Collection Mémoires et thèses électroniques
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Life is a great surprise.I do not see why death should not be an even greater one.

--Vladimir Nabokov(1899-1977)romancier

La chance, pour un chercheur,est de trouver des faits quiressemblent à ce quile passionne.

--Jean Rostand(1894-1977)biologiste

La mort cellulaire programmée (PCD) est un processus physiologique ou pathologique permettant l’élimination sélective de cellules devenues inutiles, endommagées ou infectées pour le maintien de l’intégrité ou l’adaptation ( fitness ) de l’organisme ou de la population cellulaire. Chez les végétaux, les mécanismes moléculaires régulant la PCD ne sont pas encore élucidés, mais la découverte que la protéine humaine anti-PCD Bax Inhibitor-1 (BI-1) est conservée chez les plantes, pourtant dépourvues de la protéine pro-PCD Bax, en a fait un candidat fort prometteur pour l’élucidation de sentiers de mort évolutivement conservés. En ce sens, cette thèse décrit la caractérisation d’orthologues de BI-1 isolés de Brassica napus ( BnBI-1 ) et de Nicotiana tabacum ( NtBI-1 ). Nous avons déterminé par des analyses informatiques et des études d’expression que BI-1 est une protéine membranaire intégrale possédant sept domaines transmembranaires putatifs et localisée au réticulum endoplasmique. Des essais fonctionnels dans des cellules humaines HEK 293 ont révélé que des orthologues végétaux de BI-1 peuvent inhiber la PCD (apoptose) induite par Bax dans ces cellules. Par ailleurs, des lignées cellulaires de tabac présentant des niveaux inférieurs de la protéine NtBI-1 grâce à l’expression d’un ARNm antisens entament un programme précoce de PCD suite à une déficience en carbone, démontrant ainsi le rôle anti-PCD intrinsèque de BI-1 dans des cellules végétales. Nous avons également découvert que la protéine NtBI-1 est surexprimée en présence de cytokinines (CK) dans des cultures cellulaires de tabac, et ce à des concentrations coïncidant avec l’établissement d’une réponse de stress, unphénomène impliquant des mécanismes de régulation post-transcriptionnels. La réponse cellulaire envers les CK comprend également un influx rapide de Ca2+de l’apoplaste vers le cytosol. Cet influx est partiellement impliqué dans l’induction de la PCD mais non dans la signalisation menant à la surexpression de BI-1. L’ensemble de nos résultats indique que BI-1 est bel et bien un régulateur négatif de la PCD végétale, qui agirait au sein d’un sentier de mort évolutivement conservé. L’augmentation de l’accumulation de la protéine NtBI-1 lors de la réponse de stress envers les CK pourrait contribuer à la survie des cellules et laisse supposer que la protéine est impliquée dans l’activité anti-sénescence des CK. BI-1 s’insère dans un sentier où son niveau d’expression influence la capacité cellulaire à résister aux stress générés entre autres par une disette en carbone, et ce potentiellement via la modulation de l’homéostasie du Ca2+intracellulaire.

Programmed cell death(PCD) is a physiological or pathological process allowing the selective elimination of useless, damaged or infected cells with the aim of maintaining the integrity or fitness of the remaining organism or cell population. In plants, molecular mechanisms regulating PCD are not yet elucidated, but the identification of functional plant orthologs of the human anti-PCD protein Bax Inhibitor-1 (BI-1), given that the pro-PCD protein Bax is absent in the plant kingdom, revealed the potential of BI-1 as an evolutionary conserved cell death regulator. Accordingly, this thesis describes the characterization of BI-1 orthologs isolated from Brassica napus ( BnBI-1 ) and Nicotiana tabacum ( NtBI-1 ). While combining bioinformatics analysis and localization studies using a fusion between BnBI-1 and the green fluorescent protein , we determined that BI-1 is an integral membrane protein provided with seven putative transmembrane domains localized at the endoplasmic reticulum. We also proceeded to functional assays in human HEK 293 cells, and we demonstrated that plant BI-1 orthologs can inhibit Bax-induced PCD (apoptosis) in these mammalian cells. On the other hand, we demonstrated that tobacco cell lines expressing lower levels of the NtBI-1 protein via an antisens mRNA induced an early PCD program under carbon starvation. We also discovered the up-regulation of NtBI-1 when cultured cells were grown in the presence of cytokinins (CKs), which correlated with the establishment of a stress response. The phenomenon involved post-transcriptional regulatory mechanisms of the BI-1 protein accumulation. Cellular response to CKs also involved a rapid influx of Ca2+from the apoplast to the cytosol and this influx is partly involved in PCD induction but not in signaling leading to BI-1 modulation. Taken together, our data indicate that BI-1 is a negative regulator of plant PCD that would act in an evolutionary conserved death pathway. NtBI-1 protein over-accumulation in the stress response to CKs could contribute to cell survival and suggests the involvement of the protein in the senescence-delay activities of CKs. BI-1 is part of a pathway where its expression level influence cellular ability to resist to carbon starvation- or senescence-induced stresses, potentially via modulation of intracellular Ca2+homeostasis.

Toute bonne chose ayant une fin, c’est maintenant pour moi le temps de jeter la serviette et de terminer cette trépidante aventure que fut le doctorat. Mon parcours fut parsemé d’émotions de toutes sortes : enthousiasme, excitation, fatigue, stress, lassitude, toute la gamme y a passé dans l’ordre et dans le désordre. À un certain moment donné en début de parcours, j’ai même pensé tout abandonner, incertaine de la façon dont je voulais orienter ma vie. Plusieurs années d’incertitudes plus tard, j’en suis finalement là, en train de rédiger l’avant-propos de ma thèse, que je me suis réservé pour la toute fin de cette dernière partie de l’aventure mais non la moindre, la rédaction, que je ne suis pas fâchée de terminer. Je crois laisser pour la postérité un compte rendu de qualité : j’y ai mis tout mon cœur ainsi que tout mon savoir-faire accumulé depuis 29 ans.

J’en profite au passage pour remercier toutes les personnes qui ont contribué de près ou de loin à la réussite de mon aventure, que je comparerais à la communauté de l’anneau du monde fantastique de J.R.R. Tolkien. Tel le grand sage Gandalf, ma directrice de recherche Dre Louise Brisson m’a admirablement guidée dans mon parcours, et ce en sachant me laisser toute la latitude nécessaire à l’élaboration d’une pensée scientifique critique et autonome. Toujours ouverte à mes idées, mes critiques, mes réserves, mes espoirs, Louise est remarquable pour son humanité. Merci infiniment Louise!

Je m’en voudrais de ne pas mentionner ces autres mentors expérimentés qui m’ont aussi prodigué de sages conseils tout au long du parcours. Ainsi, le Dr André Darveau a mis à ma disposition ses installations pour la culture cellulaire et a maintes fois tenu la torche qui éclairait le chemin vers la transfection de cellules animales et la production d’anticorps. De même, le Dr Dominick Pallotta a siégé en compagnie du Dr Darveau sur mon comité aviseur, mais a également gentiment accepté de procéder à la prélecture de ma thèse en plus de m’avoir fourni levures et bons conseils pour certaines expériences. De son côté, le Dr Stephen Cessna a toujours répondu patiemment à mes interminables questions portant sur le calcium et la complexité de sa quantification. Finalement, j’aimerais aussi souligner la contribution du Dr Marc Rideau qui a accepté, malgré une demande formulée plutôt à la dernière minute, le rôle d’évaluateur externe de ma thèse. D’autres compagnons m’ont également épaulée de différentes façons dans ma quête du Ph.D. et sans tous les nommer ici (je risquerais fâcheusement d’en oublier), je tiens à les remercier : collègues de travail complices, stagiaires maladroits mais bien intentionnés, amis de longue date espiègles ou fêtards, tous ceux à qui le chapeau semble adéquat, je vous le mets chaleureusement. Je tiens aussi à adresser des remerciements particuliers à Dre Marguerite Loembé, Dre Hélène Chamberland et André Laroche pour avoir généreusement partagé avec moi leur précieux savoir technique. Un gros merci à tous!

Dans le Seigneur des anneaux , le héros Frodo ne se rend pas seul jusque dans les profondeurs du Mordor, mais y parvient plutôt aux côtés de son indissociable compagnon Sam, qui lui prodigue bons soins, support et amitié. Bien sûr, Frodo a côtoyé d’autres compagnons, mais Sam est probablement celui qui sait le mieux le comprendre et dont il a été le plus proche. Mon compagnon Mario, l’homme de ma vie, m’a rejointe quelques temps après mon départ vers le Ph.D., puis accompagnée peu importe les obstacles dans cette grande aventure. Il m’a dorlotée, réconfortée, encouragée, stimulée, amusée, divertie, aimée. Merci Mario. Et je compte encore sur toi pour la suite!

Dans l’univers fantastique de Tolkien, les questions monétaires ne semblent pas préoccupantes, mais dans « le vrai monde » elles sont, malheureusement, omniprésentes. Je tiens donc à remercier les organismes subventionnaires qui m’ont supportée directement pendant les trois premières années de mon cheminement : le Conseil de recherches en sciences naturelles et en génie du Canada (CRSNG) et le Fonds québécois de la recherche sur la nature et les technologies (FQRNT).

Étonnamment, je n’ai pas rencontré le méchant Saroumane dans mon parcours. Mon père dirait peut-être que c’est ma bonne étoile ou encore ma mère dirait que je mène une bonne vie. Peut-être l’ai-je rencontré sans même le reconnaître? Je crois que l’on bâtit soi-même sa chance et que l’on créé sa propre bonne étoile… En réalité, Saroumane se cachait à tous les détours que j’ai pris pour parvenir jusqu’ici, mais grâce à un travail acharné, il n’a pas été capable de m’arrêter, même s’il m’a parfois ralentie. Mais on apprend de ses erreurs et Saroumane est-il vraiment méchant? Comme Gandalf le disait si bien, nul ne sait si à la fin un homme mauvais ne fera pas le bien. Il en va de même des obstacles que nous réserve la vie.

Je clos donc cette aventure sans regret et avec fierté.

« Je doute parfois si j’aime la biologie parce qu’elle est science de la vie, ou si j’aime la vie parce qu’elle sert d’objet à la biologie  » [Jean Rostand (1894-1977), Carnet d’un biologiste , Stock, Paris, 1959].

Δψm: différence de potentiel membranaire mitochondrial

a.a. : acide aminé

ABA : acide abcissique

ACC : acide 1-aminocyclopropane-1-carboxylique

Adk : adénosine kinase

AdkI : inhibiteur d’adénosine kinase

ADNc : ADN complémentaire

AIF : apoptosis-inducing factor

AJ (JA) : acide jasmonique

ANT : adenine nucleotide transporter

AOX : alternative oxidase

ARR : Arabidopsis thaliana response regulator

AS (SA) : acide salicylique

Asp : résidu aspartate

Bad-MP :benzyladénosine monophosphate

Bap : 6-benzylaminopurine

Bapta : 1,2-Bis(2-aminophenoxy) éthane- N,N,N',N' - acide tétraacétique

BH: Bcl-2 homology

BI-1: Bax inhibitor-1

BSA : albumine sérique de boeuf

CAD : caspase-activated DNase

CK : cytokinine

CKX : cytokinine oxydase/déshydrogénase

CS : carbone starvation

CysEP : cystéine endopeptidase

Cyt c : cytochrome c

DAPI : 4',6-diamidino-2-phenylindole dihydrochloride

DD: death domain

DED: death effector domain

EDTA : ethylene diamine tetraacetic acid

FADD: Fas-associated death domain

GA : acide gibbérellique

GFP : green fluorescent protein

GUS : β -glucuronidase

His : résidu histidine

HR : réponse hypersensible

iP : N6-(2-isopentényl)adénine

IP3R : récepteur d’inositol-3-phosphate

iPA : N6-(2-isopentényl)adénosine

Kin : kinétine

LMM : lesion mimic mutant

MME : membrane mitochondriale externe

MMI : membrane mitochondriale interne

MS : Murashige & Skoog

PARP : poly (ADP-ribose) polymérase

PBS : phosphate buffered saline

PCD : programmed cell death

PCR : polymerase chain reaction

PI : iodure de propidium

PMSF : phenylmethyl sulfonide fluoride

PR : pathogenesis related

PTP : permeability transition pore

PVDF : polyvinylidene difluoride

RD : réaction de défense

RE (ER): réticulum endoplasmique

ROS : reactive oxygen species

RR : response regulator

RyR : récepteurs de ryanodine

SAR : réponse systémique acquise

SDS : sodium dodecyl sulfate

SERCA : pompe sarco-endoplasmic reticulum Ca 2+ –ATPase

TCS : two-component response system

TE : tracheary element

TM : domaine transmembranaire

TMV : tobacco mosaic virus

TNF (R): tumor necrosis factor (receptor)

TRADD: TNF receptor associated death domain

TUNEL : terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated dUTP nick end-labeling

VDAC : voltage-dependent anion channel

VDCC : voltage-dependent Ca 2+ channel

Zea : zéatine

© Nathalie Bolduc, 2005