gènes R (Gomez-Gomez, 2004). Il est à noter que la RD, et parfois la HR, peuvent aussi être déclenchées par des éliciteurs non spécifiques tels que des oligosaccharides (fragments de la paroi du pathogène), des protéines ou des phospholipides en provenance du microorganisme pathogène, ou des oligogalacturonides libérés de la paroi végétale sous l’action de pectinases fongiques et qui sont reconnus par des récepteurs membranaires (Benhamou et Picard, 2000; Gomez-Gomez, 2004). Cependant, la résistance non spécifique qui en découle ( nonhost resistance ) a lieu le plus souvent en l’absence de mort cellulaire, donc sans avoir recours à la HR (Heath, 2000b).

Du point de vue morphologique, la HR est associée à la vacuolisation, la condensation et la désorganisation du cytoplasme (Roebuck et al. , 1978; Bestwick et al. , 1995; Mittler et al. , 1997). Le confinement du pathogène nécessite une mort cellulaire extrêmement rapide, de sorte que contrairement à la sénescence, le recyclage du contenu cellulaire ne semble pas être une préoccupation. Cependant, le sort des organelles semble variable, puisque qu’une étude a rapporté le gonflement des mitochondries et la perte des structures membranaires internes, mais des chloroplastes intacts (Bestwick et al. , 1995), alors que l’autre a rapporté la perte d’intégrité des chloroplastes (qui accumulaient du matériel dense) mais la préservation des mitochondries (Mittler et al. , 1997). Il se peut que ces différentes observations soient dues à des réponses envers des pathogènes différents (bactérie vs virus, respectivement). Dans tous les cas, le protoplasme se rétracte éventuellement et ne devient qu’une masse membranaire au contenu indiscernable, rappelant un peu les corps cellulaires retrouvés dans l’apoptose animale (Pennell et Lamb, 1997). La paroi cellulaire s’effondre également (Pennell et Lamb, 1997), possiblement suite à la déshydratation de son contenu et la pression exercée par l’expansion des cellules avoisinantes. Certaines études ont également rapporté la fragmentation internucléosomale de l’ADN nucléaire (Ryerson et Heath, 1996; Wang et al. , 1996a; Tada et al. , 2001), alors que d’autres n’ont détecté que la fragmentation en gros fragments entre 50 et 300 kb (Levine et al. , 1996; Mittler et al. , 1997).

L’action de la phytohormone acide salicylique (AS) dans l’établissement de la HR et des RD est à la fois bien connue et ambiguë. En effet, dans les tissus de tabac infectés par le virus de la mosaïque du tabac ( tobacco mosaïc virus , TMV) et accumulant l’AS, on retrouve un gradient d’AS où la concentration la plus élevée est au niveau de la lésion et dans son environnement immédiat (Enyedi et al. , 1992). Il a donc été suggéré que l’AS pourrait réguler la taille des lésions à faible dose, et induire la PCD à forte dose. Nous en discuterons plus longuement à la section 1.4.2.2.

Outre les exemples de PCD dans le développement normal de la plante et la HR induite en présence de pathogènes (stress biotiques), la PCD peut aussi être induite par des stress environnementaux (abiotiques). Nous avons déjà vu le cas à la section 1.4.1.5 de la formation de l’aérenchyme racinaire en conditions d’hypoxie. L’ozone (O3) peut également être particulièrement nocif, et dépendamment de sa concentration et de la durée de l’exposition, il peut induire des chloroses et la sénescence prématurée (expositions chroniques à de faibles doses) ou des lésions nécrotiques rappelant étrangement la HR (expositions ponctuelles à fortes doses). Ce type de PCD semble être causée par la génération de ROS à partir de l’O3au contact des membranes cellulaires (Rao et al. , 2000). En fait, la plupart si ce n’est tous les stress abiotiques (mais aussi biotiques) comme des extrêmes de chaleurs, de froid, ou de salinité impliquent les ROS et nous en traiterons plus en détail à la section 1.4.2.1.

L’étude de la PCD a grandement profité de l’utilisation de systèmes de culture cellulaire in vitro pour clarifier certains aspects qui auraient été carrément impossibles en utilisant le contexte naturel de la plante. Par exemple, le développement d’un système in vitro efficace pour l’étude de la différenciation des TE il y a plus de 20 ans (Fukuda et Komamine, 1980b, a) a permis de faire de cette forme de PCD végétale l’une des mieux caractérisée, l’amenant même au rang de paradigme (Fukuda, 2000). De même, les cellules de la couche de l’aleurone peuvent être isolées sous forme de protoplastes et ainsi soumises à différents traitements hormonaux ou chimiques pour étudier le cours de la PCD (Wang et al. , 1996c; Fath et al. , 2002). Il va de soi que la pertinence d’utiliser un système in vitro dépend de sa capacité à réfléter les mécanismes de mort ayant lieu in vivo . Puisque la PCD, peu importe sa forme, utilise apparemment des mécanismes de base de la machinerie cellulaire, l’activation de la PCD in vitro partage nécessairement des similarités fondamentales avec la mort ayant cours in vivo (McCabe et Leaver, 2000).

L’utilisation de cultures cellulaires peut être avantageuse à différents points de vue (voir à ce sujet l’excellente revue de McCabe et Leaver, 2000), et ce particulièrement pour l’étude de la PCD. Ainsi, ces cultures représentent une collection de cellules relativement uniformes, en division rapide et continuelle. Certaines lignées (i.e. N. tabacum cv. BY-2) peuvent même être synchronisées pour procéder à des études reliées au cycle cellulaire. L’obtention de quantités importantes de cellules en peu de temps est aussi grandement favorisée, particulièrement dans le cas de l’étude de la PCD d’un point de vue biochimique, où le matériel vivant est souvent condamné à mourir en peu de temps. De plus, il est facile et rapide de déterminer de façon quantitative (et pas seulement qualitative) la croissance, la viabilité et l’aspect morphologique des cellules cultivées en flacon, et ce sur une période de temps plus ou moins longue. Ce sont encore là des paramètres très importants à surveiller pour les études portant sur la PCD ou les réponses aux stress. Faut-il mentionner que l’induction de la PCD dans les cultures cellulaires se fait de façon relativement uniforme, de sorte que l’on obtient facilement un grand nombre de cellules exécutant à peu près en même temps leur programme de mort. Finalement, considérant le fait que les suspensions cellulaires sont généralement constituées de cellules indifférenciées et sans organisation spécifique (contrairement à ce que l’on retrouve dans les tissus), elles représentent un niveau de complexité moindre, d’autant plus que l’on peut contrôler avec précision l’environnement de la cellule.

Les cultures cellulaires ont donc été utilisées pour disséquer un grand nombre de réponses cellulaires basales envers différents stimuli ou stress. Par exemple, il est possible d’induire une PCD qui est certainement proche de la HR en utilisant seulement des éliciteurs ou toxines bactériens ou fongiques, ou carrément en cultivant les cellules en présence du pathogène (McCabe et Leaver, 2000). L’implication des ROS dans la PCD végétale a été beaucoup étudiée avec des systèmes in vitro , de même que le rôle de la signalisation par le Ca2+, et une proportion importante des travaux auxquels nous référerons dans la section qui suit ont été effectués avec des systèmes in vitro .

Comme nous avons pu le constater au cours de notre survol de la PCD végétale, les phytohormones mais aussi les ROS ont un rôle à jouer dans toutes les formes de PCD développementale ou en réponse aux stress. En fait, une bouffée ou émission de ROS, communément appelée oxydative burst , est une réponse commune à la majorité des stress biotiques et abiotiques (Overmyer et al. , 2003). De même, les ROS jouent un rôle dans la plupart des cas de PCD développementale. Bien que les ROS aient été longtemps considérés comme des sous-produits toxiques du métabolisme cellulaire, il est maintenant reconnu qu’ils jouent un rôle important dans la signalisation d’un grand nombre de systèmes biologiques (Hoeberichts et Woltering, 2003). L’induction de flux ioniques, en particulier le Ca2+, à travers la membrane plasmique, est directement impliquée dans l’induction de la bouffée de ROS. En fait, la plupart des cas de PCD développementale ou induite présentent des flux de Ca2+en amont de la cascade de signalisation menant à la PCD, collaborant ainsi avec les phytohormones et les ROS (Hoeberichts et Woltering, 2003; Overmyer et al. , 2003). Dans cette section, nous tenterons de dresser le portrait de ces événements précoces de signalisation menant à l’induction de la PCD, en tentant de mettre en évidence les liens entre ces événements. Nous verrons d’abord comment ces fameux ROS, qui font tant couler d’encre, sont générés et métabolisés chez les végétaux. Les phytohormones étant critiques dans la prise de décision menant à la PCD, nous continuerons avec un portrait de leurs modes d’actions, en particulier celles impliquées dans la HR ou des réponses de type HR (puisque cette forme de PCD a été particulièrement étudiée et est donc mieux caractérisée), et ce en relation avec leur action sur la production ou l’accumulation de ROS, leur complément indissociable. Puis, nous verrons l’implication des flux de Ca2+dans l’établissement de la PCD et quelques indices suggérant des mécanismes d’action du Ca2+similaires à ceux présents chez les animaux.

Comme nous l’avons déjà mentionné, il est maintenant clair que les ROS exercent le rôle de molécule de signalisation chez les végétaux (voir les revues de Neill et al. , 2002; Hoeberichts et Woltering, 2003; Overmyer et al. , 2003; Apel et Hirt, 2004; Laloi et al. , 2004; Wendehenne et al. , 2004). Au cours de l’évolution, les organismes adaptés à la vie en aérobie ont dû développer des stratégies pour rendre inoffensifs les ROS générés obligatoirement par des processus métaboliques tels que la respiration et la photosynthèse. Lorsque la production de ROS dépasse la capacité cellulaire à les détoxifier, il survient un stress oxidatif. Or, les plantes ont aussi évolué de façon à percevoir les perturbations du métabolisme oxydatif et les interpréter comme étant des stress auxquels elles doivent réagir pour survivre (Laloi et al. , 2004).

Dans la plante, les ROS peuvent être générés de différentes façons. Au niveau intracellulaire, l’intégration de stress environnementaux peut se faire via les chloroplastes, où la lumière, la température ou la disponibilité en eau ou en nutriments affectent l’efficacité du transport des électrons de la chaîne photosynthétique. Suivant un stress naturel, comme par exemple sous haute intensité lumineuse où l’absorption de l’énergie lumineuse excède la capacité d’assimilation du CO2, différents ROS peuvent être générés par les chloroplastes [l’oxygène singulet (1O2), le radical superoxyde (O2 •-), le peroxyde d’hydrogène (H2O2) et le radical hydroxyle (OH); voir les revues de Apel et Hirt, 2004; Laloi et al. , 2004]. Contrairement aux mammifères, la production de ROS dans les mitochondries est plutôt faible, entre autres parce que les plantes sont pourvues d’un sentier alternatif de transport des électrons composé de l’alternative oxidase (AOX; voir section 1.4.2.2.1) qui aide à réduire la production mitochondriale de ROS (Overmyer et al. , 2003; Apel et Hirt, 2004; Laloi et al. , 2004). Cela n’exclut cependant pas l’implication des mitochondries dans l’action des ROS. D’ailleurs, l’identification chez les plantes d’une thiorédoxine localisée au niveau des mitochondries (Laloi et al. , 2001) laisse supposer un mécanisme de détoxification des ROS similaire aux mammifères au niveau de cet organite. En effet, chez les mammifères, les ROS sont générés principalement dans les mitochondries et leur production est contrôlée par la thiorédoxine-2 (TRX-2). Celle-ci joue un rôle important dans l’élimination des ROS des mitochondries et dans la régulation de l’apoptose dépendante des mitochondries, probablement via une interaction directe avec le cyt c . L’absence de la protéine (toujours chez les mammifères) conduit d’ailleurs à une augmentation des ROS intracellulaires et à la sortie du cyt c (Laloi et al. , 2004).

Dans le cas de l’invasion par un pathogène, la cellule utilise une autre stratégie, soit la production de H2O2et de O2 •-dans l’apoplaste par une oxydase NADPH-dépendante reliée à la membrane plasmique, et potentiellement par des peroxydases et amines oxydases reliées à la paroi (Apel et Hirt, 2004; Laloi et al. , 2004). Fait intéressant, la NADPH-oxydase est similaire à celle retrouvée chez les mammifères dans les phagocytes et les lymphocytes B, qui utilisent les ROS qu’elle génère pour tuer des microorganismes pathogènes. Il semble donc que les animaux et les végétaux ont en commun l’utilisation d’un moyen universel, l’oxydation, pour s’attaquer rapidement et efficacement à l’intégrité de la matière organique (Apel et Hirt, 2004). En outre, la régulation de l’enzyme végétale pourrait être similaire à celle de l’enzyme animale, puisque des ROPs( Rho-related GTPases from plant ), une classe de protéines végétales proche de la famille des protéines Rac des mammifères (dont Rac2 est un régulateur clé de la NADPH-oxydase), induisent dans les cellules végétales la production de H2O2et l’ oxydative burst , possiblement en activant la NADPH-oxydase (Agrawal et al. , 2003).

Outre leurs rôles dans la signalisation, les ROS peuvent avoir des effets délétères directs, entre autres au niveau de l’ADN, des protéines et des lipides. Les plantes sont donc pourvues d’une vaste gamme de moyens, enzymatiques ou non, pour détoxifier les ROS. Parmi les antioxydants majeurs se trouvent l’ascorbate et la glutatione (GSH), mais aussi des composés organiques issus du métabolisme secondaire tels que les flavanoïdes, les alkaloïdes, les caroténoïdes et le tocopherol. Du côté enzymatique, on retrouve la superoxyde dismutase (SOD), l’ascorbate peroxydase (APX), la glutathione peroxydase (GPX) et la catalase (CAT). Contrairement à la plupart des organismes, les végétaux possèdent plusieurs isoformes de la SOD et l’APX, qui sont localisées spécifiquement dans différents compartiments cellulaires. Quant aux deux autres enzymes, la GPX est cytosolique alors que la CAT est localisée dans les peroxisomes (Apel et Hirt, 2004).

De son côté, l’oxyde nitrique (NO) est un gaz dont la fonction de second messager est bien caractérisée chez les mammifères, mais il est aussi un joueur important chez les végétaux. En effet, il est requis pour la mort induite par les ROS (Wendehenne et al. , 2004), mais il agit aussi de façon générale dans différents aspects du développement (Neill et al. , 2003). Le NO peut être synthétisé dans les tissus végétaux par des NO synthases ou des nitrate réductases et semble interagir avec les sentiers de signalisation de l’AS et l’AJ (voir Wendehenne et al. , 2004). La transduction de signal par le NO impliquerait les second messagers GMPc, ADPRc et le Ca2+(Neill et al. , 2003; Wendehenne et al. , 2004). La production de niveaux élevés de NO a été détectée dans des cultures cellulaires soumises à l’attaque d’un pathogène (Clarke et al. , 2000) ou d’un éliciteur fongique (Lamotte et al. , 2004), et il a pu être démontré que ce NO contribue à l’induction de la PCD (Lamotte et al. , 2004). De plus, un apport exogène de NO (Saviani et al. , 2002) ou de NO en combinaison avec d’autres ROS (Delledonne et al. , 2001; de Pinto et al. , 2002) peut induire la PCD dans des suspensions cellulaires. Cependant, au cours de la HR naturelle, le NO ne s’accumule pas avant mais plutôt pendant la PCD, et ce dans l’espace extracellulaire et subséquemment dans le cytoplasme des cellules adjacentes au site d’infection initial, lesquelles meurent quelques temps plus tard (Zhang et al. , 2003). Il a donc été postulé que le NO pourrait faciliter la propagation de la HR d’une cellule à l’autre. À l’opposé, le NO protège les cellules de la couche de l’aleurone contre l’induction de la PCD par les gibbérellines (Beligni et al. , 2002). La protection conférée par le NO pourrait provenir d’un effet anti-oxydant dû à l’augmentation de la CAT, de la SOD, de la glutathione S-transférase et de l’AOX (Beligni et al. , 2002; Huang et al. , 2002; Polverari et al. , 2003). Bien que d’autres recherches soient nécessaires pour clarifier le mode d’action de ce gaz, le NO est vraisemblablement un modulateur bifonctionnel de la PCD végétale capable de stimuler ou inhiber le processus, et il est probable que ce soient les communications entre le NO et les autres pro- ou anti-oxydants qui déterminent le sort de la cellule (Wendehenne et al. , 2004).

Les phytohormones sont des composés organiques synthétisés dans une partie de la plante, puis transportés vers une autre partie où ils produisent un effet physiologique à très faible concentration. En effet, les phytohormones se retrouvent habituellement dans les tissus végétaux à des concentrations de moins de 1 μM (Raven et al. , 1999). Les mécanismes par lesquels elles agissent sont loin d’être parfaitement compris, d’autant plus qu’il apparaît maintenant évident que leurs sentiers de transduction de signal ne sont pas linéaires et indépendants, mais bien au contraire s’entrecroisent pour former des interactions et des synergies complexes (Overmyer et al. , 2003). Nous tenterons ici de démystifier, dans la mesure où les connaissances actuelles le permettent, la complexité de ces interactions dans le contexte de la PCD. La Figure 1-10 résume les différentes interactions ( crosstalk ) ayant lieu entre certaines phytohormones impliquées de près ou de loin dans la PCD, alors que la Figure 1-11 présente les structures des phytohormones traitées dans cette section.

La production de ROS constitue un signal pour la synthèse d’AS, d’AJ et d’éthylène. Au site d’infection par un pathogène, la signalisation par l’AJ est supprimée par l’AS et l’éthylène. L’AS produit activerait une cascade de phosphorylation menant à l’accumulation d’encore plus de ROS ( via une boucle d’amplification) de façon à favoriser la mort cellulaire. L’éthylène favorise aussi en retour la production de ROS. Cette seconde vague de ROS pourrait contribuer à la propagation de la PCD aux cellules voisines. Dans les cellules un peu plus loin en périphérie, le plus faible niveau d’AS induit l’expression des PR et autres gènes de défense, mais inhibe la production d’éthylène via sa capacité à inhiber la dernière étape du sentier menant à la synthèse de l’éthylène. La signalisation par l’éthylène menant à la production de ROS est également contrecarrée par l’AJ. Bien que l’AS et l’AJ collaborent pour restreindre la propagation des lésions, l’AJ peut avoir un effet antagoniste sur l’accumulation de l’AS, possiblement dans le but d’éviter l’accumulation d’AS à un niveau suffisamment élevé pour l’induction de la PCD. Dans les cellules de l’aleurone, le GA augmente la susceptibilité aux ROS, qui sont produits en grande quantité par les glyoxysomes, mais l’action antagoniste de l’ABA sur la signalisation par l’éthylène prévient la synthèse de ROS et ainsi l’autolyse et la mort liées aux ROS. Les interactions peuvent différer selon le stress auquel la plante est soumise. Consulter le texte pour d’autres détails.

A) Éthylène. B) Acide salicylique (AS). C) Acide jasmonique (AJ). D) Acide abscissique (ABA). E) Acide gibbérellique (GA). F) Adénine, la structure à la base des cytokinines par une substitution en position N6(flèche pleine). Les cytokinines peuvent aussi être sous la forme de nucléoside (le plus souvent par l’ajout d’un pentose, flèche pointillée) ou nucléotide (par l’ajout de un ou plusieurs groupement phosphate au pentose). G) Trans -zéatine (Zea). H) Isopentényl adenine (iP). I) 6-benzylaminopurine (Bap). J) Kinétine (Kin).

L’AS est un acide phénolique (Figure 1-11) bien connu pour son rôle dans les RD envers les pathogènes, y compris la HR (voir section 1.4.1.8). En effet, la réponse nécrotique locale s’accompagne le plus souvent de l’établissement d’une réponse systémique acquise ( systemic aquired resistance , SAR), qui permet véritablement d’immuniser la plante entière contre de futures infections (Ryals et al. , 1996). Suivant l’invasion par un pathogène, l’AS s’accumule initialement aux sites d’infection en concentration très élevée (jusqu’à 70 μM), puis plus tard dans le reste de la plante à des concentrations plus faibles. Des plantes transgéniques ne pouvant accumuler l’AS dû à l’expression de la salicylate hydroxylase ( nahG ) bactérienne ne peuvent établir la SAR. Il semble que l’induction des PR par l’AS serait à l’origine de la SAR. L’induction des PR et de la SAR peuvent d’ailleurs être simulés par l’apport exogène d’AS (Dong, 1998; Murphy et al. , 1999; Alvarez, 2000).

Il semble également que la forte accumulation d’AS aux sites d’infection joue un rôle dans l’établissement de la HR. En effet, la majorité des mutants chez lesquels la signalisation par l’AS est constitutivement active développent des lésions nécrotiques spontanées, mimant ainsi la HR. Ils appartiennent à une plus large classe de mutants, appelés   lesion mimic mutants (LMM), qui présentent des problèmes au niveau des sentiers contrôlant l’initiation de la PCD (mutants d’initiation, présentant des lésions nécrotiques localisées et définies) ou la suppression de la PCD (mutants de propagation, incapables de contrôler l’expansion des lésions; voir la revue de Lorrain et al. , 2003). Ces mutants, qui présentent également une expression constitutive de leurs gènes de défense PR, possèdent une résistance accrue envers différents pathogènes (Lorrain et al. , 2003). Il se pourrait donc que tout comme dans le cas du TMV et du gradient d’AS dont il a été fait mention à la section 1.4.1.8, un niveau accru d’AS chez ces mutants entraîne une SAR constitutive, mais que de temps à autre une production locale incontrôlée conduise à l’induction de la PCD, mimant la HR. De ce fait, plusieurs des LMM ont été croisés avec un mutant ne pouvant accumuler l’AS (voir paragraphe précédent) de façon à tester le rôle de cette hormone dans l’initiation de la HR. Bien que le phénotype de mort cellulaire spontanée ait pu être aboli chez plusieurs mutants, d’autres ne présentaient qu’une réduction de la taille des lésions, ou même aucun effet (Lorrain et al. , 2003). Prises toutes ensemble, ces données portent à croire qu’à forte concentration au niveau du site d’infection, l’AS collabore avec d’autres signaux pour induire la PCD et que suivant son transport en périphérie de la lésion, où l’hormone se retrouve alors en plus faible concentration, elle deviendrait un signal de survie favorisant l’établissement de la bordure de la lésion (Lam, 2004).

Il est à noter que l’induction de la PCD par l’AS peut être générée in vitro avec des suspensions cellulaires, de faibles doses permettant l’induction des PR sans compromettre la viabilité ni la croissance, alors que de fortes doses sont toxiques (Norman et al. , 2004), rappelant le cas du gradient d’AS autour des lésions en réaction au TMV (Enyedi et al. , 1992). Il semblerait que la signalisation par l’AS implique la phosphorylation de protéines, et effectivement une mitogen-activated protein kinase (MAPK) activée par l’AS a récemment été découverte (voir la revue d’Alvarez, 2000). La signalisation par les kinases mènerait à l’accumulation des ROS, qui sont très importants non seulement dans la HR, mais aussi dans plusieurs des cas de PCD végétale. Les ROS peuvent à leur tour stimuler la production d’AS et cette possible boucle d’autoamplification pourrait servir à amplifier le signal généré par l’AS (Alvarez, 2000; Beers et McDowell, 2001).

L’AS réduit aussi la synthèse d’ATP en inhibant la chaîne de transport des électrons dans la mitochondrie (Xie et Chen, 1999; Maxwell et al. , 2002) et cette baisse contribue possiblement à son activité cytotoxique puisque chez les animaux, une telle baisse du niveau d’ATP peut être suffisante pour induire l’apoptose (Eguchi et al. , 1997; Leist et al. , 1997; Izyumov et al. , 2004). Dans des cultures cellulaires de tabac, l’AS peut à forte dose inhiber le transport des électrons vers l’ubiquinone, alors qu’à plus faible concentration le transport des électrons n’est bloqué qu’en partie seulement, étant plutôt détourné à partir de l’ubiquinone vers l’AOX (Norman et al. , 2004). Il était déjà connu que l’AS pouvait induire l’AOX (Rhoads et McIntosh, 1993; Maxwell et al. , 2002), la seule enzyme du sentier alternatif de transport des électrons (un sentier spécifique aux végétaux), qui catalyse le transfert des électrons vers l’oxygène moléculaire. Le sentier alternatif découple donc le transport des électrons de la synthèse d’ATP, mais aurait pour fonction possible la prévention de la production de ROS dans des conditions où le transport des électrons par le sentier standard ne fournit pas à la demande (Siedow et Umbach, 1995). Toute l’énergie non utilisée pour la synthèse d’ATP est perdue sous forme de chaleur. D’ailleurs, l’AS joue un rôle dans le contrôle de la production de chaleur dans les inflorescences des espèces thermogéniques, la chaleur permettant la volatilisation de composés odorants dont la fonction est l’attraction de pollinisateurs (Raskin et al. , 1987; Raskin et al. , 1989).

Bien que les concentrations dont on parle ici ( in vitro ) sont beaucoup plus élevées que les concentrations endogènes d’AS, il n’en demeure pas moins que l’AOX est bel et bien impliquée dans le contrôle négatif de la PCD in vivo (Ordog et al. , 2002; Robson et Vanlerberghe, 2002; Vanlerberghe et al. , 2002). Il est donc probable que l’effet protecteur de l’AS contre la PCD (pour l’établissement de la bordure de la lésion dans le cadre de la HR) se fasse in vivo par le découplement dans la mitochondrie du transport des électrons vers l’AOX. Bien que ce découplement diminue la production d’ATP, il est probable que le bénéfice engendré par la diminution de la production de ROS déplace l’équilibre vers la survie. Considérant que les données de Norman et al . (2004) indiquent que les cultures de tabac accumulent l’AS de façon transitoire seulement, le niveau d’accumulation étant proportionnel à la concentration appliquée, il est possible qu’il en soit de même in vivo , et dans ce cas la baisse de production d’ATP ne serait que temporaire. Par contre, à concentration plus élevée (comme par exemple au site initial d’infection), l’inhibition complète du transport des électrons dans la mitochondrie ne peut pas être viable pour la cellule, induisant la PCD (HR).

Les cytokinines sont des dérivés de l’adénine, présentant une substitution en position N6(Figure 1-11). Elles sont impliquées dans la croissance et la différenciation (en collaboration avec les auxines) dans à peu près tous les aspects du développement végétal et ont donc à première vue peu à voir avec la PCD. Cependant, leur niveau diminue dans les organes en sénescence. De même, un apport exogène de ces phytohormones peut renverser (ou à tout le moins retarder substantiellement) la sénescence de certains organes tels que les feuilles et les pétales (Mok, 1994) et en ce sens constituent des régulateurs négatifs de la PCD. Il est toutefois à noter qu’un tel rôle semble vraiment restreint aux organes en sénescence puisqu’un effet anti-PCD des cytokinines n’a jamais été rapporté pour d’autres cas de PCD végétale. Le mode d’action par lequel elles agissent n’est pas clair et concerne essentiellement le métabolisme des chloroplastes (Sherameti et al. , 2004). Cet effet anti-sénescence des cytokinines et leur diminution au cours de ce processus ont mené au postulat selon lequel la diminution du niveau de cytokinine en dessous d’un certain seuil devrait déclencher la sénescence. Ce postulat a pu être infirmé récemment avec l’obtention de plantes transgéniques surexprimant de façon constitutive différentes isoformes de cytokinine oxidase/désydrogénase (CKX), l’enzyme catalysant l’inactivation irréversible des cytokinines. Contre toute attente, ces plantes, dont les niveaux de cytokinines sont inférieurs à la normale (de 30 à 45%), ne présentent pas de sénescence foliaire accélérée (Werner et al. , 2003). Le postulat était donc faux et les auteurs de l’étude ont suggéré qu’un faible niveau de cytokinines est peut-être requis pour l’établissement de la sénescence, mais ne constitue pas un signal pour son induction (Werner et al. , 2003).

Étonnamment, des résultats récents ont démontré que de hautes concentrations de cytokinines peuvent bloquer la prolifération cellulaire et induire la PCD dans des suspensions cellulaires de carottes, d’ A. thaliana (Carimi et al. , 2003; Carimi et al. , 2004) et de tabac (Mlejnek et Procházka, 2002; Mlejnek et al. , 2003). La mort est accompagnée de fragmentation internucléosomale de l’ADN nucléaire et de d’autres caractéristiques de l’apoptose suggérant qu’il s’agirait de PCD. L’expression précoce d’un gène codant pour une protéase dont l’expression est habituellement spécifique à la sénescence ( SAG12 ) suggère qu’il pourrait s’agir d’une forme accélérée de sénescence (Carimi et al. , 2004). Bien que cet effet des cytokinines sur les cellules en culture soit surprenant, des effets toxiques des cytokinines ont aussi été rapportés dans certains cas de culture de tissu in vitro ou même pour des plantes (Ainley et al. , 1993; Martineau et al. , 1994; McCabe et al. , 2001; Lee et Chen, 2002; Rakwal et al. , 2003). Par exemple, un bon nombre d’expérimentations ont tenté de retarder la sénescence foliaire via la production d’une enzyme permettant la biosynthèse des cytokinines, l’isopentenyl transférase (IPT), et ce faisant certains effets toxiques ont parfois été observés. Ainsi, chez la laitue, cette stratégie permet effectivement de retarder la sénescence des vielles feuilles, mais au contraire les jeunes feuilles présentent une sénescence accélérée (McCabe et al. , 2001), un phénomène également rapporté chez le tabac (Ainley et al. , 1993). Ces données vont dans le même sens que celles rapportées par Carimi et collaborateurs (Carimi et al. , 2003), qui ont montré que les cellules en division sont plus affectées par les cytokinines que les cellules quiescentes. Cela est peut-être dû au fait que la cytokinine doit être métabolisée pour exercer sa toxicité (Mlejnek et al. , 2003).

L’acide jasmonique (AJ) est reconnu pour son rôle dans la réponse aux blessures causées par des insectes ou autres herbivores. L’AJ et son ester méthylé, le méthyle jasmonate, sont des composés cyclopentaniques qui dérivent de l’acide linolénique (Figure 1-11). Étant très volatil, le méthyle jasmonate est associé à une certaine forme de « communication » entre plantes voisines, notamment l’induction à distance de mécanismes de défense (Creelman et Mullet, 1997). L’AJ est aussi impliqué dans les RD envers les microorganismes pathogènes, puisque des mutants déficients pour la production ou la perception de l’AJ présentent une plus grande susceptibilité envers des pathogènes fongiques et bactériens de type nécrotrophe. De même, la surexpression d’un gène de biosynthèse de l’AJ confère une résistance accrue envers le champignon nécrotrophe Botrytis cinerea (Seo et al. , 2001; Kunkel et Brooks, 2002). L’AJ joue aussi un rôle particulier dans la HR induite par l’ozone (O3). En effet, l’O3induit la biosynthèse d’AJ et des traitements avec de l’AJ exogène inhibent la propagation de la mort induite par l’O3chez un mutant particulièrement sensible à l’O3. Il semblerait donc que l’AJ soit une composante importante d’un sentier qui régule négativement la PCD et pourrait collaborer avec l’AS (lorsque celui-ci est à faible concentration) dans l’établissement de la bordure des lésions (Hoeberichts et Woltering, 2003; Overmyer et al. , 2003). Cet effet pourrait venir de l’atténuation de la production de ROS en diminuant la sensibilité de la plante envers l’éthylène. En effet, l’AJ induit les gènes codant pour des récepteurs de l’éthylène (Schenk et al. , 2000). Il a été proposé qu’en présence d’un grand nombre de récepteurs, dont certains se retrouvent inoccupés par l’éthylène, la cellule devienne insensible à la présence de l’hormone (nous verrons à la section 1.4.2.2.4 qu’en l’absence de l’hormone, le récepteur est constitutivement actif et régule négativement la réponse à l’éthylène). De cette façon, l’AJ pourrait contribuer à ralentir la propagation éthylène-dépendante des lésions en réduisant l’accumulation éthylène-dépendante de ROS (Overmyer et al. , 2003).

De son côté, l’éthylène (Figure 1-11) semble un inducteur de la PCD à large spectre et l’implication de cette hormone gazeuse dans les différentes formes de PCD a déjà été mentionnée au passage dans la section 1.4.1. Rappelons qu’en plus de favoriser la maturation des fruits et la sénescence de différents organes, l’éthylène déclenche la PCD médiée par l’O3et des pathogènes (donc reliée à la HR), mais est aussi impliquée dans la PCD des cellules de l’endosperme et la formation de l’aérenchyme dans le cortex racinaire (Kieber, 1997; Kunkel et Brooks, 2002; Hoeberichts et Woltering, 2003). Cependant, il se pourrait bien que dans plusieurs cas, l’éthylène soit requise mais non suffisante pour que la cellule procède à l’exécution d’un programme de mort (Hoeberichts et Woltering, 2003). À l’opposé, il a aussi été rapporté que la HR puisse se développer normalement chez des mutants insensibles à l’éthylène, suggérant qu’il pourrait exister un sentier de mort indépendant de l’éthylène (Overmyer et al. , 2003). Finalement, la stimulation de la PCD par l’éthylène serait possiblement due à une plus grande production de ROS (Hoeberichts et Woltering, 2003; Overmyer et al. , 2003). Ainsi, l’utilisation d’inhibiteurs de la biosynthèse de l’éthylène ou de sa perception peuvent conduire à l’abolition de la production de H202et de la mort, démontrant un rôle critique de l’éthylène dans certains cas de PCD végétale (De Jong et al. , 2002). Des interactions positives entre l’éthylène et l’AJ ont aussi été suggérées dû au fait que beaucoup de gènes peuvent être induits par les deux hormones, parfois même en synergie, et que la signalisation par les deux hormones est strictement requise pour certains de ces gènes (voir la revue de Kunkel et Brooks, 2002). En fait, il se pourrait bien que l’AJ, tout comme l’AS et potentiellement les cytokinines, exerce des fonctions antagonistes selon les circonstances. En effet, la PCD induite par la fumonisin-B1 (considérée comme un modèle de la HR) requiert la signalisation par l’AJ et un analogue structural et fonctionnel de la phytohormone (la coronatine) ou l’AJ lui-même peuvent induire des symptômes chlorotiques et la sénescence (Creelman et Mullet, 1997; Overmyer et al. , 2003).

Nous avons déjà mentionné à la section 1.4.1.4.2 que l’ABA pouvait réguler négativement la production d’éthylène dans l’endosperme amylacé; l’hypothèse actuelle stipule que la balance entre ces deux hormones permet le déclenchement de la PCD au moment approprié pendant le développement de l’endosperme (Hoeberichts et Woltering, 2003). L’ABA est aussi un antagoniste du GA dans les cellules de l’aleurone et cet antagonisme opérerait via la régulation de l’accumulation des ROS (détaillé à la section 1.4.1.4.3). Il est à noter que l’ABA et les gibbérellines ont d’autres rôles dans le développement qui ne sont pas reliés à la PCD et qui ne font pas l’objet de cette revue (consulter notamment Raven et al. , 1999).

Parmi les phytohormones pouvant jouer un rôle dans la PCD, seules les cytokinines et l’éthylène ont pu à ce jour être associées à des récepteurs, soit au niveau de la membrane plasmique ou au niveau intracellulaire (Romanov, 2002; Napier, 2004). Dans cette section-ci, nous nous attarderons brièvement à ces récepteurs et le lecteur est référé à plusieurs excellentes revues pour plus de détails (Hutchison et Kieber, 2002; Romanov, 2002; Wang et al. , 2002; Chang, 2003; Grefen et Harter, 2004; Guo et Ecker, 2004; Klee, 2004; Napier, 2004).

La transduction de signal par les cytokinines repose sur un système similaire au two-component response system (TCS) bactérien, dont les composantes sont résumées à la Figure 1-12. Les bactéries utilisent ce système pour la perception de leur environnement et il répond à une vaste gamme de stimuli. Il est constitué d’abord d’une sensor histidine (His) kinase pourvue de deux domaines aux fonctions différentes, soit un domaine de réception ( input ) qui, suivant la détection d’un signal, entraîne une modification de son domaine de transmission ( transmitter ) et de l’activité His kinase dont ce domaine est pourvu. Il s’ensuit alors une autophosphorylation sur un résidu His conservé, puis le phosphate est transféré (relayé) à un résidu aspartate (Asp) conservé sur le domaine receveur ( receiver ) d’un deuxième composant du système, le response regulator (RR). Beaucoup de RR contiennent aussi un domaine de sortie ( output ), dont l’activité, typiquement en tant que facteur de transcription, est régulée par le statut de phosphorylation du domaine de réception.

A) Le TCS de base retrouvé chez les procaryotes. B) Le système du phospho-relais à plusieurs étapes. Voir le texte pour les détails (P : groupement phosphate; H : résidu histidine conservé; D : résidu aspartate conservé; Hpt : histidine phosphotransfer ; RR : response regulator ). Tiré de Hutchison et Kieber (2002).

Chez les eucaryotes, le TCS est plutôt un phospho-relais à plusieurs étapes (Figure 1-12B). En plus de l’ hybrid histidine sensor kinase , qui est pourvue d’un domaine de réception fusionné à son domaine de transmission, et du RR, il s’ajoute une troisième composante (Hpt) dont la fonction est le relais du phosphate du domaine de réception de l’ hybrid histidine sensor kinase vers celui du RR, et ce via un domaine appelé His phosphotransfer . Chez A. thaliana , les RR (ARR) sont du type A ou du type B. Les ARR de type B sont des facteurs de transcription qui, suivant leur activation par le Hpt, vont favoriser la transcription des gènes codant pour les ARR de type A. Ceux-ci sont dépourvus d’un domaine de sortie, mais leur domaine de réception leur permet d’être activés suivant le transfert d’un groupement phosphate par un Hpt. Les gènes codant pour les ARR de type A sont rapidement induits suivant la perception des cytokinines. Cependant, les cibles de ces protéines sont majoritairement inconnues. La Figure 1-13 présente un modèle de la transduction de signal par les cytokinines.

Les récepteurs de cytokinines tel que CRE1 fonctionnent probablement en dimère de façon à procéder à une phosphorylation mutuelle, et ce au niveau de la membrane plasmique (détaillé dans la partie de gauche). La liaison d’une cytokinine active le domaine de transmission (en bleu), ce qui entraîne l’autophosphorylation puis le transfert du phosphate au domaine receveur (rose). Le relais du phosphate est ensuite assuré par l’ histidine phosphotransfer (Hpt; en vert), qui migre au noyau pour activer les ARR ( response regulator ) de type B [leur domaine de sortie ( output ) est d’ordinaire inhibé par le domaine receveur en l’absence de groupement phosphate sur ce dernier]. Ceux-ci favorisent alors la transcription des ARR de type A (dépourvus de domaine de sortie), dont les activités sont mal connues, mis à part l’inhibition de leur propre transcription. Voir le texte pour d’autres détails. Tiré de Romanov (2002; gauche) et de Hutchison et Kieber (2002; droite). P : groupement phosphate; H : résidu histidine conservé; D : résidu aspartate conservé.

La signalisation par l’éthylène est encore mal comprise, bien que cette hormone fut la première pour laquelle des récepteurs aient été identifiés de façon irrévocable (Napier, 2004). Sans entrer dans tous les détails, mentionnons seulement que ces récepteurs sont très similaires aux hybrid histidine sensor kinase , mais sont dépourvus du domaine de réception ( input ) et sont localisés au niveau de la membrane du RE. En l’absence d’éthylène, le récepteur serait vraisemblablement constitutivement actif et ainsi favoriserait l’activation d’un sentier de MAP kinases régulant négativement la réponse à l’éthylène. La liaison de l’éthylène au récepteur (au niveau d’une poche hydrophobe de la portion N-terminale, en présence de cuivre comme co-facteur) entraînerait l’inactivation de son ligand (CTR1, une MAPKKK), et favoriserait ainsi la réponse à l’éthylène (Wang et al. , 2002; Chang, 2003; Grefen et Harter, 2004; Guo et Ecker, 2004; Klee, 2004).

Le Ca2+est un messager intracellulaire quasi-universel contrôlant une vaste gamme de processus cellulaires et son rôle dans l’apoptose animale a déjà été abordé à la section 1.3.5. Chez les végétaux, il est maintenant évident que des modulations de la [Ca2+]cjouent un rôle déterminant dans différents processus physiologiques, dont la modulation de l’ouverture et de la fermeture des stomates constitue un exemple unique et très bien caractérisé (Blatt, 2000; Yang et al. , 2004). La signalisation par le Ca2+est aussi impliquée entre autres dans le gravitropisme, la division et l’élongation cellulaire, la différenciation, la polarité, les RD et les réponses aux stress, sans oublier la PCD. Les revues récentes de White et Broadley, 2003 et de Reddy, 2001 dressent un excellent portrait de toutes les études ayant porté sur la modulation de la [Ca2+]cau cours de processus développementaux ou en réponse à des stress biotiques et abiotiques (voir entre autres le tableau II de Reddy, 2001). De notre côté, nous nous attarderons plus spécifiquement à l’implication des flux de Ca2+dans le cadre de la PCD.

Dans la cellule végétale, le Ca2+est entreposé principalement dans l’apoplaste (1-10 mM), la vacuole (1-10 mM), le RE (1 mM) et les mitochondries (1 mM), alors qu’il est maintenu aux environs de 100-200 nM dans le cytosol (Reddy, 2001). L’élévation de la [Ca2+]cpeut donc se jouer de différentes façons, comme le laisse présager la présence de pompes à Ca2+et de canaux perméables au Ca2+au niveau de la membrane plasmique et des membranes internes (au même titre que chez les animaux; voir section 1.3.5). Un résumé de la distribution des rôles est présenté à la Figure 1-14. Il est à noter que le noyau peut aussi contribuer à la génération de signaux calciques (Pauly et al. , 2000; Pauly et al. , 2001). Le cas des mitochondries, dont il n’est pas question ici, sera discuté à la section 1.4.2.4.

La quantification de la [Ca2+]cpeut se faire à l’aide de différents indicateurs qui peuvent être détectés en microscopie à fluorescence, habituellement avec un équipement spécialisé. Cependant, leur utilisation dans des cellules végétales a été très limitée, entre autres dû au fait qu’elles sont imperméables à plusieurs d’entre eux et que leur localisation intracellulaire demeure incertaine. C’est ainsi que la grande majorité des études ont été effectuées avec la technologie de l’aequorine basée sur la bioluminescence. En effet, la protéine peut être facilement exprimée dans les cellules végétales puis reconstituée in vivo en une enzyme fonctionnelle en présence d’oxygène et d’un groupement prosthétique, la coelentérazine. La liaison de Ca2+entraîne alors un changement de conformation qui transforme la protéine en oxygénase active, et la coelentérazine est transformée en coelentéramide qui émet une lumière bleue (λ= 469 nm) détectable facilement à l’aide d’un luminomètre (voir Roos, 2000; Mithöfer et Mazars, 2002).

Les cercles bleus représentent des sentiers de transport actif [pompes à Ca2+dépendant d’une source d’énergie; ACA : autoinhibited Ca2+/ATPase (la direction vers laquelle le Ca2+est pompé par ACA1 au niveau des chloroplastes est hypothétique) ECA1 : ER-type Ca2+/ATPase; CAX1 : Ca2+/H+antiporteur]. Les carrés rouges représentent des canaux perméables au Ca2+, et ce de façon sélective (InsP3R : récepteur activé par l’inositol (1,4,5) triphosphate (InsP3); RyR : ryanodine receptor activé par l’ADP ribose cyclique (cADPR); DAC : depolarization activated Ca 2+ channel ; HAC : hyperpolarization activated Ca 2+ channel ; VVCa : vacuolar voltage-gated Ca 2+ channel ; SV : slowly activating vacuolar channel ) ou non sélective (NSC : non selective cation channel ; CNGCx : cyclic nucleotide gated channel ; GLRx : glutamate receptor channel; TPC1 : two-pore channel ). La localisation de ces canaux et pompes est parfois putative (entre autres pour ceux identifié par la présence d’un ?) et ils n’ont pas tous été clonés (certains n’ont été caractérisés qu’au niveau électrophysiologique ou biochimique, notamment parmis ceux localisés aux organelles). Schéma tiré de Sanders et al . (2002).

Dans la plupart des cas répertoriés, l’entrée de Ca2+dans le cytosol provient de l’apoplaste, mais dans certains cas une deuxième « vague » en provenance des compartiments internes a pu être détectée. De plus, l’entrée de Ca2+dans le cytosol est habituellement transitoire ou plus ou moins soutenue pendant un certain temps (Rudd et Franklin-Tong, 2001) et peut aussi générer des oscillations (répétitions successives d’augmentations et de diminutions) comme c’est le cas dans les cellules de gardes (Blatt, 2000; Yang et al. , 2004). Ainsi, il a été établi que différents stimuli pouvaient générer des modulations spatiales et temporelles de la [Ca2+]creconnues comme étant leur Ca 2+ -signatures , ces signatures devant être responsables au moins en partie de la spécificité de la réponse (Rudd et Franklin-Tong, 2001). Une signature particulière devrait donc générer une réponse particulière. Or, les preuves expérimentales pour appuyer ce postulat sont plutôt faibles, n’étant apparemment vraiment solides que dans le cas des cellules de gardes (Scrase-Field et Knight, 2003). Une autre hypothèse stipule que l’augmentation de la [Ca2+]cn’agirait qu’en tant que Ca 2+ switch , simplement en activant des éléments de transduction de signal sensibles au Ca2+(dont il sera question au paragraphe suivant). La spécificité de la réponse pourrait alors dépendre de la présence ou non de tels éléments dans une cellule donnée (Scrase-Field et Knight, 2003).

Suivant un stimulus ou un stress, l’élévation transitoire de la [Ca2+]cqui en découle est perçue et décodée par une gamme de protéines qui lient le Ca2+( Ca 2+ -sensors ; CS) via un motif protéique spécifique ( EF hand ), alors que la sortie du Ca2+vers l’extérieur ou sa séquestration par des organites tels que les vacuoles, le RE et les mitochondries permet le rétablissement de son niveau de base. La liaison du Ca2+à une CS donnée entraîne un changement de conformation chez cette dernière qui résulte en la modulation de son activité (souvent des protéine kinases Ca2+-dépendantes) ou de sa capacité à interagir et moduler l’activité de d’autres protéines, comme la calmoduline (CaM), un récepteur de Ca2+ubiquitaire chez les eucaryotes (Snedden et Fromm, 2001). Les CaM, présentes sous de nombreuses isoformes dans le règne végétal, modulent ainsi l’activité d’un grand nombre de CaM-binding proteins (CBP). Ces CBP sont impliquées dans une large gamme de processus tels que le transport d’ions (plusieurs codent pour des canaux ioniques), la régulation des gènes, l’organisation du cytosquelette, la division cellulaire, la résistance aux maladies et la tolérance aux stress. Il est probable que certaines CBP aient des fonctions spécifiques aux plantes puisque plusieurs n’ont pas d’homologue animal (Reddy, 2001).

Dans la PCD végétale, une élévation de la [Ca2+]cest observée durant la différenciation des TE, la formation de l’aérenchyme, la maturation de l’endosperme, la sénescence foliaire, la HR et la réaction de SI (dans les grains de pollen). Une telle réponse accompagne également la signalisation hormonale. Dans plusieurs des cas, l’inhibition de l’augmentation de la [Ca2+]cinhibe la réponse physiologique, établissant l’importance du Ca2+dans la transduction de signal menant à la PCD. Tenter ici d’en dresser un portrait exhaustif serait non seulement long et fastidieux mais également ennuyeux. Nous tenterons plutôt d’examiner les mécanismes cellulaires menant à l’augmentation de la [Ca2+]c, ou les événements en aval sous-tendus par cette augmentation.

Parmi les événements conduisant à la PCD qui sont régulés par une hausse de la [Ca2+]c, notons la production de ROS par la NADPH oxydase. En effet, des plantes transgéniques dont l’activité catalase est réduite accumulent plus de H2O2en présence d’une intense lumière, ce qui conduit à une PCD massive dont les symptômes sont similaires à la PCD induite par l’ozone (Dat et al. , 2003). Dans ces conditions, l’induction du messager codant pour la NADPH oxydase et l’inhibition de la PCD par des inhibiteurs de l’ oxydative burst laisse présager que la génération d’une bouffée de ROS par la NADPH oxydase est nécessaire pour l’induction de la PCD, un phénomène aussi observé dans la HR. De plus, un flux de Ca2+de l’apoplaste vers le cytosol est aussi important pour l’induction de cette PCD, comme c’est le cas pour l’induction de la HR (McDowell et Dangl, 2000). Il semblerait que le flux de Ca2+puisse être à l’origine de la génération de l’ oxydative burst par la NADPH oxydase, cette dernière possédant justement deux motifs EF hand qui permettent la liaison du Ca2+(Keller et al. , 1998). Il semble que les calmodulin-like domain protein kinases (CDPK), une superfamille de protéines uniques aux plantes et dont plusieurs sont induites au cours des RD, pourraient aussi induire l’activité de la NADPH oxydase en présence de niveaux élevés de Ca2+ c(Blumwald et al. , 1998).

L’induction de la PCD de type HR par la cryptogéïne dans des cultures cellulaires de tabac est un modèle bien caractérisé (voir entre autres Lecourieux et al. , 2002). La cryptogéïne est une élicitine qui origine de l’oomycète Phytophthora cryptogea dont l’interaction avec un récepteur localisé au niveau de la membrane plasmique (Wendehenne et al. , 1995; Bourque et al. , 1998; Bourque et al. , 1999) entraîne rapidement la phosphorylation d’une variété de protéines (Lecourieux-Ouaked et al. , 2000) puis un influx de Ca2+de l’apoplaste vers le cytosol (Tavernier et al. , 1995). Ces deux événements sont nécessaires pour l’activation de MAPK (Lebrun-Garcia et al. , 1998; Zhang et al. , 2000), la mobilisation de Ca2+intracellulaire menant à une deuxième vague d’augmentation de la [Ca2+]c(Lecourieux et al. , 2002), la production transitoire de ROS par la NADPH oxydase (Pugin et al. , 1997) et l’ouverture de canaux anioniques au niveau de la membrane plasmique (Wendehenne et al. , 2002). De plus, cette élicitine peut stimuler la production de NO, un événement dépendant lui aussi de l’influx initial de Ca2+dans le cytosol. Ce NO favorise la sortie de Ca2+à partir des compartiments internes, mais n’a apparemment rien à voir avec l’activation des MAPK, l’ouverture des canaux anioniques ou l’accumulation de messagers codant pour des protéines de défense (Lamotte et al. , 2004). Combinées à d’autres travaux récents, comme ceux de Wendehenne et al. , (2004), ces données indiquent que le Ca2+est impliqué dans la signalisation par le NO.

Le passage du Ca2+de l’apoplaste vers le cytosol si souvent observé au cours de la PCD végétale doit nécessairement se faire via des canaux ioniques (section 1.4.2.3.1). Le gène codant pour dnd1 ( CNGC2 ), un mutant d’ A. thaliana isolé à cause de son incapacité à induire la HR en présence d’un pathogène avirulent, est en fait un cyclic nucleotide-gated channel (CNGC) permettant le passage du Ca2+, du K+et d’autres cations en présence de nucléotides cycliques (Leng et al. , 1999; Clough et al. , 2000). De plus, son expression est associée avec certaines formes de PCD développementale, notamment la sénescence florale et foliaire et la sénescence dans des cultures cellulaires (Köhler et al. , 2001). Fait intéressant, l’ajout de dibutyryl AMPc ou GMPc (des dérivés actifs lipophiles des nucléotides cycliques pouvant traverser les barrières lipidiques) à des protoplastes de tabac favorise l’augmentation de la [Ca2+]c(Volotovski et al. , 1998). De ce fait, l’augmentation d’AMPc induite par un éliciteur fongique dans des suspensions cellulaires de haricot (Bolwell, 1992) pourrait être responsable de l’augmentation de la [Ca2+]cet de la production de ROS qui en découlent (Bindschedler et al. , 2001). Il est également possible que le gène PPF1 code pour un transporteur de Ca2+localisé au niveau des chloroplastes. Puisque sa surexpression retarde la PCD du méristème apical, conjointement avec le retardement de la détection d’une augmentation de la [Ca2+]c(tous deux étant au contraire accélérés lorsque l’expression de la protéine est inhibée par l’expression de l’ARNm dans l’orientation antisens), il a été proposé que PPF1 code pour un canal ionique pouvant inhiber la PCD en maintenant un faible niveau de Ca2+ c(Wang et al. , 2003; Li et al. , 2004).

Finalement, le cas de la SI dans les tubes polliniques en germination (voir section 1.4.1.3) fournit un bel exemple de PCD développementale impliquant la signalisation par le Ca2+. En effet, une augmentation de la [Ca2+]c(parvenant au moins en partie de l’extérieur du tube pollinique) est à l’origine de l’inactivation quasi immédiate (en moins de 90 secondes) par phosphorylation d’une pyrophosphatase, puis à peine quelques minutes plus tard une autre activité de phosphorylation mènerait à l’activation d’une MAPK putative (Rudd et Franklin-Tong, 2003). La SI mène aussi, outre la fragmentation de l’ADN déjà discutée dans une autre section, au clivage de la poly (ADP-ribose) polymérase (PARP) d’origine bovine (Thomas et Franklin-Tong, 2004), une enzyme impliquée dans la réparation de l’ADN nucléaire et constituant un substrat classique de la caspase-3 dans l’apoptose animale (Degterev et al. , 2003). Le clivage d’une PARP végétale putative a déjà été rapporté dans le cadre de la PCD végétale en utilisant des anticorps dirigés contre une PARP animale (Sun et al. , 1999; Tian et al. , 2000) et les plantes possèdent au moins deux gènes codant potentiellement pour cette enzyme (Lepiniec et al. , 1995; Babiychuk et al. , 1998). D’autre part, l’utilisation d’un inhibiteur spécifique pour la caspase-3 animale a permis de réduire considérablement le clivage de l’ADN associé à la SI, ainsi que de réduire l’inhibition de l’élongation du tube pollinique et le clivage de la PARP, suggérant l’activation d’une activité caspase-like en réponse à la SI (Thomas et Franklin-Tong, 2004; voir aussi la section 1.4.3). Finalement, l’élévation de la [Ca2+]cdans les tubes polliniques incompatibles est associée à la sortie du cyt c des mitochondries (Thomas et Franklin-Tong, 2004), dont il sera question à la section suivante.

Chez les mammifères, il est maintenant reconnu que l’effet tampon que peuvent exercer les mitochondries vis-à-vis l’augmentation de la [Ca2+]cqui survient à la suite d’un stimulus ou d’un stress donné contribue à en moduler le patron spatio-temporel. Cependant, cette accumulation de Ca2+ mpeut éventuellement dépasser la capacité tampon des mitochondries. Ceci entraîne alors l’ouverture d’un pore (accompagné ou non de la rupture de la membrane mitochondriale externe) et la sortie de certaines molécules cytotoxiques telles que le cyt c , l’AIF et l’endonucléase G, ces deux dernières contribuant aux dommages à l’ADN nucléaire de façon indépendante des caspases (voir section 1.3.4). Chez les végétaux, des preuves directes de l’existence d’un tel mécanisme d’induction de la PCD sont absentes, mais certains résultats indirects portent à croire que les plantes pourraient être pourvues d’un tel mécanisme.

Similairement à ce qui est observé chez les animaux (voir section 1.3.5.2), les mitochondries végétales peuvent être sujettes à des fluctuations de [Ca2+], détectées en utilisant certains stress connus pour induire des élévations au niveau du Ca2+ c(Logan et Knight, 2003). La plupart des stress ayant été testés, soit le mannitol, le froid et le contact ( touch ), induisent une élévation transitoire de la [Ca2+]mplus faible que l’élévation observable dans le cytosol, alors que dans le cas du H2O2, l’élévation est tout aussi forte et soutenue que l’élévation cytosolique (Logan et Knight, 2003). Fait intéressant, le H2O2est justement le plus susceptible des stress testés à conduire à la PCD. D’ailleurs, la sortie du cyt c des mitochondries vers le cytosol a été rapportée dernièrement chez des plantes accumulant plus de H2O2dû à une faible activité catalase (Dat et al. , 2003) ou dans des cultures cellulaires exposées à une source de H2O2et générant ainsi un stress oxydatif constant (Tiwari et al. , 2002). En fait, la sortie du cyt c des mitochondries vers le cytosol dans diverses situations de PCD végétale a été rapportée par plusieurs équipes au cours des dernières années (Balk et al. , 1999; Stein et Hansen, 1999; Sun et al. , 1999; Hansen, 2000; Xie et Chen, 2000; Balk et Leaver, 2001; Chiandussi et al. , 2002; Curtis et Wolpert, 2002; Robson et Vanlerberghe, 2002; Virolainen et al. , 2002; Yao et al. , 2002; Yu et al. , 2002; Carimi et al. , 2003; Kim et al. , 2003; Pasqualini et al. , 2003; Krause et Durner, 2004; Thomas et Franklin-Tong, 2004; Yao et al. , 2004; Zuppini et al. , 2004). Cependant, cette sortie n’a pas pu être observée dans le cas de la sénescence des pétales de pétunia (Xu et Hanson, 2000) ou de la PCD induite par un apport exogène de protoporphyrine IX à des protoplastes d’ Arabidopsis (Yao et al. , 2004), de sorte que l’importance de cet événement dans l’induction de la PCD végétale est encore l’objet de débats.

Bien que la plupart de ces études ayant vérifié la sortie du cyt c des mitochondries ont pu démontrer qu’il s’agissait d’un événement précoce dans le cours de la PCD (mais pas toutes; voir entre autres Yao et al. , 2004), un effet direct sur d’autres événements en aval n’a habituellement pas été testé. De même, l’implication du Ca2+dans cette sortie n’est que spéculative. Quelques études font cependant exception. En effet, dans le cas de la SI chez le pollen, la sortie du cyt c débute quelques minutes à peine après le contact entre le pollen et la protéine incompatible du stigma, et se poursuit pour atteindre une sortie maximale entre 60 et 120 minutes après le contact (Thomas et Franklin-Tong, 2004). L’induction de la sortie du Ca2+du RE par le mastoparan (qui stimule la production d’IP3) induirait le même effet, atteignant un maximum en 5 minutes. Le mastoparan stimule aussi le clivage de la PARP et l’inhibition de l’influx initial de Ca2+dans le cytosol inhibe considérablement le clivage (Thomas et Franklin-Tong, 2004). Malheureusement, l’effet de l’inhibition de l’influx initial de Ca2+dans le cytosol sur la sortie du cyt c n’a pas été rapporté, mais l’ensemble des données indique clairement un rôle pour le Ca2+dans ce type de PCD.

L’autre étude ayant spécifiquement tenté d’établir un lien entre l’augmentation de la [Ca2+]c, la sortie du cyt c et l’induction de la PCD a pris pour modèle un autre cas de PCD développementale, soit la différenciation des TE (Yu et al. , 2002). En effet, dans ce modèle, l’exécution de la PCD à l’étape de la désintégration de la vacuole nécessite un influx de Ca2+(Groover et Jones, 1999). La sortie du cyt c et d’autres modifications des propriétés des mitochondries, telles que des changements ultrastructuraux au niveau de l’organisation de la membrane interne et sa dépolarisation [dissipation de la différence de potentiel membranaire mitochondrial (Δψm)], précèdent la rupture de la vacuole et il est plausible que ces événements conduisent à la PCD (Yu et al. , 2002). Cependant, l’induction artificielle de la sortie du cyt c par l’acide bétulinique, qui provoque la dissipation du Δψmet conséquemment la PCD, n’a pu être inhibée par l’action de la cyclosporine A, qui bloque l’action de l’acide bétulinique en empêchant la formation du PTP, et ce malgré l’inhibition de la PCD. Il a donc été conclu que les mitochondries sont impliquées dans la PCD des TE, mais que la sortie du cyt c est insuffisante pour induire la PCD dans ces cellules (Yu et al. , 2002). Cette conclusion va dans le même sens que celle résultant de l’étude de Yao et collaborateurs (2004), où des protoplastes d’ A. thaliana ont été utilisés pour tester trois inducteurs différents de la PCD. Une dissipation du Δψma été observée dans tous les cas, alors qu’un seul des trois inducteurs a conduit à la sortie du cyt c .

Plusieurs autres études ont également évalué la possibilité de la dissipation du Δψmou l’ouverture du PTP au cours de la PCD végétale, en corrélation ou non avec la sortie du cyt c (Curtis et Wolpert, 2002; Maxwell et al. , 2002; Saviani et al. , 2002; Curtis et Wolpert, 2004; Krause et Durner, 2004; Yao et al. , 2004). Dans la plupart des cas, une relation de cause à effet a pu être établie entre l’altération de l’intégrité mitochondriale et l’occurrence de la PCD ou certains événements y étant associés. Par exemple, Maxwell et collaborateurs (2002) ont identifié un certain nombre de gènes (dont celui codant pour l’AOX) étant rapidement induits suite au traitement de cultures cellulaires de tabac avec l’antimycine A (AA), un inhibiteur de la chaîne de transport des électrons (et conséquemment inducteur de la PCD). Or, ces gènes sont aussi induits par le H2O2et l’AS, qui similairement à l’AA, affectent les fonctions mitochondriales telles que la respiration et la production d’ATP. Considérant que le prétraitement des cellules avec un autre inhibiteur du PTP, l’acide bongkrekique, bloque complètement l’induction des gènes candidats, il est probable que l’ouverture du PTP mitochondrial soit impliquée dans la transduction de signal par ces inducteurs de la PCD.

Fait intéressant, des mutants présentant une stérilité mâle, i.e. ne produisant pas de pollen viable, présentent en fait une PCD prématurée du tapetum (voir section 1.4.1.2), associée à une intense vacuolisation du cytoplasme (Balk et Leaver, 2001; Ku et al. , 2003). Plusieurs de ces mutants ( cytoplasmic male sterility ) résultent d’un réarrangement de l’ADN mitochondrial créant un nouveau gène qui code pour une petite protéine de 13 kDa (UFR13), qui entraînerait un mal fonctionnement mitochondrial via la formation de pores. Les cellules du tapetum seraient particulièrement sensibles à cette mutation due à la demande énergétique extraordinaire requise pour les premières étapes de la formation du pollen. En effet, le nombre de mitochondries dans les cellules du tapetum et du tissu sporogène augmente de 20 à 40 fois chez le maïs (revu par Wu et Cheung, 2000). Or, la sortie du cyt c des mitochondries vers le cytosol précède les changements morphologiques associés à cette PCD ainsi que la perte de l’intégrité de la MME et les fonctions respiratoires (Balk et Leaver, 2001).

Notons également l’existence d’homologues végétaux du VDAC (un autre candidat potentiel pour le passage du cyt c à travers la MME), dont un homologue d’ A. thaliana qui est rapidement induit au cours de la HR (Lacomme et Roby, 1999). Similairement, le VDAC est induit au niveau protéique (mais pas au niveau du messager) dans le cours de la sénescence naturelle ou de la PCD déclenchée par un choc thermique dans des suspensions d’ A. thaliana (Swidzinski et al. , 2002; Swidzinski et al. , 2004). De plus, un homologue du VDAC isolé du riz est capable d’induire l’apoptose lorsque surexprimé dans des cellules animales et cette mort peut être partiellement bloquée par la co-expression de Bcl-2 ou par un inhibiteur du VDAC (Godbole et al. , 2003). Ces auteurs ont également rapporté que ce même inhibiteur ainsi que la cyclosporine A, qui bloque la formation du PTP, ont permis d’inhiber la PCD induite par un stress thermique dans des cotylédons de concombre (Godbole et al. , 2003). La régulation transcriptionnelle ou post-transcriptionnelle du VDAC au cours de différents types de PCD suggère donc un rôle ubiquitaire de cette protéine dans la PCD végétale.

Bien que beaucoup d’études aient analysé les variations de la [Ca2+]cchez les végétaux en réponse à différents stimuli, la plupart d’entre elles ont détecté des influx de Ca2+en provenance de l’apoplaste et nous ne connaissons pas grand-chose de la contribution possible et probable des compartiments internes aux modulations du Ca2+ c, à l’exception de la contribution de la vacuole (Allen et al. , 1995). Connaissant le rôle important que peut jouer le RE dans l’apoptose animale, il serait d’autant plus pertinent d’investiguer davantage de ce coté chez les végétaux, surtout considérant certaines évidences (dont nous venons de discuter) suggérant que le Ca2+peut perturber l’homéostasie mitochondriale chez les végétaux (voir entre autres Thomas et Franklin-Tong, 2004) et que l’inhibition du PTP inhibe ou diminue la PCD. Fait intéressant, l’inhibition de la pompe Ca2+/ATPase du RE par l’acide cyclopiazonique dans des suspensions cellulaires de soya entraîne une augmentation de la [Ca2+]cet la PCD (Zuppini et al. , 2004). Malheureusement, l’analyse d’un effet potentiel sur les mitochondries a été restreinte à l’évaluation de la sortie du cyt c , et ce après 24 h, ce qui est beaucoup trop tard pour évaluer le rôle potentiel du cyt c dans ce type de PCD.

Par ailleurs, l’étude des flux de Ca2+générés par des stress osmotiques chez l’algue marine Fuccus serratus a aussi fourni des informations fort intéressantes sur la participation du RE dans la signalisation par le Ca2+(voir la revue de Ng et McAinsh, 2003). En effet, suite à un stress hypoosmotique, une vague de Ca2+est dérivée des compartiments internes et provient spécifiquement du RE, ce qui est incontestable considérant que les cellules utilisées pour l’études sont dépourvues de vacuoles (embryons au stade de deux cellules; Goddard et al. , 2000). D’autre part, un stress hyperosmotique dans ces même cellules génère d’abord un influx de Ca2+vers le cytosol en provenance de l’apoplaste et la production de H2O2dans l’apoplaste est nécessaire à cet influx (Coelho et al. , 2002). À ce sujet, il a d’ailleurs été démontré que la génération de ROS dans l’apoplaste par la NADPH oxydase peut entraîner l’ouverture de canaux à Ca2+au niveau de la membrane plasmique (plus particulièrement des non selective cation channels ; Foreman et al. , 2003). Une seconde vague de ROS est ensuite générée au niveau intracellulaire, plus spécifiquement à partir des mitochondries, et dépend de l’augmentation initiale de la [Ca2+]c. Bien que l’intégrité des mitochondries n’ait pas été évaluée (de toute façon on ne parle pas ici d’un stress conduisant à la PCD), celles-ci accumulent du Ca2+et la sortie de Ca2+du RE stimulée artificiellement par l’IP3est suffisante pour entraîner la production de ROS par les mitochondries (Coelho et al. , 2002). Il est donc probable que suite à l’augmentation de la [Ca2+]c, l’accumulation de Ca2+par les mitochondries conduise à la production de ROS, mais il n’est pas clair si une seconde vague de Ca2+généré par le RE est impliquée ou si le Ca2+ne provient que de l’apoplaste.

L’ensemble de ces données constitue donc un plaidoyer convainquant en faveur de l’implication chez les végétaux des mitochondries dans la signalisation par le Ca2+, y compris l’induction de la PCD. Il semble effectivement que similairement aux animaux, la dissipation du Δψm via l’ouverture d’un PTP puisse être impliquée, et l’accumulation de Ca2+pourrait aussi être impliquée dans certains cas. En combinant ces données à la présence d’activités nucléases dans l’espace intermembranaire mitochondrial pouvant générer des fragments internucléosomaux de l’ADN nucléaire (voir section 1.4.3.3), nous obtenons alors un portrait ressemblant de plus en plus à la PCD animale. Mais une question demeure cependant : y a-t-il des caspases végétales?

Chez les végétaux comme chez les animaux, le démantèlement cellulaire associé à la PCD fait appel à des enzymes hydrolytiques telles que des protéases et des nucléases. Alors que chez les animaux, les fonctions protéolytiques sont en grande partie (mais pas exclusivement) attribuées aux caspases, dont les membres peuvent avoir des fonctions de régulation et d’exécution, les génomes végétaux n’en ont révélé aucun homologue de séquence, bien que cela n’exclue pas la présence d’homologues de fonction. En effet, on ne compte plus le nombre de publications ayant rapporté la détection d’activités caspase-like (en utilisant des substrats synthétiques des caspases animales) ou l’inhibition partielle jusqu'à quasi complète de la PCD en utilisant des inhibiteurs de caspases (voir les revues de Lam et del Pozo, 2000; van der Hoorn et Jones, 2004). Bien que ces données doivent être interprétées avec précaution dû à une non-spécificité potentielle (entre autres les inhibiteurs généralement utilisés peuvent inhiber des cystéine protéases de type papaïne; van der Hoorn et Jones, 2004), il n’en demeure pas moins qu’elles peuvent être révélatrices de la présence de certains homologues fonctionnels. Certains travaux récents ont notamment permis quelques avancées fort intéressantes à ce sujet, dont nous traiterons dans cette section.

Notons d’abord que les végétaux contiennent dans leurs génomes des centaines de gènes codant pour des protéases (au moins 488 chez Arabidopsis ), celles-ci étant subdivisées en fonction de leur spécificité catalytique. On retrouve donc des sérine, aspartique, cystéine, metallo et thréonine protéases (van der Hoorn et Jones, 2004). De façon générale, ce sont surtout les sérine et cystéine protéases qui sont associées à la PCD végétale (Lam et del Pozo, 2000). Cependant, la majorité des études ont analysé soit la modulation de l’accumulation d’ARNm codant pour des protéases au cours des différentes étapes de la PCD, soit l’évolution d’activités caspase-like dans des extraits protéiques plus ou moins purifiés, soit l’inhibition de la PCD par des inhibiteurs de caspases. Dans les deux derniers cas, l’identité de la ou des protéases impliquées est complètement inconnue, et dans le premier cas, seule l’accumulation de l’ARNm (et non de la protéine) est connue, ignorant tout de sa véritable activité protéolytique.

Malgré tout, quelques études ayant fait appel à des inhibiteurs de caspases moins conventionnels méritent d’être mentionnées. D’abord, deux études ayant utilisé un inhibiteur naturel des caspases, la protéine p35 du baculovirus, ont démontré d’une part que cette protéine inhibe la PCD de type HR induite par le virus de la mosaïque du tabac (TMV) ou une mycotoxine, ce qui n’était pas possible avec des mutants de la protéine connus pour être non-fonctionnels, et d’autre part confère une résistance à large spectre envers différents pathogènes (del Pozo et Lam, 2003; Lincoln et al. , 2002). Cet inhibiteur présente un intérêt particulier puisqu’il inhibe pratiquement toutes les caspases animales mais n’interagit pas avec d’autres protéases comme les papaïnes. De même, une protéine de virulence de la bactérie pathogène Agrobacterium tumefaciens , VirD2, possède 2 sites pouvant être spécifiquement clivés par la caspase-3 humaine. Or, le clivage à l’un des deux sites a pu être détecté assez tôt dans le cours de la HR induite par le TMV chez le tabac et l’identification de ce site a conduit au développement d’un inhibiteur spécifique qui retarde la HR in vivo (Chichkova et al. , 2004). La protéase responsable de l’activité caspase-like à partir de ce substrat n’a cependant pas encore été identifiée.

D’autres études ont toutefois mené à une caractérisation plus poussée des enzymes responsables des activités protéolytiques détectées dans le cours de la PCD. Par exemple, une cystéine endopeptidase (CysEP) est retrouvée dans un organite spécial, le ricinosome (initialement identifié chez Ricinus communis L., appelé ricin ou castor bean ), qui s’accumule dans l’endosperme entourant les cotylédons chez les plantes dicotylédones au cours de la germination (voir la revue de Gietl et Schmid, 2001). En effet, chez le ricin, l’endosperme est encore vivant dans la graine et ses réserves (relativement faibles comparées à celles des énormes cotylédons de l’embryon) sont mobilisées dans les premiers jours de la germination au profit de l’embryon. La CysEP s’accumule dans le ricinosome sous une forme inactive nécessitant le clivage d’un domaine en N-terminal pour son activation, rappelant étrangement le cas des caspases animales (voir section 1.3.2). L’activation de l’enzyme se fait possiblement par autocatalyse en conditions acides et la désintégration des ricinosomes coïncide avec la phase de fragmentation de l’ADN. Grâce à une spécificité de substrat assez large, la CysEP contribuerait au recyclage du contenu cytoplasmique au profit de l’embryon dans les dernières phases de la PCD (Than et al. , 2004).

D’autre part, une cystéine protéase appartenant au sous-groupe des vacuolar processing enzymes (VPE) a été originellement identifiée à cause de son implication dans la maturation des protéines d’entreposage retrouvées dans les graines. Cependant, cette enzyme est également particulièrement abondante dans les feuilles en sénescence, est induite par des blessures, l’AS et pendant la HR induite par le TMV (van der Hoorn et Jones, 2004; Hatsugai et al. , 2004). De plus, bien que ne présentant pas d’homologie de séquence avec les caspases, le site actif des VPE et probablement le repliement protéique ressemblent à ceux des caspases (van der Hoorn et Jones, 2004). Une VPE présentant une activité caspase-1 s’est aussi avérée essentielle à l’exécution de la HR induite par le TMV (Hatsugai et al. , 2004). Deux autres protéases possédant des activités caspase-like et impliquées dans la PCD induite par la victorine, une toxine fongique, ont été purifiées et caractérisées du point de vue de leur activité catalytique. Fait intéressant, les enzymes purifiées sont en fait des sérine protéases, probablement impliquées dans une cascade de signalisation impliquant d’autres protéases (Coffeen et Wolpert, 2004).

Finalement, les métacaspases et les paracaspases sont deux familles distinctes de cystéines protéases apparentées aux caspases ( caspases-like ) ayant été identifiées il y a quelques années à peine par des analyses informatiques à travers les génomes de différents règnes (Uren et al. , 2000). Les paracaspases ont été identifiées chez les animaux et Dictyostelium , alors que les métacaspases, apparamment exclues du règne animal, ont été trouvées chez les végétaux, les champignons et les protozoaires. Les métacaspases sont donc considérées par plusieurs comme des candidats potentiels à l’exécution de la PCD chez les végétaux. Leur homologie avec les caspases animales n’est pas restreinte à une certaine identité de séquence du domaine catalytique, mais s’étend aussi à la structure secondaire (principalement le repliement caspase-hémoglobinase; Uren et al. , 2000). La métacaspase retrouvée chez S. cerevisiae , nommée YCA1, est impliquée chez cet organisme dans la PCD induite par le H2O2, l’acide acétique, le viellissement (Madeo et al. , 2002) et l’absence d’une enzyme de désubiquitination (Bettiga et al. , 2004). De plus, la protéine possède non seulement des homologies de structure avec les caspases animales mais aussi certaines homologies de fonction, étant dotée d’une spécificité de substrat similaire aux caspases initiatrices. Une autre métacaspase présente chez le protozoaire Trypanosoma brucei cause une inhibition de la croissance, des dysfonctions mitochondriales et la mort lorsque surexprimée chez la levure (Szallies et al. , 2002).

Chez les végétaux, les métacaspases peuvent être subdivisées en deux catégories : le type I (trois gènes chez Arabidopsis ), contenant un pro-domaine putatif en N-terminal, et le type II (six gènes chez Arabidopsis ), ne contenant apparemment pas de pro-domaine mais plutôt une extension d’environ 180 acides aminés en C-terminal entre les sous-unités putative p20 et p10 (Uren et al. , 2000; Watanabe et Lam, 2004; Vercammen et al. , 2004). Il est intrigant que plusieurs métacaspases de type I possèdent aussi dans leur pro-domaine des motifs doigt de zinc ressemblant à ceux de la protéine LSD1, un inhibiteur de la HR agissant possiblement comme facteur de transcription (Uren et al. , 2000; Dietrich et al. , 1997).

Certains travaux récents ont démontré pour la première fois l’implication d’une activité caspase-like d’une métacaspase dans la PCD développementale chez les végétaux (gymnospermes). En effet, une activité caspase-like détectée très tôt durant l’embryogenèse chez l’épinette de Norvège a la même spécificité de substrat que la métacaspase YCA1 de la levure et son inhibition compromet la formation de l’embryon (Bozhkov et al. , 2004). La même équipe a cloné un gène correspondant à une métacaspase de type II dont l’accumulation du messager coïncide avec les tissus destinés à mourir (Suarez et al. , 2004). L’inhibition de l’expression de la protéine par interférence de l’ARN ( RNAi ) a permis de diminuer considérablement l’activité caspase-like détectée auparavant et d’abolir complètement la différenciation en embryon, démontrant la nécessité fondamentale de cette métacaspase végétale dans l’embryogenèse de l’épinette, et ce dès les premiers stades du développement (Suarez et al. , 2004). Chez les angiospermes, le niveau d’ARNm d’une métacaspase de type II chez la tomate augmente au cours d’une infection par le champignon pathogène nécrotrophe Botrytis cinerea , mais pas au cours de la PCD induite par la campthothécine ou la fumonisine B1 dans des cultures cellulaires (Hoeberichts et al. , 2003). L’expression dans E. coli des gènes codant pour les métacaspases de type II d’ Arabidopsis entraîne l’autoprotéolyse des protéines ainsi exprimées, similairement aux caspases animales, résultant en une petite et une grande sous-unités. Cependant, contrairement à la métacaspase caractérisée chez l’épinette de Norvège, les métacaspases 4 et 9 d’ Arabidopsis ne clivent aucun des substrats spécifiques aux caspases (préférant des résidus arginine ou lysine), suggérant que les métacaspases de type II (à tout le moins les deux étudiées) ne sont pas directement responsables des activités caspase-like chez Arabidopsis (Vercammen et al. , 2004). L’ensemble de ces travaux démontre toutefois que les métacaspases peuvent non seulement avoir une activité protéolytique, mais aussi que dans certains cas leur spécificité peut être similaire à certaines caspases animales. Ces informations fort excitantes ouvrent la voie à la découverte de sentiers de signalisation et d’exécution par des protéases dans la PCD végétale.

Chez les animaux, l’activation des caspases dépend d’une étroite surveillance par les membres de la famille Bcl-2, lesquels sont apparemment absents du règne végétal, y compris S. cerevisiae (Lam, 2004; Aravind et al. , 2001). Comme il semble de plus en plus évident que certaines protéases végétales, y compris des métacaspases ou d’autres protéases pourvues d’activité caspase-like , pourraient être la contrepartie végétale des caspases animales, peut-être devrons-nous s’armer d’un peu plus de patience et fouiller plus attentivement les génomes végétaux pour y dénicher des homologues structuraux, à défaut d’homologues de séquences, des membres de la famille Bcl-2.

En attendant, nous sommes devant le constat que malgré l’évidence selon laquelle les plantes ont développé des stratégies qui leur sont propres afin de réguler le sort de leurs cellules, la plupart semblent spécifiques à un type particulier de PCD. Ainsi, l’étude la PCD de type HR a révélé bon nombre de régulateurs positifs ou négatifs, essentiellement via la caractérisation de mutants. Par exemple, les régulateurs négatifs LSD1 et MLO semblent conservés parmi les monocotylédones et les dicotylédones (Lam, 2004; Hoeberichts et Woltering, 2003; Lorrain et al. , 2003). Cependant, jusqu’à présent, aucun régulateur ne semble ubiquitaire à toutes les formes de PCD.

Mentionnons cependant le cas de l’une des familles de gènes R (qui sont impliqués dans la HR; voir section 1.4.1.8), nommée NB-LRR, qui code pour des protéines généralement cytoplasmiques composées d’un domaine de liaison de nucléotides ( nucleotide binding ; NB) et d’un domaine contenant des répétitions riches en leucine ( leucine-rich repeats ; LRR). Des motifs présents dans la région NB présentent des similarités avec Apaf-1, une protéine impliquée dans la formation de l’apoptosome chez les mammifères (voir section 1.3.4), et sa contrepartie chez C. elegans , CED-4 (Van der Biezen et Jones, 1998). Cette région est nommée domaine AP-ATPase et est aussi retrouvée chez plusieurs protéines putatives procaryotes (dont les fonctions sont inconnues), ce qui suggère une origine évolutive ancienne (Aravind et al. , 1999; Koonin et Aravind, 2002). La signification fonctionnelle de cette homologie n’est toujours pas claire, mais il se trouve que le génome d’ Arabidopsis contient environ 150 séquences avec une homologie aux NB-LRR, dénotant l’importance potentielle de ce motif chez les végétaux. La famille des NB-LRR est divisée en deux classes selon leur extrémité N-terminale, dont l’une possède un domaine similaire aux domaines cytoplasmiques des récepteurs Toll et interleukine-1 (TIR) de la drosophile et des mammifères. Les TIR-NB-LRR ressemblent structurellement aux TLR ( Toll-like receptor ) impliqués dans l’immunité innée des mammifères et de la drosophile. La spécificité des produits des gènes R envers le produit d’un gène d’avirulence d’un pathogène donné semble venir du domaine LRR, dont les régions exposées (hydrophiles) sont hypervariables, rappelant encore le système immunitaire (Shirasu et Schulze-Lefert, 2000; Dangl et Jones, 2001). Même si la signification de ces similitudes avec les animaux demeure inconnue (le mode d’action des produits des gènes R n’est même pas encore connu), elles témoignent de la conservation évolutive de certains domaines appartenant à des protéines associées de près ou de loin à la PCD.

Bien que les membres de la famille Bcl-2 soient absentes du règne végétal, leur expression ectopique chez les plantes semble conférer un phénotype de survie ou de mort dépendant de la nature du transgène. En effet, l’expression chez le tabac des protéines anti-apoptotiques Bcl-2, Bcl-XL et Ced-9 peut retarder ou même inhiber la HR induite par différents pathogènes nécrotrophes. Cette expression peut compromettre la PCD induite par une panoplie de stress abiotiques comme le H2O2, le NaCl, des chocs de température, des UV et des herbicides dont le paraquat, qui entrave la translocation des protons à travers la membrane des thylakoïdes et induit donc la production de ROS et une baisse de la production d’ATP (Mitsuhara et al. , 1999; Dickman et al. , 2001; Qiao et al. , 2002; Li et Dickman, 2004; Chen et Dickman, 2004). D’autre part, l’expression localisée de la protéine pro-apoptotique Bax entraîne la production de lésions simulant la HR (Lacomme et Santa Cruz, 1999) ou entraîne l’arrêt de croissance et la dégénérescence lorsqu’exprimée dans des protoplastes ou dans des plantes entières de façon inductible (Kawai-Yamada et al. , 2001; Baek et al. , 2004). Similairement à ce que l’on retrouve chez les mammifères, une localisation de Bax dans les mitochondries végétales est nécessaire à l’induction de la HR (Lacomme et Santa Cruz, 1999; Baek et al. , 2004). Fait intéressant, la co-expression d’une glutathione-dependent phospholipid hydroperoxide peroxidase d’origine végétale permet de réduire considérablement les effets de Bax, autant dans des feuilles de tabac que dans la levure (Chen et al. , 2004), suggérant que le mode d’action de Bax dans les cellules végétales est relié à des excès dans la génération des ROS. Similairement, l’action de Bax dans des protoplastes d’ Arabidopsis ou chez la levure est atténuée par la surexpression de la nucleoside diphosphate kinase 2 (AtNDPK2 ; Baek et al. , 2004), une protéine impliquée dans le contrôle du potentiel d’oxydo-réduction cellulaire (Moon et al. , 2003). De façon générale, l’ensemble de ces observations suggère donc que les membres de la famille Bcl-2 peuvent interférer avec un ou plusieurs sentiers de signalisation « apoptotiques » végétaux conservés dans l’évolution.

Le gène DAD1 a été initialement isolé à partir d’une lignée cellulaire de hamster mutante sensible à la température, c’est-à-dire que les cellules devenaient apoptotiques lorsqu’incubées à une température non-permissive, et a la capacité d’inhiber la PCD développementale chez C. elegans (Sugimoto et al. , 1995). Des homologues végétaux de DAD1 ont été clonés de différents organismes (van der Kop et al. , 2003;Hoeberichts et al. , 2001; Lindholm et al. , 2000; Dong et al. , 1998), et bien que dans certains cas une modeste diminution ou augmentation de l’accumulation de l’ARNm soit observée durant la PCD, des données quelque peu contradictoires d’une étude à l’autre et surtout plutôt limitées ne permettent pas de conclure quoi que ce soit quant à la fonction putative de ce gène dans la PCD végétale.Cependant, le gène semble fonctionnellement conservé entre animaux et végétaux puisque l’homologue d’ Arabidopsis est aussi efficace que l’homologue humain pour complémenter la lignée mutante de cellules de hamster (Gallois et al. , 1997). La protéine Dad1 est en fait une sous-unité essentielle de l’oligosaccharyl transférase des mammifères, un complexe enzymatique impliqué dans la glycosylation et localisé au niveau du RE (Kelleher et Gilmore, 1997; Makishima et al. , 1997). Elle fait donc partie de sentiers métaboliques importants et ne semble donc pas être spécifiquement impliquée dans la régulation de la PCD. Cependant, la surexpression de AtDad1 ou AtDad2 dans des protoplastes d’ Arabidospsis supprime la PCD induite par des radiations UV (Danon et al. , 2004), bien qu’il ne soit pas connu si cet effet est direct ou résulte indirectement de l’atténuation de stress au RE.

De façon très générale, le but de ce projet visait à établir une meilleure compréhension des mécanismes moléculaires conduisant à la PCD chez les végétaux et plus spécifiquement à identifier et caractériser des régulateurs de la PCD. La découverte de BI-1 d’origine animale et la conservation fonctionnelle de ses homologues végétaux dans l’essai chez la levure faisaient de BI-1 un sujet d’étude particulièrement attrayant. Partant de l’hypothèse que BI-1 aurait chez les végétaux une fonction anti-PCD similaire à celle retrouvée chez les animaux, les objectifs spécifiques à atteindre ont été divisés comme suit :

  • Cloner des homologues de BI-1 chez d’autres plantes et analyser leur structure secondaire putative;

  • Déterminer la localisation intracellulaire de BI-1 chez les végétaux et la levure;

  • Déterminer la fonctionnalité d’homologues végétaux de BI-1 chez les animaux;

  • Déterminer si BI-1 possède une activité anti-PCD intrinsèque chez les végétaux;

  • Élucider les mécanismes de régulation de BI-1 chez les végétaux.

Ces différents objectifs s’inscrivent dans une démarche visant ultimement à comprendre le mode d’action de BI-1 et à élucider le ou les sentier(s) de mort potentiellement conservé(s) dans l’évolution et dans lesquels cette protéine jouerait un rôle clé.

L’atteinte des objectifs que nous nous étions fixés est décrite dans trois manuscrits constituant les chapitres 2, 3 et 4 de la présente thèse. Plus spécifiquement, le chapitre 2 démontre l’accomplissement des trois premiers objectifs et décrit le clonage et la caractérisation de deux orthologues de BI-1 isolés du tabac (NtBI-1) et du canola (BnBI-1). Grâce à l’expression transitoire ou stable d’une protéine de fusion entre BnBI-1 et la green fluorescent protein (GFP), il a pu être déterminé que la protéine est associée aux membranes du RE autant chez les végétaux que chez la levure. De plus, l’inhibition de l’apoptose induite par Bax par des BI-1 végétaux dans un système cellulaire humain y est décrite.

Le chapitre 3 décrit l’atteinte du 4eobjectif. Plus précisément, il y est démontré que des lignées cellulaires de tabac présentant des niveaux inférieurs de la protéine NtBI-1 grâce à l’expression d’un ARNm antisens sont plus susceptibles envers une déficience en carbone et entament un programme précoce de PCD comparativement à des lignées contrôles. Ce chapitre met donc en évidence l’implication de BI-1 dans le contrôle de l’induction de la PCD au cours d’une réponse intrinsèque des cellules végétales envers des conditions de disette.

Le chapitre 4 présente quant à lui l’élucidation de certains mécanismes de régulation de BI-1, en réponse au 5eobjectif. La régulation de l’expression et de l’activité de la protéine est certainement complexe et méritera de plus amples investigations. Cependant, certains éléments forts intéressants sont décrits dans ce chapitre, telle que la modulation de l’expression de BI-1 par les cytokinines, et ce via des mécanismes post-transcriptionnels. De même, les effets potentiels de la modulation du Ca2+cytosolique sur l’accumulation de ce régulateur anti-PCD y sont explorés.

Finalement, le chapitre 5 présente une rétrospective critique de nos résultats en les confrontant à ceux obtenus parallèlement par d’autres équipes de recherche au fil des années. Par exemple, certaines équipes ont démontré la fonction anti-PCD de BI-1 chez les végétaux par d’autres moyens, essentiellement des modèles d’interaction plante-pathogène. Ce chapitre se veut donc une intégration générale de l’ensemble de la littérature pertinente aux objectifs de recherche que nous nous étions fixés.

Les chapitres 2, 3 et 4 ont leur propre bibliographie en fin de chapitre. Pour ce qui est des chapitres 1 et 5, la bibliographie complète se trouve à la fin de la thèse.

© Nathalie Bolduc, 2005