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Table des matières

Depuis la découverte que le gène humain TEGT , renommé BI-1 , inhibe la mort cellulaire induite par Bax et que ce gène est présent chez les végétaux, où Bax ou tout autre membre de la famille Bcl-2 sont pourtant absents, bien des pipettes ont été sollicitées et beaucoup d’encre a coulé au sein des biologistes végétaux dont les recherches sont consacrées à l’étude de la PCD, y compris notre laboratoire. L’étude de cette protéine est particulièrement excitante puisqu’il est fort probable qu’elle fasse partie d’un sentier de mort conservé dans l’évolution, nous permettant ainsi d’identifier les mécanismes de base de la PCD présents chez des eucaryotes ancestraux avant la divergence entre le règne animal et végétal. Nous tenterons ici d’intégrer toute l’information disponible à ce jour, incluant les données présentées dans cette thèse ainsi que certains résultats non publiés, pour tenter de dresser un portrait global du mode d’action de BI-1 chez les végétaux.

À l’époque où nous avons cloné BnBI-1 et NtBI-1 , le nombre de séquences de BI-1 végétaux était encore restreint, puisque seuls AtBI-1 et OsBI-1 avaient déjà été clonés, et la séquence d’un homologue de l’orge ( Hordeum vulgare , HvBI-1 ) est apparue quelques temps plus tard dans les banques de données. Nous avons donc profité de la disponibilité de ces cinq séquences pour tenter de dresser un portrait structural de BI-1, particulièrement les BI-1 végétaux.

Quelques faits intéressants et révélateurs se dégagent de cette analyse. D’abord, le caractère très hydrophobe des séquences protéiques, prédisant jusqu’à sept TM, la relègue sans surprise au rang de protéine membranaire intégrale. La position des domaines hydrophobes semble relativement bien conservée entre les animaux et les végétaux, bien que le 7eTM ne soit pas prédit chez les animaux. Chez les végétaux, l’hélice prédite correspondante est toutefois parsemée de résidus hydrophiles lui conférant un caractère amphipatique (voir section 2.2.5.1), et le fait qu’il s’agisse d’une portion transmembranaire n’a pas été prouvé expérimentalement, de sorte que le modèle présenté à la Figure 5-1 ne tient pas compte de la possibilité que la 7ehélice ne soit pas un TM. S’il ne s’agit pas d’un TM, le modèle devrait alors présenter les deux extrémités N- et C-terminales du côté cytoplasmique du RE, puisque nous avons montré que l’extrémité C-terminale est positionnée du coté cytoplasmique (voir Figure 2-5). De plus, cette portion de la protéine, qui demeure tout de même partiellement hydrophobe (tout comme dans les séquences animales), devrait néanmoins être stabilisée dans une quelconque interaction protéine-protéine.

La topologie tridimensionnelle de la protéine n’est pas illustrée puisqu’elle est totalement inconnue, mis à part l’orientation du C-terminal. Ce modèle est inspiré de la prédiction pour les BI-1 végétaux de sept TM tel qu’illustré à la Figure 2-1. Tiré de Ouellet (2004).

Certaines données indiquent cependant que l’extrémité C-terminale, bien conservée entre les deux règnes mais particulièrement au sein des végétaux, serait importante pour l’activité de la protéine. En effet, la délétion d’aussi peu que quatre acides aminés en C-terminal de la protéine abolit la protection conférée par BI-1 contre l’effet létal de Bax dans la levure (L. Poulin et L. Brisson, résultats non publiés). Des résultats similaires ont aussi été rapportés pour la délétion de toute la portion hydrophile du C-terminal (14 acides aminés), qui abolit l’effet protecteur de BI-1 contre Bax dans la levure, et ce autant pour un BI-1 d’origine végétale (Kawai-Yamada et al. , 2004) ou humaine (Chae et al. , 2003). De même, la protection conférée aux cellules végétales par BI-1 contre les stress générés par la présence de H2O2, d’AS ou du pro-apoptotique Bax nécessite la présence du C-terminal (Kawai-Yamada et al. , 2004). De plus, la structure super-enroulée du C-terminal est apparemment le facteur critique, puisque le remplacement de certains acides aminés de façon à abolir complètement l’enroulement abolit par le fait même l’activité anti-Bax de la protéine dans la levure (Kawai-Yamada et al. , 2004). Par ailleurs, la délétion de la portion N-terminale hydrophile de la protéine diminue mais n’abolit pas son action anti-Bax (Kawai-Yamada et al. , 2004). Ceci n’est pas surprenant considérant que cette portion de BI-1 est plus divergente, particulièrement entre les protéines d’origine animale et végétale (voir Figure 2-1), suggérant que ce domaine est moins important pour son activité, mais pourrait toutefois avoir une fonction différente et/ou supplémentaire chez les plantes, où cette région est plus longue. Cette idée est supportée par l’existence d’autres séquences plus ou moins éloignées de BI-1 chez Arabidopsis , dont les extrémités en N-terminal varient beaucoup par rapport à BI-1. Ces protéines pourraient ainsi constituer une classe de régulateurs de la PCD végétale (Lam et al. , 2001), mais les fonctions de ces homologues putatifs restent à être déterminées.

Au-delà de la conservation de la protéine entre les animaux et les végétaux, il semblerait que des séquences protéiques BI-1-like existent aussi chez les eucaryotes unicellulaires tels que S. cerevisiae , Plasmodium falciparum et Cryptosporidium parvum (Chae et al. , 2003), partageant de 29 à 35% d’identité avec BI-1 humain (Hückelhoven, 2004), ce qui se situe à peu près dans le même ordre de grandeur que les homologies retrouvées entre les séquences animales et végétales (identités de 26-28% par rapport à la protéine BI-1 de la drosophile, et 38-42% par rapport aux BI-1 des mammifères; voir section 2.2.5.1). Il y a aussi des séquences BI-1-like chez les procaryotes (Chae et al. , 2003), présentant en particulier un motif conservé chevauchant le 3eet 4eTM (Hückelhoven, 2004). Il y a même de telles séquences chez plusieurs virus (Chae et al. , 2003; Hückelhoven, 2004), suggérant que BI-1 aurait pu être corrompue au cours de l’évolution (tout comme Bcl-2; Takayama et al. , 1994) par des pathogènes de façon à reprogrammer la cellule hôte. Cependant, aucun homologue putatif n’a pu être identifié chez C. elegans (Chae et al. , 2003). Bien que ces homologues lointains ne partagent parfois que 15% d’identité avec BI-1 humain sur toute la longueur protéique, la structure des quatre hélicesαtransmembranaires du côté C-terminal y serait apparemment relativement conservée (Chae et al. , 2003). Reste à savoir si cette similarité structurale est suffisante pour que ces homologues puissent exercer un effet anti-Bax.

Au-delà des homologies de séquence entre les protéines BI-1 de diverses origines, la conservation de la structure protéique semble suffisamment grande pour permettre aux BI-1 provenant d’organismes évolutivement très distants d’exercer une fonction similaire. Cette fonction a été évaluée via la capacité des BI-1 candidats à inhiber la PCD induite par Bax, le plus souvent dans la levure S. cerevisiae , mais il est évident que cela ne constitue pas LA fonction de BI-1 in vivo . En effet, chez l’humain, des essais de co-précipitation des deux protéines n’ont pas permis la détection d’interaction protéine-protéine entre BI-1 et Bax (alors que BI-1 et Bcl-2 ont pu être co-précipités; Xu et Reed, 1998), ce qui en vérité aurait été douteux considérant que BI-1 se retrouve aussi chez des organismes où Bax est absent. Il est donc probable que Bax interfère (positivement) avec un sentier de mort commun aux animaux, à la levure et aux plantes, et dans lequel BI-1 interfère, au contraire, négativement. La vérification de l’action anti-Bax d’un candidat donné peut donc constituer un moyen efficace de vérifier sa capacité à exercer une action négative sur le sentier de mort en question.

Toute cette histoire d’action anti-Bax a donc commencé par la démonstration que BI-1 humain inhibe la PCD induite par Bax non seulement dans la levure, mais également dans des cellules humaines (Xu et Reed, 1998). Puis, il a été démontré que les homologues végétaux peuvent eux aussi exercer une fonction anti-Bax dans la levure (Kawai et al. , 1999; Sanchez et al. , 2000; Chae et al. , 2003), dans les cellules végétales (Kawai-Yamada et al. , 2001) et parallèlement nous avons démontré que leur action anti-Bax peut s’étendre jusque dans les cellules animales (cellules humaines HEK 293; voir section 2.2.5.2). Plus récemment, des homologues retrouvés chez S. cerevisiae et E. coli ont également exercé une certaine action anti-Bax, quoi que la qualité des résultats présentés est parfois douteuse (Chae et al. , 2003). Néanmoins, cette conservation fonctionnelle de BI-1 provenant d’organismes pourtant distants (et dépourvus de membres de la famille Bcl-2) indique non seulement que ce gène est relativement bien conservé dans l’évolution, mais aussi et surtout qu’il pourrait faire partie d’un sentier de mort dont l’origine évolutive serait très ancienne. Mais les BI-1 endogènes présents chez tous ces organismes ont-ils réellement une fonction anti-PCD dans leur contexte respectif?

Les travaux pionniers de Xu et Reed (Xu et Reed, 1998) ont permis de décrire BI-1 humain comme étant un régulateur négatif de la PCD (du moins dans les modèles de culture cellulaire testés, provenant tous de mammifères). Non seulement BI-1 est au moins aussi efficace que Bcl-2 pour protéger les cellules contre les effets létaux de Bax, mais également contre d’autres inducteurs de l’apoptose tels que l’étoposide et la staurosporine (qui interfèrent avec la prolifération cellulaire en inhibant respectivement la topoisomérase II et des protéines kinases), ainsi que l’absence de certains nutriments (en conditions procurées par la culture en l’absence de sérum fœtal) ou facteur de croissance (absence d’interleukine-3). Cependant, BI-1 est tout aussi inefficace que Bcl-2 pour inhiber l’apoptose induite via le récepteur Fas de la famille du TNF. Au-delà de la fonction anti-PCD de BI-1, ces données laissaient entendre que BI-1 peut s’insérer dans le même sentier que Bcl-2. En fait, il semble que tout comme Bcl-2, l’ARNm de BI-1 est particulièrement abondant dans certains cas de tumeurs malignes (Walter et al. , 1994; Jean et al. , 1999; Welsh et al. , 2001; Schmits et al. , 2002; van 't Veer et al. , 2002; Villalva et al. , 2002; Grzmil et al. , 2003), le désignant ainsi comme un régulateur de la mort cellulaire potentiellement impliqué dans la dérégulation de l’apoptose dans les cellules tumorales (Hückelhoven, 2004).

Du côté des végétaux, nous avons déjà mentionné que Kawai-Yamada et ses collaborateurs (2001) ont démontré que AtBI-1 inhibe les effets de Bax dans des cellules végétales. Cependant, même si les cellules ne sont pas des levures, il s’agit là du même test fonctionnel ayant recours à Bax. Nous fûmes donc les premiers à faire la démonstration de l’action anti-PCD d’une protéine BI-1 végétale dans le contexte d’une PCD végétale, soit l’accélération de la sénescence induite par une disette en sucrose (voir chapitre 3). Parallèlement, l’équipe de H. Matsumura (2003) a rapporté que la surexpression de BI-1 dans des cultures cellulaire de riz ( O. sativa L.) protège contre la mort induite par un éliciteur (β-glucans provenant de la paroi cellulaire) provenant du champignon pathogène Magnaporthe grisea , signifiant que BI-1 peut aussi conférer un effet protecteur contre la PCD induite par des stress biotiques. Plus récemment, il a pu être établi que la surexpression de BI-1 dans les cellules végétales protège aussi contre des stress induits par le H2O2, l’AS ou un choc thermique (Chae et al. , 2003; Kawai-Yamada et al. , 2004).

Au contraire, l’équipe de Hückelhoven (2003) nous a révélé que la surexpresion de BI-1 favorise la pénétration du champignon pathogène Blumeria graminis f. sp. hordei dans les cellules de l’épiderme de l’orge ( H. vulgare ). Bien que cela puisse paraître contradictoire par rapport aux données précédentes, elles vont en fait dans le même sens. En effet, en tant que champignon biotrophe, B. graminis requiert une cellule hôte vivante pour y pénétrer et s’y multiplier, de sorte que la plus grande efficacité de pénétration du pathogène conférée par la surexpression de BI-1 provient certainement de sa capacité à favoriser la survie de la cellule. D’ailleurs, les cultivars de l’orge n’exprimant pas Mlo, un régulateur négatif de la PCD, sont résistants à ce champignon, mais la surexpression de BI-1 rétablit leur susceptibilité envers le pathogène (Hückelhoven et al. , 2003). De même, il semble que cet effet puisse être à large spectre, puisque la surexpression de BI-1 atténue aussi les barrières de l’hôte contre la pénétration du pathogène inapproprié (i.e. contre lequel l’orge est habituellement immunisé) B. graminis f. sp. tritici , dont l’hôte naturel est plutôt le blé (Eichmann et al. , 2004). L’ensemble de ces données démontre donc sans conteste que BI-1 agit en tant que régulateur négatif de la PCD végétale.

Au-delà des mammifères et des plantes, il semblerait que la protéine BI-1 retrouvée chez S. cerevisiae puisse aussi protéger cet eucaryote unicellulaire contre la mort induite par le H2O2ou un choc thermique (Chae et al. , 2003). Il apparaît donc que de façon générale, la présence de BI-1 chez un organisme donné puisse lui conférer un effet protecteur contre la PCD. Il sera particulièrement intéressant de vérifier si les protéines BI-1 putatives retrouvées chez certains protozoaires peuvent aussi conférer chez ces eucaryotes inférieurs un effet protecteur contre différents stress.

Dans les cellules végétales, il semble que BI-1 puisse être induit (au niveau de l’ARNm) par un éventail assez large de stress conduisant ou non à la PCD. Ainsi, des accumulations accrues de l’ARNm ont été induites par des blessures, des pathogènes virulents ou avirulents, et même des pathogènes incompatibles tels que E. coli (Sanchez et al. , 2000; Hückelhoven et al. , 2001; Hückelhoven et al. , 2003; Matsumura et al. , 2003; Xu et al. , 2003; nos résultats non publiés). Des observations similaires ont également été obtenues par l’utilisation de composés favorisant des stress oxydatifs tels que le H2O2et l’AS (Kawai-Yamada et al. , 2004), des stress induits par des niveaux toxiques de CK (section 4.2.5.3) ou par un choc thermique (Swidzinski et al. , 2002). L’augmentation de l’accumulation de l’ARNm de BI-1 chez les végétaux peut donc survenir autant suite à des stress biotiques que suite à des stress abiotiques.

L’induction de la transcription de BI-1 (ou la stabilisation de son ARNm) confère probablement une certaine protection contre ces stress, en particulier les stress biotiques où la surexpression de BI-1 permet effectivement d’augmenter la survie cellulaire face à certains pathogènes (Hückelhoven et al. , 2003; Matsumura et al. , 2003). Il est donc probable que BI-1 soit impliquée dans la restriction de la propagation des lésions dans le cours de la HR et dans la survie induite par les champignons biotrophes [voir les travaux de Hückelhoven (2003) décrits plus haut]. De même, nous avons observé une augmentation de l’accumulation de BI-1 au niveau protéique dans des cultures de tabac stressées par un apport exogène de CK (section 4.2.5.2). Le profil temporaire ou soutenu de l’augmentation en fonction de l’intensité du stress suggère fortement que l’induction de BI-1 contribue à la survie des cellules. Cependant, il est également possible que dans certains cas, l’augmentation « naturelle » de l’accumulation de l’ARNm de BI-1 par un stress donné n’ait pas d’effet sur la viabilité cellulaire, même si la surexpression de BI-1 via un transgène puisse conférer une protection contre ces mêmes stress. Par exemple, une augmentation de l’accumulation du messager de BI-1 et de d’autres gènes de défense chez Lycopersicon esculentum (tomate) n’empêche pas les plantes de succomber à l’assaut concerté du cucumber mosaic virus et de son ARN satellite D (Xu et al. , 2003), bien qu’il n’ait pas été testé si la surexpression de BI-1 aurait pu avoir un effet protecteur. D’autre part, bien que l’accumulation du messager de BI-1 soit augmentée en présence de doses toxiques de H2O2et d’AS ou par un choc thermique dans les cultures cellulaires, celles-ci succombent tout de même à ces traitements (Swidzinski et al. , 2002; Kawai-Yamada et al. , 2004). Similairement, nous avons observé que l’accumulation du messager de NtBI-1 est augmentée face à des doses toxiques de CK dans des cultures cellulaires ou au cours de la HR chez le tabac en réponse au TMV, tous deux conduisant pourtant à une mort rapide (chapitre 4). Au contraire, un éliciteur fongique entraîne une diminution de l’ARNm OsBI-1 dans des suspensions de riz (Matsumura et al. , 2003). Il est donc possible que dans certaines situations de PCD, plusieurs réponses antagonistes soient activées parallèlement, conduisant à la fois à l’activation de sentiers de mort et de survie. La mort survenant très rapidement, les mécanismes de survie (dont une augmentation de l’accumulation de la protéine BI-1) s’avèrent inefficaces, possiblement parce qu’ils ne sont pas activés assez rapidement. Au contraire, une expression constitutive plus élevée de la protéine BI-1 au moment où survient le stress peut s’avérer suffisante pour bloquer l’induction de la PCD, similairement à la défense immunitaire acquise des mammifères, où le niveau élevé d’anticorps envers un pathogène ayant déjà été rencontré prévient toute invasion ultérieure par ce pathogène.

Dans le cadre de notre étude portant sur l’induction de NtBI-1 par les CK, nous avons tenté de corréler l’expression du messager avec celle de la protéine. Or, nous avons observé que le messager est induit seulement à des concentrations toxiques, où l’induction de la protéine est peu ou pas détectable. Pourtant, la protéine est bel et bien surexprimée à des concentrations non toxiques mais suffisantes pour induire un stress (évalué par l’accumulation de l’ARNm PR1a et l’arrêt de croissance; voir section suivante). Nous avons voulu vérifier si une situation semblable se produisait dans le cas de l’AS, dont les effets sur BI-1 semblent contradictoires. En effet, le traitement de plantules d’orge avec un analogue de l’AS pouvant induire la résistance envers les pathogènes (effet non toxique) a entraîné une diminution de l’accumulation de l’ARNm HvBI-1 (Hückelhoven et al. , 2003), alors que dans des cellules de tabac en culture, une dose d’AS non toxique mais suffisante pour induire l’accumulation de l’ARNm PR1a n’influence pas l’accumulation du messager ni de la protéine NtBI-1 (chapitre 4). Au contraire, une dose toxique induit le messager (Kawai-Yamada et al. , 2004), que nous avons difficilement pu corréler avec une augmentation de la protéine (section 4.2.5.1). Même son de cloche du côté du H2O2, qui permet une certaine induction du messager dans des cultures cellulaires (Kawai-Yamada et al. , 2004), mais notre analyse de l’accumulation de la protéine n’a révélé que sa disparition, conjointement avec la mort cellulaire. Finalement, nous n’avons pas réussi à détecter d’augmentation de la protéine NtBI-1 dans des cellules en culture soumises à un choc thermique, pour lequel une augmentation de l’accumulation de l’ARNm AtBI-1 (dans des suspensions d’ Arabidopsis ) a déjà été rapportée (Swidzinski et al. , 2002), bien que ces résultats proviennent de puces d’ADN et n’ont pas été confirmés par d’autres méthodes.

Il semble donc qu’un niveau élevé de la protéine BI-1 ne coïncide pas nécessairement avec un niveau élevé de son ARNm et cela semble particulièrement vrai dans le cas où les cellules sont en train d’exécuter un programme de mort. Dans ce dernier cas, le niveau élevé du messager n’est probablement que le reflet d’une tentative de survie de la part de la cellule. Il faut donc être très prudent dans nos interprétations et s’assurer d’évaluer la viabilité conjointement avec l’expression du gène, puisque l’augmentation du messager n’est pas d’une très grande utilité à la cellule si cela ne s’accompagne pas d’une augmentation de la protéine. De plus, il ne faut pas sous-estimer l’existence de mécanismes de régulation post-transcriptionnels de BI-1 (voir section 5.7).

La sénescence est le stade final du développement d’un organe qui marque la transition entre une période d’assimilation du carbone et de l’azote vers une période de catabolisme et de transfert des nutriments vers des organes puits (voir section 1.4.1.7). Ce processus de recyclage fait appel à l’autophagie, un processus également impliqué dans la survie cellulaire en période de disette (Lockshin et Zakeri, 2004). En effet, l’utilisation des réserves protéiques, amylacées et lipidiques peut permettre à la cellule de maintenir certains sentiers essentiels à sa survie pendant une assez longue période. L’autophagie peut donc être induite par une carence en nutriments et la plupart des études ont utilisé une carence en carbone ( carbon starvation ; CS) pour décrire ce processus. Beaucoup d’entre elles ont fait appel à des cultures cellulaires auxotrophes envers une source de carbone, le plus souvent le sucrose, dont l’élimination du milieu de culture permet une induction relativement synchronisée du processus dans la population cellulaire (Contento et al. , 2004).

L’autophagie représente donc un sentier de survie pour la cellule et le recyclage d’un organe entier en ayant recours à ce processus représente également un avantage évolutif pour la plante. D’ailleurs, l’autophagie n’est pas un processus exclusif aux plantes et elle est essentielle à la maintenance de caractéristiques « de jeunesse » (par opposition au vieillissement) et à une vie prolongée autant chez les animaux que chez des eucaryotes unicellulaires comme la levure (Lockshin et Zakeri, 2004). Cependant, dans une situation où la disette se prolonge et que la cellule épuise ses réserves, le nom donné à ce processus, dérivé de mots grecs et signifiant « autodigestion », prend tout son sens. La cellule arrive à un point de non retour, le dernier stade de cette forme de PCD, caractérisé entre autres par la dégradation de l’ADN génomique. Il va de soi que la destruction du matériel génétique marque le caractère irréversible du processus.

Au cours de l’autophagie végétale, que ce soit induit par le CS ou dans le cours de la sénescence naturelle des feuilles, une certaine proportion des gènes est différentiellement exprimée de façon à répondre aux nouveaux besoins cellulaires. Outre les gènes impliqués dans le catabolisme et le recyclage des nutriments, on retrouve l’induction d’un grand nombre de gènes traditionnellement associés aux stress et aux réactions de défense. Par exemple, la surexpression d’enzymes impliquées dans la détoxification des ROS comme les superoxyde dismutases et les catalases peuvent contribuer à minimiser les stress oxydatifs pendant le processus (Chandlee, 2001). Dans une étude récente ayant analysé les profils de transcription associés à un CS dans des suspensions cellulaires d’ Arabidopsis , il a été rapporté que 15% des gènes dont l’expression était significativement majorée sont connus ou prédits être impliqués dans la survie cellulaire et les réactions de défense, suggérant leur implication dans une réponse non spécifique envers les stress associés au CS (Contento et al. , 2004). Il est en effet logique que la cellule induise ces mécanismes de survie, qui lui permettent probablement de ne pas « mourir de stress » au cours du processus autophagique visant à ne pas « mourir de faim ».

Il semble donc que la cellule doive adopter des mécanismes de survie de façon à ne pas trépasser avant d’avoir fait une utilisation maximale et optimale de ses réserves. En ce sens, nous avons démontré que le niveau de BI-1 dans des lignées cellulaires de tabac influence leur résistance face à la sénescence naturelle ou induite par une disette en sucrose (chapitre 3). En effet, des lignées cellulaires de tabac chez lesquelles un ARNm antisens de NtBI-1 réduit substantiellement l’accumulation de la protéine sont moins résistantes à la PCD induite par un CS que les lignées contrôles. Il apparaît donc probable que BI-1 soit impliquée dans la survie cellulaire au cours du processus. Cependant, il ne semble pas que son expression ait besoin d’être majorée puisque nous n’avons pas détecté d’augmentation du niveau de la protéine pendant le CS (résultats non publiés). De plus, aucune des études de puces d’ADN ayant analysé les niveaux de transcription au cours de la sénescence naturelle (Swidzinski et al. , 2002; chapitre 3) ou induite par un CS (Contento et al. , 2004) n’ont rapporté de modulation du niveau d’expression de l’ARNm BI-1. Au contraire, nous avons détecté une diminution de l’accumulation de la protéine concomitante avec les premiers signes d’autophagie, jusqu’à l’obtention d’un niveau indétectable précédant ou à peu près en même temps que la perte de viabilité cellulaire et/ou la fragmentation de l’ADN nucléaire (chapitre 4 et résultats non montrés). Il se pourrait donc que l’élimination de BI-1 marque l’un des points de non-retour du processus autophagique.

Dans le même ordre d’idée, la diminution de l’expression de BI-1 dans des cellules humaines via un ARNm antisens induit spontanément l’apoptose (Xu et Reed, 1998) et l’expression du messager semble être ubiquitaire dans la plupart des tissus, autant chez les animaux (Xu et Reed, 1998) que chez les végétaux (Kawai et al. , 1999; chapitre 2), indiquant que ce gène aurait une fonction vitale. Cependant, des souris knockout bi-1 -/-ont pu être générées et ne présentaient pas d’anormalité évidente d’un point de vue macroscopique ou suivant une inspection histologique (Chae et al. , 2004), conduisant les auteurs de l’étude à conclure que le gène n’est pas essentiel, bien qu’ils aient mis en évidence une susceptibilité accrue envers certains stress. La caractérisation de plantes dépourvues du gène BI-1 n’a pas encore été publiée, mais l’équipe de David Gilchrist a rapporté dans une communication (poster) présentée à l’été 2004 au congrès de l’ American Society of Plant Biologists (Plant Biology 2004, Lake Buena Vista, Fl, USA, 24-28 juillet) que la suppression de LeBI-1 chez la tomate via un messager antisens entraîne un phénotype lesion mimic (i.e. l’apparition spontanée de lésions nécrotiques rappelant la HR) et des retards de croissance importants. Il semble donc que bien que des plantes ou des animaux puissent se développer en l’absence ou quasi-absence de la protéine BI-1, cette dernière est strictement requise pour le contrôle négatif de la PCD.

Le fait que la PCD de type sénescence soit favorisée en l’absence de BI-1 (chapitre 3) suggèrent fortement son implication dans le contrôle négatif de ce type de PCD. L’induction de BI-1 par les CK (chapitre 4) renforce davantage cette idée, puisque les cytokinines peuvent exercer un effet anti-sénescence. Dans ce contexte, il ne semble pas farfelu de supposer que BI-1 soit impliquée dans l’effet anti-sénescence des CK. Nous avons également observé que l’accumulation accrue de la protéine NtBI-1 est accompagnée de l’accumulation de l’ARNm PR1a, encodant une protéine traditionnellement associée aux stress biotiques. Cependant, l’induction des gènes PR et de d’autres gènes associés aux stress en présence de niveaux de CK plus élevés que la normale a été rapportée maintes fois dans la littérature, autant dans des systèmes in vitro (Memelink et al. , 1987; Poupet et al. , 1990; Lee et al. , 2004) que dans des tissus ou plantes entières (Memelink et al. , 1990; Martineau et al. , 1994; Rakwal et al. , 2003). L’accumulation des gènes de stress est dans certains cas, mais pas tous, associée à un effet toxique inattendu des CK (Ainley et al. , 1993; Martineau et al. , 1994; McCabe et al. , 2001; Rakwal et al. , 2003; Lee et al. , 2004). Il se pourrait donc que dans certaines circonstances, les CK puissent induire un stress pouvant aller jusqu’à la létalité, de façon concomitante avec l’induction de mécanismes de protection faisant appel à BI-1 et à d’autres protéines traditionnellement connues pour leur implication dans les RD envers les pathogènes.

La toxicité des CK est associée à des cellules en division, ou à tout le moins présentant un métabolisme actif, par opposition à des cellules quiescentes (Ainley et al. , 1993; McCabe et al. , 2001; Carimi et al. , 2003; Lee et al. , 2004). Par exemple, dans les feuilles adultes en sénescence ou non, les CK ne sont pas toxiques mais vont plutôt faire la promotion d’un maintien de caractéristiques « de jeunesse », alors que les jeunes feuilles encore en croissance sont plus susceptibles de réagir par le développement de chloroses et d’une sénescence prématurée (Ainley et al. , 1993; McCabe et al. , 2001). Dans les cultures cellulaires de D. carota L., les cellules en phase exponentielle de croissance sont les plus susceptibles à l’induction de la PCD lors d’un apport exogène de CK (Carimi et al. , 2003). La concentration endogène en CK dans un tissu pourrait peut-être aussi affecter sa réponse envers un apport exogène, bien que cela n’ait jamais été testé. En ce sens, la portion aérienne d’une plante ne perçoit pas les CK de la même façon que le système racinaire (où les CK sont synthétisées), ce dernier étant fortement réprimé par les CK, contrairement à la stimulation du développement de la partie aérienne (Werner et al. , 2003).

Il est donc probable que l’expression différentielle de la machinerie de perception et du métabolisme des CK dans différents tissus ou cellules influence la façon dont est gérée un apport exogène de l’hormone. D’ailleurs, la toxicité des CK dans les cultures cellulaires de tabac semble étroitement associée à leur métabolisme intracellulaire et particulièrement leur conversion en nucléotide (par la phosphorylation; Mlejnek et al. , 2003), qui survient probablement par les enzymes du métabolisme des purines, comme l’Adk (Jameson, 1994; Mok et Mok, 2001). Or, on peut supposer que ces enzymes sont plus abondantes dans des cellules en division (ou à tout le moins très actives métaboliquement) que dans des cellules quiescentes, expliquant peut-être en partie l’effet différentiel des CK selon le statut métabolique. Ce point est également supporté par le fait que les quatre CK testées n’avaient pas toutes la même « efficacité », à une concentration donnée, d’induire un stress ou la PCD. En particulier, nous avons constaté que les plus efficaces étaient celles pourvues de dérivés phénoliques en position N6(Bap et Kin; voir Figure 1-11), probablement parce qu’elles ne sont pas métabolisées par les CKX, contrairement à celles dont la substitution est un isoprenoïde (iPA, Zea; Armstrong, 1994).

Il a été souligné au chapitre 4 que la régulation de BI-1 semble être post-transcriptionnelle, du moins dans certains cas. Par exemple, au cours de la sénescence naturelle ou induite par un CS, le niveau relatif du messager ne semble pas trop affecté, alors que la protéine disparaît. D’un autre côté, des concentrations de CK non toxiques mais induisant un stress entraînent une modulation à la hausse de l’accumulation de la protéine, sans altérer le niveau du messager. De même, nous avons pu détecter une augmentation de l’accumulation de la protéine AtBI-1 dans des plantules d’ Arabidopsis (résultats non montrés), dans des conditions où une analyse transcriptomique avec des puces d’ADNAffymetrix n’a pas rapporté d’altération du messager (Rashotte et al. , 2003).Dans ce dernier cas, il est d’ailleurs reconnu que les CK peuvent stimuler la synthèse protéique en rendant un plus grand nombre de messagers disponibles pour la traduction. Ceci pourrait découler de la modification de la structure secondaire de l’ARNm entraînant son « dévoilement » ( unmasking ), particulièrement dans la région 5’ non traduite (Sherameti et al. , 2004) ou dans le segment poly(A) (Jackowski et al. , 1987). De plus, la formation de polyribosomes a aussi été associée au contrôle traductionnel par les CK (Ohya et Suzuki, 1988; Sherameti et al. , 2004). En particulier, les CK stimulent chez Lupinus luteus (lupin) l’augmentation du taux de synthèse de trois sous-unités de l’ATP synthase sans changement au niveau de l’accumulation de leur ARNm respectif (Kusnetsov et al. , 1994). Récemment, Sherameti et collaborateurs (2004) ont démontré que cela était dû à l’association spécifique de ces ARNm avec des polyribosomes. Bien que spéculatif, il est possible qu’un tel phénomène soit responsable de l’augmentation de l’accumulation de la protéine NtBI-1 sans augmentation de son ARNm.

L’action de la protéine Bax pouvant être accomplie via la production de ROS, il se pourrait que BI-1 exerce son action antagoniste par la suppression de la production de ROS ou leur détoxification, d’autant plus que les stress oxydatifs générant des ROS peuvent favoriser l’accumulation de l’ARNm de BI-1 (Kawai-Yamada et al. , 2004). Pourtant, aucune différence significative dans la production de ROS n’a été observée chez des plantes d’ A. thaliana ou leur protoplastes exprimant la protéine Bax seule ou conjointement avec AtBI-1 (Baek et al. , 2004; Kawai-Yamada et al. , 2004). Il semble donc que l’effet anti-Bax de BI-1 ait une autre origine et l’identification de ce mécanisme pourra potentiellement expliquer l’effet anti-PCD général de BI-1.

Les données disponibles actuellement laissent présager que ce mécanisme universel aurait à voir avec la régulation des flux de Ca2+intracellulaires. En effet, la localisation de BI-1 au sein des membranes du RE, un réservoir de Ca2+, suggérait déjà un lien avec cet ion. L’importance des flux de Ca2+entre le RE et les mitochondries chez les animaux est maintenant bien établie et nous savons également que certaines protéines membres de la famille Bcl-2 peuvent influencer ces mouvements ioniques. Notamment, Bcl-2 contribue à diminuer la [Ca2+]RE, alors que Bax l’augmente (voir section 1.3.5.3). Ainsi, lors d’un stress ou signal apoptotique favorisant la sortie du Ca2+du RE, un surplus de Bcl-2 ou de Bax va respectivement empêcher ou favoriser des surplus de Ca2+aux mitochondries et conséquemment influencer le sort de la cellule. Or, BI-1 antagonise Bax indirectement, de sorte que nous avons depuis un certain temps élaboré l’hypothèse que BI-1 pourrait agir similairement à Bcl-2 et favoriser une plus faible [Ca2+]RE, ce qui expliquerait son action à large spectre autant chez les animaux que chez les végétaux. Cette hypothèse semble avoir également germé dans d’autres têtes, qui l’ont même vérifiée et confirmée chez la souris (Chae et al. , 2004). Des souris knockout bi-1 -/- sont plus susceptibles à l’apoptose induite par des agents conduisant à des stress du RE, tels que la thapsigargine (qui inhibe la pompe Ca2+/ATPase du RE, la SERCA) ou la tunicamycine (qui inhibe la glycosylation), mais non envers des stimulateurs de sentiers apoptotiques passant uniquement par les mitochondries ou les récepteurs de morts (TNF/Fas). Similairement, la surexpression de BI-1 dans les cellules murines protège contre l’apoptose induite par des stress au RE et corrèle avec l’inhibition de l’activation de Bax et sa translocation aux mitochondries, la préservation du Δψmet la suppression de l’activation des caspases. Finalement, la surexpression de BI-1 réduit la quantité de Ca2+pouvant être relâchée du RE (Chae et al. , 2004).

Les similarités entre BI-1 et Bcl-2 quant à certains aspects de leur mode d’action anti-PCD laissent croire que les deux protéines font partie du même sentier, d’autant plus qu’elles peuvent être co-précipitées lorsque exprimées dans des cellules humaines (Xu et Reed, 1998). De plus, même si Bcl-2 et Bax sont absentes du règne végétal, elles peuvent y être fonctionnelles lorsque exprimées sous forme de transgènes (voir section 1.4.4.2), suggérant qu’elles pourraient interférer avec le sentier dont fait partie BI-1. Bien que les données concernant BI-1 et la [Ca2+]REproviennent d’un modèle animal, il est fort probable que BI-1 exerce une action similaire chez les végétaux et potentiellement les autres organismes où il a été identifié. Le sentier de mort universel dans lequel BI-1 tiendrait un rôle clé impliquerait alors la régulation des flux de Ca2+entre le RE et les mitochondries, par un moyen encore inconnu. La présence d’un tel sentier chez les végétaux est d’autant possible que certains éléments qui le composeraient sont effectivement présents chez les végétaux. Ces éléments ayant été détaillés à la section 1.4.2.4, ils ne seront pas repris ici, mais sont intégrés à la Figure 5-2, qui résume nos connaissances des relations entre les CK, le Ca2+et BI-1. Il est à noter que les modulations de la [Ca2+]cn’affectent pas l’accumulation de la protéine BI-1 dans des cultures cellulaires de tabac (section 4.2.5.7), mais nous ne savons rien d’un effet potentiel sur son activité.

Le ? qui accompagne certains éléments souligne le fait que ces données sont extrapolées à partir de d’autres modèles animaux ou végétaux ou carrément spéculées. Les flèches pointillées bleues illustrent la possibilité de transport des CK à travers la membrane plasmique. Dans des cellules de tabac en culture, un apport exogène de CK (Bap ou Kin) mais non d’adénine entraîne un influx de Ca2+de l’apoplaste vers le cytosol, qui est inhibé par la présence d’un chélateur de Ca2+(EGTA) ou d’un inhibiteur de canaux cationiques (La3+). Chez certains bryophytes, l’entrée de Ca2+aurait lieu via un voltage-dependent Ca 2+ channel (VDCC). Chez les plantes supérieures, la signalisation par les CK implique aussi leur liaison à leur récepteur au niveau de la membrane plasmique, puis une cascade de phosphorylation via le two-component phosphorelay (TCP), qui pourrait conduire à la modulation de certains gènes dont BI-1, bien qu’aucune donnée ne supporte cette possibilité pour l’instant. Les CK pénètrent dans la cellule, où elles sont rapidement converties en nucléosides et nucléotides, cette dernière forme étant séquestrée dans la cellule et s’y accumule sans apparente conversion en une autre forme, d’autant plus qu’elle n’est pas un substrat pour la CK oxydase/déshydrogénase (CKX), principale responsable de l’inactivation irréversible des CK. La phosphorylation des CK pourrait être entre autres accomplie par l’adénosine kinase (Adk), puisqu’elle est partiellement compromise par un inhibiteur de l’Adk (AdkI). Pendant ce temps, le niveau d’ATP diminue de façon plus ou moins importante selon la concentration de CK, probablement dû à une combinaison d’une consommation excessive par la phosphorylation des CK et de dysfonctions mitochondriales. D’ailleurs, la diminution du potentiel membranaire mitochondrial (Δψm) a été observée dans des cellules humaines soumises à de hautes concentrations de CK, ainsi que chez les végétaux au cours de diverses formes de PCD. La chute de l’ATP est temporellement suivie d’une augmentation des ROS, lesquels sont reconnus pour leur implication dans la signalisation en conditions de stress et pourraient ainsi être impliqués dans l’induction de BI-1 et des autres gènes dont l’expression est majorée en présence des CK. Les CK favorisent aussi la traduction de BI-1 à partir des ARNm déjà en place (ou l’augmentation de la stabilité de BI-1). Cependant, l’augmentation de la [Ca2+]cne constitue pas un signal pour la surexpression de BI-1, mais BI-1 pourrait influencer la signalisation par le Ca2+en conditions de stress. En effet, chez les animaux, BI-1 agit similairement à Bcl-2 et de façon antagoniste à Bax pour favoriser un plus faible niveau de Ca2+au RE et conséquemment une plus faible sortie de Ca2+du RE vers le cytosol en situation de stress. Chez les mammifères, le Ca2+évacué du RE ou en provenance de l’apoplaste peut être tamponné par les mitochondries (des fluctuations de [Ca2+]msuite à certains stress ont aussi été rapportées chez les végétaux), mais un excès peut entraîner l’ouverture du PTP [dont pourrait faire partie le voltage-dependent anion channel (VDAC), récemment identifié chez les végétaux] et la sortie de l’excès de Ca2+et de d’autres molécules comme le cytochrome c (Cyt c ) qui participent à l’induction de la PCD (chez les végétaux, la corrélation entre la sortie du Cyt c et la PCD est parfois observable, mais une relation de cause à effet n’a jamais été établie). L’ouverture plus ou moins prolongée du PTP s’accompagne aussi de la perte du Δψm(un phénomène également provoqué chez les végétaux par des inducteurs de la PCD) et donc d’une réduction de la synthèse de l’ATP.

L’ensemble des données accumulées au cours des dernières années, incluant celles constituant le cœur de cette thèse, indiquent que BI-1 est un régulateur négatif de la PCD, agissant possiblement au sein d’un sentier de mort ancestral évolutivement conservé chez les eucaryotes. L’élucidation des mécanismes d’action de cette protéine pourra donc nous permettre de repérer un sentier de mort présent non seulement chez les végétaux, mais aussi potentiellement chez l’ensemble des eucaryotes.

Bien que les données générées dans le cadre de cette thèse nous aient fourni de précieuses informations concernant BI-1, elles ont aussi engendré beaucoup de questions. Ainsi, la sénescence accélérée des lignées de tabac sous-exprimant BI-1 (lignées AS) et l’augmentation de l’accumulation de BI-1 par les CK suggèrent l’implication de cette protéine dans le contrôle de la sénescence. Ce point pourrait être vérifié par l’expression de BI-1 sous le contrôle du promoteur de SAG12 , de façon à surexprimer la protéine spécifiquement au cours de la sénescence. Les données obtenues avec les lignées AS ouvrent également la possibilité que BI-1 soit associée à la régulation de l’autophagie, ce qui pourrait constituer une piste de recherche intéressante. Un autre point majeur à vérifier serait l’impact de la modulation à la hausse ou à la baisse de l’accumulation de BI-1 sur la PCD induite par les CK, mais aussi la PCD induite par des agents qui affectent la [Ca2+]cde différentes manières. De façon plus générale, l’identification de partenaires protéiques de BI-1 pourrait être fort utile à l’élucidation du sentier dans lequel elle intervient.

© Nathalie Bolduc, 2005