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Chapitre I: INTRODUCTION ET REVUE DE LA LITTÉRATURE

Table des matières

Les cellules de tous les tissus de l’organisme requièrent la présence d’un environnement extra-cellulaire précis pour leur support, leur survie et leur régulation. Cet environnement est généré par une structure composée de glycoprotéines, de glycosaminoglycanes et de protéoglycanes regroupés en une structure nommée matrice extra-cellulaire (MEC). Les cellules peuvent être complètement entourées par la MEC, comme dans le cas des fibroblastes du derme ou faire contact avec la MEC que d’un seul côté comme c’est le cas pour les cellules épithéliales ou endothéliales3 . Dans tous les cas, le contact avec la MEC fournit support et signaux de régulation aux cellules.

Différents types cellulaires requièrent des signaux qui leurs sont propres. Il n’est donc pas étonnant que la composition de la MEC soit également propre à chaque tissu et hautement régulée lors de processus comme le développement embryonnaire ou la réparation tissulaire. De la même façon, certains tissus requièrent une résistance mécanique accrue (tendons) et leur MEC se doit de refléter ces propriétés. Les sous-chapitres suivants décrivent en détails les principaux constituants de la MEC en ce qui concerne leurs structures, leurs fonctions et leurs répartitions dans divers tissus et processus biologiques. Les principaux modes d’adhésion cellules-matrices et leurs conséquences sur les cellules les liant seront décrits brièvement. Finalement, les principaux modes de régulation de la MEC seront également abordés.

Une famille de protéines, les collagènes, constitue la composante structurale principale de la plupart des MEC de mammifères. Les collagènes sont des protéines riches en glycine s’assemblant à l’extérieur des cellules en larges agrégats fibreux supramoléculaires. Une molécule de collagène est constituée de trois hélices α tournant à gauche, associées parallèlement en une super-hélice tournant à droite. Les hélices α sont des polypeptides d’environ 1000 acides aminés de long, riches en glycine (Gly), mais aussi en proline et en hydroxyproline. Les hélices α suivent généralement la séquence Gly-X-Y, où X et Y sont n’importe quel acide aminé sauf la glycine. Les hélices α sont synthétisées sous la forme de précurseurs plus longs que les hélices formant la triple hélice constituant la molécule de collagène. Le domaine globulaire en C-terminal est clivé, mais joue un rôle essentiel dans la formation de la molécule de collagène. Suite à une série de modifications post-traductionnelles et de réactions d’assemblage, la fibrille, puis la fibre de collagène sont produites. C’est sous cette forme que l’on retrouve la majorité des collagènes et que la plupart d’entre eux constitueront la MEC4 (voir tableau 1).

La structure créée par le collagène est responsable de la résistance mécanique à l’étirement de la MEC. En plus de son rôle structural, le collagène joue des rôles dans l’adhésion cellules-MEC et la migration cellulaire. Bien que ces rôles soient surtout remplis par d’autres glycoprotéines de la MEC (par exemple.: fibronectines) dans le tissu sain, ces rôles deviennent beaucoup plus critiques lors de la réparation tissulaire. En effet, la dégradation des fibres de collagènes causée par des protéases (collagénases, gélatinases) ou par la chaleur, rend disponible des sites de reconnaissance pour les intégrines précédemment inaccessibles ou inefficaces pour l’intéraction avec celles-ci. Le collagène dénaturé est donc un important signal de dommage cellulaire, en plus de favoriser l’agrégation plaquettaire lors de l’inflammation et de favoriser la migration5 de plusieurs types cellulaires lors de la réparation tissulaire.

Source: 6 et 7

Les GAGs sont constitués de longues répétitions de disaccharides où l’un est généralement l’acide D-Glucuronique ou l’acide L-Iduronique (produit d’épimérisation) et l’autre le N -acetyl ou N -sulfoxy-D-glucosamine6 . Dans tous les cas, sauf pour les héparanes sulfates (HS), les sucres sont reliés par une alternance de liens β(1→ 3) et β(1→ 4) glycosidiques. Les HS, pour leur part, comportent des sous-unités d’acide D-glucoronique ou Acide L-iduronique reliés par des liens β(1→ 4) à des N-acetyl-D-galactosamine8 (voir tableau 2).

Les GAGs possèdent un nombre variable de groupements sulfates et/ou carboxyles leur conférant une charge nette négative. Cette charge est d’ailleurs importante pour toutes les activités des protéoglycanes9 . Le degré de sulfonation possible varie selon les GAGs et contribue à la diversité de fonctions et des propriétés de ces molécules. Par exemple, un disaccharide d’acide hyaluronique (AH) n’est pas sulfatée alors qu’un disaccharide d’HS peut-être sulfaté à un maximum de trois endroits (voir tableau 2). Cette variabilité de sulfatation s’étend aussi au sein d’une même famille de GAGs où divers degrés de sulfatation peuvent être observés selon le tissu ou le processus biologique (ex.:HS)8 .

Les GAGs, sauf dans le cas de l’AH, n’existent que sous la forme liée à une protéine centrale via une sérine et un court polysaccharide de liaison. Les protéoglycanes sont présents à la surface de la plupart des cellules et dans tous les tissus. Certains types de protéoglycanes sont ubiquitaires (ex.: HS) alors que d’autres ne sont typiquement présents que dans un type tissulaire (ex.: Aggrecan dans le cartilage). Il a également été démontré que le degré de sulfonation des HSs ainsi que leur distribution pouvaient jouer des rôles dans le développement10 , notamment dans la morphogenèse des poumons11 , mais aussi de la peau. Bien que la structure générale d’une protéoglycane comme l’HS soit généralement conservée, son degré de sulfatation ou d’épimérisation peut donner un grand nombre de structures différentes, ce qui explique sans doute sa grande spécificité tissulaire.

Plusieurs protéoglycanes jouent des rôles dans la régulation des facteurs de croissance. En effet, certains protéoglycanes comme l’héparine et les HSs sont reconnus comme pouvant lier certains facteurs de croissance (FC) comme les FGF ( acronyme de la terminologie anglaise pour Fibroblast growth factor:( Facteur de croissance du fibroblaste) , EGF ( acronyme de la terminologie anglaise pour Epidermal growth factor ; Facteur de croissance épidermique) , PDGF (acronyme de la terminologie anglaise pour Platelet derived growth factor (Facteur de croissance dérivé des plaquettes) , BMP (acronyme de la terminologie anglaise pour Bone morphogenic protein ; Protéine morphogénique des os), etc. Ces FC n’ont en commun que leur capacité de liaison à l’héparine/les HSs et sont donc souvent regroupés sous la dénomination «facteur de croissance pouvant se lier à l’héparine» ( HBGF de l’acronyme pour la terminologie anglophone heparin binding growth factor).

*Glycosaminoglycanes

En liant les HBGF , les HSs constituent des réservoirs de FCs liés à la MEC ou à la surface des cellules (les HSs sont matriciels ou liés à la cellule)3,8,9,12 . De plus, il fut également démontré que la liaison de HBGF (comme le FGF-b ) par l’héparine ou les HSs potentialise l’action de ces FCs en les protégeant de la dégradation dépendante du pH, de la température ou des enzymes protéolytiques8-9; 13-16 .

Les HSs sont une classe de protéoglycanes pouvant être associés à la membrane. Ils y jouent des rôles importants d’adhésion pour les cellules, tant mésenchymateuses qu’épithéliales, sur les MECs et sur les membranes basilaires. Cette adhésion s’effectue par le biais de sites de liaisons présents sur les fibronectine, mais aussi sur les collagènes de type I, III, et V14 . L’interaction HS - fibronectine contribue à augmenter l’affinité des intégrines pour les fibronectines.

Des associations entre les HSs et le cytosquelette d’actine ont également été observées 12;14 . Comme c’est le cas dans plusieurs systèmes de récepteurs, les HS membranaires agissent également comme des récepteurs de basse affinité pour les FCs, augmentant ainsi leur concentration locale à la membrane. Les récepteurs de hautes affinités (récepteurs spécifiques aux FCs) ont alors plus de chances de lier leurs substrats. En d’autres termes, les HSs membranaires agissent comme co-récepteurs de basse affinité pour les récepteurs de facteur de croissance. Dans certains cas, la transduction de signal par la liaison d’un FC à son récepteur, requiert même la liaison du FC par un HS. Par exemple, le FGF-b et EGF doivent être liés à un HS pour permettre la liaison à leur récepteur.

Le mode d’activation du FGF-b par l’HS pourrait impliquer un changement de conformation du FGF-b , mais aucun résultat n’a encore clairement démontré cette hypothèse. D’autres hypothèses (supportées par des expériences de cristallographie) impliquent que l’activation du FGF (ou de son récepteur) pourrait découler de la dimérisation du FGF ou du récepteur par un HS ou par la formation d’un complexe ternaire entre ces trois éléments17 . Ces hypothèses restent controversées puisque le complexe HS - FGF est capable d’activer le récepteur du FGF de façon autonome. Les protéoglycanes associées à la membrane seraient également impliquées dans la transmission synaptique et dans la présentation antigénique, mais ceci déborde grandement le cadre de ce mémoire.

Les GAGs jouent également des rôles importants et sont hautement régulés lors de la réparation tissulaire. Par exemple, il a été démontré que le tissu de granulation en formation contenait principalement des GAGs non-sulfatés, comme l’AH, alors que les protéoglycanes sulfatés comme les HSs, la chondroitine-4-sulfate et la dermatane sulfate y sont absents. Au fur et à mesure que le tissu de granulation mature et jusqu'à l’étape de remodelage, les protéoglycanes sulfatés réapparaissent alors que la quantité d’AH diminue. L’AH apparaît donc au moment où les cellules sont en migration et pourrait y jouer un rôle important. Pour leurs parts, les protéoglycanes font leur apparition lorsque les cellules commencent à synthétiser la matrice de collagène. Aussi, la liaison aux HSs de certains facteurs de croissance les protège des pH élevés et de la forte activité protéolytique présente dans la plaie en reconstruction. Cette activité est sans doute de courte durée car l’héparine et les HS sont également dégradés par des enzymes comme l’héparanase lors de la destruction de la MEC endommagée. Les FCs maintenus dans la MEC sont alors libérés et peuvent agir sur différents types cellulaires (chimiotactisme, etc.) avant de se faire inactiver par le pH, la température ou les nombreuses protéases présentes dans la plaie. L’activité de protection et de présentation des FCs redevient sans doute plus importante lors du dépôt de la matrice de collagène, lorsque les cellules ont cessé de migrer. En somme, les GAGs, et particulièrement les HSs, jouent d’importants rôles dans la régulation de l’adhésion des cellules, la synthèse de collagène et le dépôt de cette matrice lors de la réparation cellulaire7 .

La liaison des cellules à la MEC s’effectue principalement par le biais d’une classe particulière de molécules d’adhésion de la cellule ( CAM de l’acronyme anglais pour cell adhesion molecule ): les intégrines. Les intégrines sont des glycoprotéines transmembranaires hétérodimèriques composées de sous-unités α et β. Elles possèdent toutes de grands domaines extra-cellulaires, un court segment transmembranaire et un court domaine cytoplasmique non-catalytique.

Les intégrines reconnaissent une grande variété de séquences, la plus connue étant le tri-peptide RGD. À cette séquence s’ajoutent des séquences spécifiques pour les collagènes, les laminines, la fibronectine ou même des contre-recepteurs situés sur d’autres cellules. Dans tous les cas, les sites de reconnaissance sont généralement de petits motifs peptidiques contenant un acide aminé important pour la liaison18 . L’adhésion des cellules par les intégrines peut être divisée en deux catégories: les plaques d’adhérences (PA ou focal adhesions dans la terminologie anglaise) et les hémidesmosomes.

Les intégrines ont également la capacité de réguler leur état d’affinité par le biais d’interactions de leurs domaines cytoplasmiques avec des protéines du cytoplasme. Ce phénomène de signalisation interne-externe est notamment très important dans la régulation de l’agrégation plaquettaire. La régulation des intégrines et des signaux qu’ils engendrent est évidemment plus complexe que dans ce court résumé, mais sort du cadre de ce mémoire.

Le rôle des intégrines dans les hémidesmosomes sera abordé dans le cadre du chapitre. Notons également que d’autres familles de molécules sont importantes dans l’adhésion des cellules à la matrice et des signaux en découlant. Par exemple, les HSs tant membranaires que matricielles jouent des rôles importants dans la migration et l’adhésion en général. Finalement une autre classe de molécules d’adhésion, les sélectines, peuvent également se lier à la MEC.

La MEC n’est pas un squelette statique, passif aux changements. En effet, il s’agit plutôt d’une structure dynamique, en constante formation et dégradation. Dans le tissu sain, la MEC est relativement stable, mais plusieurs processus, comme la migration cellulaire, la réparation tissulaire et la néovasculogénèse, requièrent la dégradation locale ou étendue de la MEC. Une partie de la dégradation de la MEC est effectuée par une famille d’endopeptidases dépendantes du zinc, les métalloprotéinases de la matrice ( MMP pour l’acronyme de la terminologie anglaise de matrix metalloproteinase). Plus de 17 MMPs ont été répertoriées chez les vertébrés et toutes ont en commun un certain nombre de domaines protéiques. Parmi ces domaines, on retrouve un domaine séquence signal et N-terminal, requis pour leur localisation au réticulum endoplasmique (qui sera clivé), un pro-peptide contenant un groupe possédant un résidu thiol qui peut interagir avec le zinc et un domaine catalytique liant le zinc. Les MMPs sont classées selon leurs autres groupements. De ces huit groupes de MMPs , cinq sont sécrétées et trois sont associées à la membrane (de façon transmembranaire ou via une liaison au glycosylphosphatidylinositol (GPI)).

Les MMPs sont synthétisées sous la forme de zymogènes inactives ( pro-MMPs ). Leur activation requiert le clivage du pro-domaine maintenant la protéine dans un état inactif. Cette étape est habituellement effectuée de façon extracellulaire par d’autres MMPs , mais aussi dans le cas de certaines MMPs de façon intracellulaire par des sérines protéases. L’activité des MMPs peut être régulée par l’action de leurs inhibiteurs endogènes: les inhibiteurs des métalloprotéinases tissulaires ( TIMP pour l’acronyme de la terminologie anglaise tissue inhibitor of metalloproteinase ). Les TIMPs ont une grande variété de substrats et inactivent les MMPs en s’y liant de façon réversible.19,20

La première couche de l’épiderme constitue la couche basale, ou germinative, et n’est épaisse que d’une cellule. Elle est constituée de cellules cuboïdales non-différenciées. La régénération de l’épiderme y est effectuée par une sous-population de cellules hautement prolifératrices: les cellules amplificatrices transitoires (AT). Ces cellules ont toutefois un potentiel de prolifération limité et de nouvelles cellules AT doivent être produites sporadiquement par la division asymétrique d’une cellule épithéliale souche. Les kératinocytes de la couche basale expriment les kératines 5 et 1422,23 ainsi que les intégrines α2 β1, α3 β1 et α6 β4 (voir figure 2). Ces intégrines lient les cellules entres elles par le biais de desmosomes (α2 β1, α3 β1 ) et à une structure extra-cellulaire spécialisée appelée membrane basilaire. Les cellules sont liées à la membrane basilaire par le biais de structures appelées hémidesmosomes impliquant les intégrines α3 β1 et α6 β4 . Dans la peau glabre, la couche basale des crêtes est un des sites proposés pour la localisation des cellules épidermiques souches5,24,25 . Celles-ci exprimeraient des marqueurs comme la kératine 19 et p635,25-28 . Au fur et à mesure que les cellules de la couche germinative continuent à proliférer, celles-ci commencent à se différencier et à migrer vers les couches plus externes et plus différenciées de l’épiderme.

La membrane basilaire est, comme son nom l’indique, située directement sous la couche basale de l’épiderme et délimite l’épiderme et le derme. L’analyse ultra-structurale permet de séparer la membrane basilaire en deux régions la lamina lucida et la lamina densa . Structurellement, la membrane basilaire est principalement constituée de collagène IV, collagène VII, de nidogène et des laminines 1, 5, 6 et 7 en plus de protéoglycanes comme le perlecan et différents héparanes sulfates.

La membrane basilaire peut être décrite comme une matrice extra-cellulaire spécialisée, sécrétée par les cellules épidermiques et par les fibroblastes de la couche basale. Elle agit à titre de barrière entre l’épiderme et le derme et est donc décrite parfois comme jonction dermo-épidermique. En plus de fournir un support aux cellules épidermiques, la membrane basilaire filtre et entrepose les FCs nécessaires aux cellules épithéliales. Cette fonction est assurée par les nombreuses protéoglycanes et glycosaminoglycanes présentes dans la matrice de la membrane basilaire. Les cellules épithéliales de la couche basale se lient à la membrane basilaire via plusieurs types de liaisons. L’ancrage des cellules de la couche basale est essentiel pour leur survie. Notons aussi que des défauts dans l’adhésion via les laminines ou les intégrines sont à l’origine de nombreuses pathologies comme certains types de dystrophie musculaire et l’épidermolyse bulleuse. La membrane basilaire joue des rôles importants dans la régénération tissulaire et la migration cellulaire.

Ce mémoire étant principalement dirigé sur l’amélioration des moyens utilisés pour régénérer ou remplacer la peau détruite, il semble justifié de décrire un type de destruction du tissu cutané, les brûlures. Les brûlures sont classées en degré selon leur sévérité. Les divers degrés sont montrés à la figure 3 et sont décrits plus amplement dans les sous-chapitres suivants.

Les résultats présentés dans ce mémoire sont en relation avec les mécanismes de guérison des plaies simples. Il convient alors d’en souligner les principaux mécanismes dans un tissu comme la peau.

Suite à une blessure, différentes structures épidermiques, dermiques et vasculaires sont détruites. Différents produits sanguins sont alors relâchés au site de la plaie. Les plaquettes sanguines peuvent alors reconnaître et lier des structures matricielles endommagées (c’est-à-dire: collagène). S’en suivent alors l’agrégation plaquettaire et la dégranulation de celles-ci. Les facteurs contenus dans ces granules seront alors responsables de la suite des événements. Brièvement, la libération de fibrinogène et de trombine conduit à la transformation du fibrinogène en monomères de fibrine, puis en la polymérisation de ces monomères en une matrice provisoire, le caillot sanguin. La matrice de fibrine est alors enrichie de fibronectine, de glycosaminoglycanes comme l’acide hyaluronique et fibrinogène. Parallèlement, les plaquettes libèrent des FCs comme le TGF-β et certaines composantes du complément. Les plaquettes et les cellules du tissu affecté sécrètent également des facteurs ayant un effet vasoconstricteur sur les vaisseaux des tissus affectés et augmenteront la perméabilité des vaisseaux en périphérie de la plaie. Ces mêmes facteurs attirent aussi les cellules de l’immunité au site affecté par chimiotactisme. Les premières cellules de l’immunité arrivées sont les neutrophiles, qui effectueront l’élimination des tissus nécrosés et des bactéries pouvant êtres présents au site lésé. S’il n’y a pas d’infection chronique, le nombre de neutrophiles diminuera progressivement au profit des monocytes. Ces monocytes, une fois différenciés en macrophages, termineront le travail entamé par les neutrophiles. Les macrophages et les plaquettes libèrent également des FCs augmentant la prolifération des fibroblastes ainsi que leur synthèse de collagène7 .

La réépithélialisation est un événement crucial et précoce dans la guérison d’une plaie. Deux modèles ont été proposés pour expliquer le mécanisme de la réépithélialisation d’une plaie. Le modèle de la migration en feuillet veut que les kératinocytes recouvrent la plaie en migrant en un groupe cohésif, jusqu’à ce que la plaie soit complètement recouverte. Le modèle dit en saute-mouton propose que les kératinocytes migrent les uns par dessus les autres pour finalement s’ancrer à la MEC. Dans ce modèle, une cellule en position suprabasale migre de façon individuelle par-dessus une cellule basale28 . Pour migrer, les kératinocytes modifient leur phénotype pour exprimer des protéines propres à la migration. Par exemple, les kératinocytes modifient les kératines qu’ils expriment (K6-K16), en plus d’élargir leur répertoire d’intégrines. Les kératinocytes en migration expriment également des éléments de la matrice provisoire comme la laminine 5 et le collagène V. Une fois la plaie recouverte, les cellules du néo-épiderme continueront à proliférer, ce qui aura pour effet de l’épaissir. C’est également durant cette période que la membrane basilaire commence à être reconstituée. Enfin, les cellules reprennent un phénotype normal et s’ancrent à la membrane néo-formée.

Notons toutefois que de récentes études ont démontré que la réépithélialisation d’une plaie s’effectuait par le biais des deux modèles à la fois28 .

Parallèlement à la réépithélialisation et à la néovascularisation, la formation du tissu de granulation est également caractérisée par la réparation de la MEC et de ses composantes cellulaires. Ceci requiert à la fois la migration des fibroblastes des bords de la plaie au site de la plaie, leur prolifération et la production de MEC. Tous ces mécanismes sont généralement regroupés sous le terme fibroplasie. Les fibroblastes en périphérie de la plaie sont stimulés par les nombreux FCs, sortent de leur état de quiescence et adoptent un phénotype leur permettant de migrer dans la matrice provisoire produite lors de l’inflammation. Les fibroblastes ainsi activés migrent en suivant des gradients de concentration de FCs produits ou relâchés lors de l’inflammation (par exemple: PDGF, EGF, IGF-1, TGF-β), de débris de MEC ou de molécules d’adhésions comme la fibronectine. Pour faciliter leur migration, les fibroblastes peuvent sécréter des protéases qui dégraderont la matrice de fibrine et de fibronectine. La prolifération des fibroblastes débute une fois que ces derniers sont dans la plaie et est médiée par les nombreux FCs présents dans la plaie (TGF-β et le PDGF) et par la faible pression partielle d’oxygène présente dans la plaie (hypoxie). Tout en continuant à dégrader la matrice de fibrine, les fibroblastes de la plaie commenceront, sous l’influence de facteurs comme le TGF-β , à synthétiser une matrice riche en fibronectine et en collagène III. Au fur et à mesure que la nouvelle MEC est synthétisée, les fibroblastes adoptent un phénotype myofibroblastique caractérisé par leur forme allongée et la présence de paquets de filaments d’actine le long de leur membrane plasmique. Finalement, grâce à des contacts cellules-cellules et cellules-matrice (médiée par la fibronectine) les myofibroblastes contractent la plaie7 .

La réparation tissulaire repose fortement sur l’action de multiples FCs. Dans cette optique, il n’est pas étonnant que des traitements visant à supplémenter des tissus en reconstruction avec des FCs soient en cours de validation. Une autre approche consisterait en la protection et la potentialisation des FCs endogènes. Dans le tissu sain et dans le tissu lésé, les FCs sont stockés dans la MEC via leurs liaisons avec les HS et avec l’héparine. Lors de la reconstruction tissulaire, la MEC est dégradée et les facteurs qu’elle contient sont alors relâchés. Ceux-ci agissent alors sur de nombreuses étapes de la réparation tissulaire. Toutefois, les FCs sont susceptibles d’être dégradés ou inactivés par l’environnement du tissu en réparation (pH, température, protéases). Des traitements visant à supplémenter en en FCs le tissu en réparation ont connu un certain succès, mais la quantité nécessaire à l’efficacité du traitement causé par la difficulté de rétention de ces FCs est limitante. L’apport d’héparine ou d’HS supplémentaire au site de réparation du tissu apparaît donc comme un moyen efficace de protéger et de potentialiser les FCs endogènes ou exogènes au tissu en réparation. Bien que la capacité de l’héparine à lier certains FCs ait déjà été démontrée, son utilisation in vivo dans le cadre de la régénération tissulaire reste limité due à sa forte activité anticoagulante. Des alternatives combinant les capacités de protection et de potentialisation des HBGF à une faible activité anti-coagulante ont été développées. Celles-ci comprennent l’utilisation de fragments d’héparines de faible poids moléculaire possédant une faible activité anticoagulante, des micro-fragments de gel d’alginate à liaisons croisées avec des héparines25 et l’utilisation de dextran substitués chimiquement pour mimer les caractéristiques de l’héparine et des HS. La partie qui suit se concentrera sur cette classe de molécules.

Les RGTA (de l’acronyme anglais pour r e g enera t ing a gent ) sont une famille de molécules de synthèse, créées pour mimer certaines des propriétés de l’héparine et des HS. Brièvement, ils sont préparés à partir de dextrans de faible poids moléculaire lesquels subissent plusieurs réactions chimiques visant à substituer les groupements OHs actifs (D) du dextran par des groupements sulfates (SO3 -) (S), carboxymethyl (CM), carboxymethylbenzylamide (CMB) et carboxymethylbenzylamide-sulfonate (CMDBS). Les dextrans ainsi substitués sont sélectionnés en fonction de leur capacité à lier les HBGF s comme les FGF s in vitro 29,30. D’autres expériences effectués in vitro ont démontrées que la liaison de ces dextrans substitués à des HBGF comme les FGF s et le TGF-β, les protégeait de la dégradation par plusieurs protéases30,31 . Il a également été démontré que ces dextrans substitués avaient également la capacité d’inhiber in vitro des protéases comme l’élastase du neutrophile, la plasmine32 et la cathépsin G33 . De plus, des résultats non publiés démontrent que les RGTA sont résistants à l’héparanase34 .

Structure de plusieurs dextrans substitués: les RGTAs. Les RGTAs contiennent des sous-unités glycosidiques substituées à différents degrés par des groupements carboxyméthyls (CM), carboxyméthylbenzamide (CMB), carboxyméthylbenzamidesulfate (CMBS) et O- sulfate. Certains des groupements OH réactifs peuvent également être non-substitués (D). Les RGTAs sont également classés selon le degré de substitution de ces différents groupements tant de façon globale (les trois carbones) ou spécifique à chaque carbone contenant un groupement OH réactif (C2=groupements substitués sur les figures; C3 ou C4= groupement OR).

Contrairement à l’héparine, les dextrans substitués décrits précédemment ont une activité anti-coagulante très faible (environ 4 UI par rapport à 170 UI pour l’héparine). Il est donc possible de les utiliser pour aider à la guérison de tissus lésés. Ils peuvent à la fois servir pour délivrer et protéger des HBGFs exogènes et pour protéger les HBGFs endogènes du tissu en réparation. Lorsque utilisés in vivo , la grande majorité de ces dextrans substitués accéléraient la réparation de plusieurs tissus. C’est d’ailleurs de cette capacité que les RGTA s tirent leur nom ( acronyme anglais pour r e g enera t ing a gent ).

Des RGTA s substitués avec des groupements CM, CMB, CMDBS et CMBDS ont été utilisés sur des modèles animaux de réparation des tissus cornéens35 , cutanés36,37 , musculaires34,38 et osseux39 . Cette même catégorie de RGTA s accélére également la guérison de lésions liées à un infarctus40 et d’ulcères gastriques et coloniques41,42 . Dans tous les cas, l’apport de RGTA avec ou sans HBGF s exogènes accélére la réparation tissulaire. L’apport de RGTA se fait dépendamment du tissu lésé de façon locale, par simple injection ou en l’incluant dans une matrice de collagène, ou même de façon systémique.

Une autre catégorie de RGTA s, ceux substitués avec des groupements CMs et ayant subis une O-sulfonation (les CMDS -RGTA s) a également montré des propriétés de protection et de réparation tissulaire de plusieurs tissus. Par exemple, le RG-1503 protège partiellement des mucosites des bajoues chez les hamsters traités avec du 5-fluorouracil, un agent utilisé en chimiothérapie. En plus de diminuer le nombre de mucosites et leur surface, la membrane basale des individus traités était intacte, alors que celle des individus non-traités étaient complètement détruite. En ligne avec ces résultats, Morvan et al. ont également trouvé que le traitement avec RG-1503 ramenait les activités de protéases comme la plasmine, MMP-2 et MMP-9 (et leurs pro-formes) et de leurs inhibiteurs TIMP-1 et TIMP-2 à des niveaux se rapprochant de la normale43 . L’effet de protection des HBGFs in vivo par le RG-1503, n’a toutefois pas été testé, mais pourrait jouer un rôle dans la protection des muqueuses. Le RG-1503 fut également testé dans un modèle de parodontite44 . Il a été démontré que ce RGTA réduit la gravité des parodontites induites chez les hamsters, accélère la réparation des gencives en plus de régénérer le tissu osseux perdu. Comme dans le modèle de mucosite, RG-1503 semble moduler l’expression de pro-MMP-2 et de pro-MMP9 ainsi que l’activité de leurs formes activées. Il est donc possible de dire que les RGTAs contenant des groupements BS ou S semblent avoir des effets positifs sur la régénération des tissus.

Même si in vivo les RGTA s ont, dans la plupart des cas, obtenus des résultats très intéressants, les mécanismes précis régulant l’activité des RGTA s In vivo sont dans la plupart des cas, de pures hypothèses. Une de ces hypothèses veut que les RGTA s agissent à la façon des HSs et lient, protègent et potentialisent les HBGF s présents au site de la plaie, agissant ainsi sur plusieurs mécanismes. Aussi, le RGTA ne semble se lier qu’aux MECs lésées34 et pourrait donc également agir sur la migration cellulaire. C’est pour vérifier ces hypothèses que les RGTA s ont été testés sur différentes lignées cellulaires et sur des modèles de régénération tissulaire (cellules cultivées en monocouche).

Les RGTA s, lorsque utilisés avec le FGF-b ont pour la plupart des effets positifs sur la prolifération des fibroblastes en culture ainsi que sur plusieurs types cellulaires. Par contre, tout comme l’héparine, les CMDS- RGTA ont des effets antiprolifératifs sur les cellules musculaires lisses (CML)31,45,46 . Les RGTA s ont également la capacité de moduler la synthèse de différentes composantes de la MEC produite par les cellules musculaires lisses47,48 . Plus précisément, le RG-1503 ajouté seul au milieu de culture de CML cultivées 24 heures post-confluence diminue la synthèse de collagène de type I et III alors qu’il augmente la synthèse du collagène V. Il est également capable d’agir de façon synergique avec le TGF-β1 et ainsi augmenter la synthèse du collagène V31,46,49 . Lors de ces mêmes expériences, il fut également démontré que le RG-1503 augmentait la quantité de TGF-β1 actif, sans en augmenter la synthèse. Il fut aussi démontré que le RG-1503 a la capacité de normaliser les taux de synthèse des collagènes I, III et V suite à l’irradiation de CML intestinales.

Des expériences effectuées avec des CMDBS- RGTA et des CMBDS- RGTA ont pour leurs parts démontrés que ces types de RGTA augmentent la prolifération des cellules satellites en culture50,51 , ce qui explique en partie pourquoi ces RGTA s sont capables de régénérer les tissus musculaires.

Toutefois, in vitro les RGTA s n’ont pas toujours des effets positifs ou pouvant se corréler avec les résultats obtenus in vivo. Par exemple, bien que les RGTA augmentent la prolifération des ostéoblastes en culture, ceux-ci diminuent grandement leur capacité de migration dans un modèle de réparation de cellules cultivées en monocouche39,52,53 .

En résumé, bien que les expériences sur des cellules cultivées en monocouche aient confirmé certaines hypothèses concernant le mécanisme d’action du RGTA dans l’augmentation de la réparation dans plusieurs tissus, ces expériences ont également démontré que ces mécanismes varient sans doute en fonction du type cellulaire et du tissu affecté. Le type de RGTA semble aussi faire varier les propriétés apparentes, bien que les groupements sulfates semblent jouer le plus grand rôle. Ce dernier fait est tout à fait logique, puisque les groupements sulfates jouent aussi des rôles importants dans les interactions HS- HBGF . Finalement, l’utilisation de cellules confluentes, cultivées en monocouche a ses limites et n’est pas nécessairement représentative des mécanismes entrant en jeu dans l’environnement tridimensionnel du tissu endommagé.

Les substances comme les RGTA accélèrent la réparation de tissus endommagés. Celles-ci sont toutefois inefficaces lorsque les dommages tissulaires sont trop importants ou lorsque les tissus sont complètement détruits. Le traitement de ce genre de lésions requiert plutôt le remplacement du tissu affecté ou détruit. Toutefois, le don d’organe au Canada et aux États-Unis n’est pas encore assez répandu pour répondre de façon adéquate à la demande. Aussi, les problèmes reliés au rejet des tissus ou organes greffés et aux traitements visant à supprimer ce rejet restreignent quelque peu leurs utilisations. Les récents progrès en culture cellulaire et en génie des biomatériaux ont généré un nouveau champ d’études: le génie tissulaire. Le génie tissulaire consiste en la production in vitro de tissus et éventuellement d’organes ayant plusieurs ou idéalement toutes caractéristiques de leurs contre-parties naturels. En effet, des équivalents cornéens, cutanés, ligamentaires, vasculaires ainsi que plusieurs autres tissus et organes plus complexes (par exemple: valve) font l’objet d’études et de développement à travers le monde. À long terme, le génie tissulaire se montre donc une solution au manque d’organe. Beaucoup de progrès devront cependant avoir lieu avant que le génie tissulaire ne remplisse son plein potentiel.

Présentement, les tissus produits par génie tissulaire peuvent être divisés en trois grandes catégories en fonction des éléments les constituant. Un équivalent tissulaire peut être constitué uniquement de cellules, être une MEC qui sera colonisée par les cellules de l’hôte (biomatériaux) ou constitué de cellules intégrées dans une MEC. Les équivalents tissulaires peuvent encore se complexifier et intégrer plusieurs types cellulaires et plusieurs MEC. Ce mémoire portant principalement sur la peau, seul les modèles d’équivalents cutanés seront abordés. Ils peuvent être divisés en trois grandes catégories: les équivalents épidermiques, les équivalents dermiques et les équivalents cutanés complets. Une attention particulière sera portée sur leurs utilisations dans le cadre du traitement des patients grands brûlés.

Certains types de tissus reconstruits ne contiennent aucune MEC et ne sont constitués que de cellules. Ce type de tissu reconstruit se limite toutefois aux épithélia cultivés in vitro , aussi appelés feuillets épidermiques (FEs). Dans un FE, les cellules épidermiques en culture, s’arrangent en une structure rappelant l’épiderme normal. Pour se faire, les cellules sont cultivées jusqu’à confluence, après quoi certaines des cellules enclencheront leur processus de différenciation. Il en résultera un feuillet cohésif de cellules pouvant comporter plusieurs couches de cellules différenciées correspondant aux différentes couches de l’épiderme normal. Le FE doit toutefois être amené à l’interface air-liquide (en culture ou lors de la greffe) pour que celui-ci produise toutes les couches retrouvées dans un épiderme normal. De tels FEs, ont un patron d’expression des kératines et des marqueurs de différenciation semblable à l’épiderme normal. Le protocole maintenant utilisé s’inspire de celui décrit pour la première fois par Green et al.54 et est décrit plus en profondeur dans le chapitre 2 dans la section Matériel et méthodes. Les évènements les plus importants ayant permis la production de FE sont sans doute l’utilisation d’enzymes (thermolysine) permettant la séparation du derme et de l’épiderme55 ; l’élaboration du milieu de culture adéquat et de la technique de co-culture avec des 3T3 irradiés et l’utilisation de la dispase pour détacher les feuillets du flacon de culture sans pour autant détruire la cohésion des cellules du feuillet 5,54 .

L’utilité des FEs dans le cadre du traitement des grands brûlés fut réalisée dès leur apparition et par conséquent, les FEs ont été à la fois les premiers tissus produits in vitro à être greffés chez l’humain et la première utilisation thérapeutique des cellules souches. En effet, le traitement traditionnel des brûlures au troisième degré consiste à greffer de la peau saine sur le site affecté. Toutefois, dans le cas des grands brûlés, la surface de peau saine est insuffisante pour couvrir tous les sites affectés. La greffe de peau cadavérique, ne peut non plus être utilisée pour des greffes permanentes. Elle est plutôt greffée de façon transitoire afin de préparer le site affecté à recevoir des greffes autologues. Le greffon préalablement prélevé d’un site non-affecté est alors traité par un appareil qui augmente sa surface de quatre fois en le transformant en filet. Les FEs furent également utilisés pour couvrir directement les sites affectés débridés (nettoyés des tissus morts ou endommagés)56 . Le taux de prise des feuillets dépend toutefois de plusieurs facteurs tels la qualité du site receveur, de la présence de tissu dermique et même du centre de traitement57-61 . Conséquemment, cette technique n’est utilisée que pour les très grands brûlés. Alternativement, les FEs peuvent servir à régénérer plus rapidement les sites donneurs, ce qui diminue le temps entre les récoltes de greffons sur un même site donneur. L’épiderme ainsi greffé se régénère normalement tout au long de la vie de l’individu. Ceci, ajouté au fait qu’une sous-population de cellules du feuillet exprimait la kératine 19, démontre que les feuillets produits par la méthode précédemment décrite contiennent bel et bien des cellules souches épidermiques.

Bien que la culture de FEs sur plastique fonctionne bien, elle comporte tout de même certains désavantages. Par exemple, pour être détachés, les feuillets doivent subir un traitement avec la dispase. Ce traitement demande beaucoup de temps, un personnel technique qualifié, en plus de requérir du matériel spécialisé. De plus, les feuillets doivent être immédiatement greffés, car il a été démontré que leur viabilité décroît six heures après leur décollement ou leur congélation60 . Aussi, les feuillets décollés sont très fragiles et difficilement manipulables. Ils sont donc soutenus par une gaze stérile qui est déposée sur le dessus du FE et attachée à l’aide de broches. Encore une fois, cette étape requiert un personnel qualifié et un équipement spécialisé. Finalement, les feuillets décollés contractent et peuvent perdent jusqu’à 40% de leur surface initiale. Même dans le cas où les FEs sont préalablement attachés aux gazes stériles, la perte de surface est tout de même très importante. De plus, l’effet du traitement à la dispase sur la qualité des feuillets et sur leur taux de prise, n’est pas encore connu. C’est donc pour toutes ces raisons ainsi que pour leur coût de production élevé (variable selon le pays) que l’utilisation des FEs n’est pas encore répandu. Des matrices alternatives à la culture sur plastique comme les membranes biologiques et synthétiques62,63 , les gels de collagènes64-66 et des matrices de fibrines67-72 font l’objet d’études.

La fibrine, joue un rôle important dans la migration des kératinocytes lors de la réépithélialisation tant in vivo que in vitro . Un produit disponible commercialement, la colle de fibrine, mime les dernières étapes de la cascade de la coagulation (via l’activation du fibrinogène par la thrombine) pour produire un caillot constitué de fibrine et de facteur XIIIa (voir fig. 5). La colle de fibrine est déjà utilisée comme colle chirurgicale et comme agent hémostatique au Canada, au Japon et dans plusieurs pays européens. L’application de colle de fibrine sur le site de greffe augmente de façon significative la prise et la résistance des FEs humains greffés sur des souris atymiques 68 . La fibrine pourrait donc soutenir la croissance des kératinocytes et constituer un support physique adéquat pour le transport des FE.

La polymérisation de la colle de fibrine rappelle les dernières étapes de la coagulation in vivo

Certaines équipes ont donc entrepris d’adapter les techniques de culture de kératinocytes pour les cultiver sur la colle de fibrine67,68,70 ou dans une matrice faite de colle de fibrine69,73,74 . D’autres groupes ont pour leurs parts démontré que la clonogénicité des kératinocytes n’était pas affectée par la culture sur colle de fibrine et que ce système de culture conservait aussi efficacement les cellules épidermiques souches que la culture sur plastique68,69,75 . La culture sur colle de fibrine ne semble pas non plus affecter le patron d’expression des marqueurs de différenciation des kératinocytes69 . Les kératinocytes cultivés sur la colle de fibrine sont capables d’atteindre la confluence et de former des FEs avec une efficacité similaire aux cellules cultivées sur le plastique68,70. Des FEs cultivés sur colle de fibrine ont été transplantés avec succès sur des cornées endommagées75 et dans le cadre du traitement de brûlures cutanées68,70 .

Ce mémoire a pour objectif général l’optimisation de deux tissus reconstruitspar génie tissulaire: l’équivalent épidermique et l’équivalent dermique.

La deuxième partie de ce mémoire vise à vérifier l’effet du RGTA sur des systèmes de culture monocouche et d’auto-assemblage.

La technique de production des feuillets dermiques par auto-assemblage est au point et est déjà utilisée pour produire une variété de tissus par génie tissulaire, pouvant être utilisés comme modèles d’études ou dans certains cas, pouvant être greffés. Toutefois, la production de ces feuillets est onéreuse en plus de nécessiter un temps de culture d’au moins un mois. Ces inconvénients limitent l’application de cette technologie dans le cadre clinique où il y aurait un grand avantage à obtenir des tissus plus rapidement.

Les RGTA en général ont un effet positif sur la prolifération des fibroblastes. De plus, les RGTA -CMDS modulent la synthèse collagénique des cellules musculaires lisses en culture monocouche. Aussi, lorsque utilisés in vivo, ils aident à la réparation tissulaire en ayant des effets sur la prolifération, la migration et des effets positifs ou négatifs sur le dépôt de MEC. L’environnement tridimensionnel des tissus reconstruits peut être représenté comme étant à mi-chemin entre l’environnement des cultures monocouches et l’environnement d’un tissu normal. Étant donné les effets des RGTA -CMDS tant in vivo qu’ in vitro , il semblait logique d’évaluer si le RGTA a également des effets bénéfiques dans le cadre de la production des feuillets dermiques créés avec la méthode d’auto-assemblage.

Le principal RGTA utilisé se nomme RGTA 26 et est un RGTA -CMDS. Il n’a fait l’objet d’aucune publication antérieure, mais des RGTA s de structures et possédant des degrés de substitutions similaires ont été testés tant in vivo qu’ in vitro . L’effet du RGTA 26 a d’abord été testé dans un système de culture monocouche, afin de connaître son effet sur la prolifération cellulaire. Le RGTA fut également ajouté au milieu de culture des feuillets dermiques pour vérifier son effet sur des critères comme le temps de production des feuillets produits, leurs apparences macroscopique et microscopique, leur qualité, l’abondance et l’organisation de leur MEC et leurs propriétés mécaniques. Dans les deux cas, des concentrations de 10μg/mL, 5μg/mL, 2.5μg/mL, 1μg/mL, 0.1μg/mL, 0.01μg/mL, 0.001μg/mL de RGTA 26 furent testées.

© Éric Boucher, 2005