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Chapitre II: Matériel et méthodes

Table des matières

Les dextrans substitués utilisés lors de ces expériences ont été généreusement fournis par le Pr. Denis Barritault (Laboratoire de Recherche sur la Croissance Cellulaire et la Réparation Tissulaire (CRRET), Centre National de la Recherche Scientifique (CNRS), Université Paris-12, France). Les dextrans substitués ont été préparés tel que précédemment décrit32 . Brièvement, un dextran de faible poids moléculaire (T40; 40KDa), subit d’abord une carboxyméthylation sur ses résidus OH libres (réactifs). Les résidus OH restants sont ensuite O -sulfatés par l’addition d’acide chlorosulfonique en présence de dichlorométhane. La présence des différents groupements actifs était confirmée par spectroscopie infrarouge. Le degré de substitution (d.s.) moyen de chaque groupement fonctionnel (OH, CH2 COONa, OSO3 Na) sur une sous-unité glycosidique fut déterminé par titration acide et confirmé par RMN-H132 . Les RGTAs utilisés lors de ces expériences étaient des RGTA partiellement carboxyméthylés O -sulfatés (CMDS; D=groupements OH). Les d.s. spécifiques et globaux pour chaque groupement actif sont regroupés au sein du tableau 3. L’analyse du signal du proton aniomérique par RMN-H1 a également permis de connaître le d.s. de chaque groupement réactif (maximum de 100%), situé sur le carbone C2 . Le poids moléculaire moyen du dextran substitué était de 110 KDa. À leur réception, les RGTAs lyophilisés étaient solubilisés dans du sérum physiologique (solution aqueuse 0.85% NaCl) à une concentration de 4mg/mL, aliquotés et entreposés à – 80°C.

Les d.s. globaux (d.s. des 3 carbones réactifs, donc une valeur maximale de 300%) et spécifiques (un seul carbone réactif; valeur maximale de 100%) ont été déterminés par titration acide et RMN-H1 . Les d.s. du RGTA26 sont en rouge et les d.s. du RGD120B108 sont en bleu.

*d.s. total d’un groupement fonctionnel particulier sur les trois carbones réactifs (ayant un groupement OH libre) d’une sous-unité glycosidique.

** d.s. d’un groupement fonctionnel particulier sur un ou deux des trois carbones réactifs (ayant un groupement OH libre) d’une sous-unité glycosidique.

Les fibroblastes humains utilisés pour les études concernant le RGTA étaient cultivés dans du Dulbecco-Vogt modification of Eagle’s medium (DME) (Invitrogen, Oakville, Ontario, Canada) supplémenté de 10% de sérum de veau foetal (Hyclone, Scarborough, Ontario, Canada), de 100 UI/mL de pénicilline G (Pen) (Sigma) et de 25 μg/mL de sulfate de gentamicine (Gen) (Schering Inc., Pointe-Claire, Canada). Les milieux de culture spécifiques aux expériences de prolifération et à la production de feuillets dermiques sont décrits dans les sous-chapitres appropriés.

Les fibroblastes humains utilisés lors des expériences concernant le RGTA ont été isolés par digestion enzymatique du derme de peau normale humaine prélevée lors d’une réduction mammaire d’une femme de 23 ans ou de prépuce de nouveau-né. Le derme et l’épiderme furent séparés comme décrit précédemment77 . Les cellules ainsi isolées étaient congelées à une concentration de deux millions de cellules/mL d’un milieu de congélation constitué de 10% DMSO dans du sérum de veau foetal. Lorsque nécessaire, les cellules étaient décongelées dans du milieu froid, vérifiés pour leur viabilité et ensemencées à 6.67x103 cellules/cm2 .

Pour les expériences de prolifération, les fibroblastes humains étaient ensemencés à une concentration de 2.6x103 cellules/cm2 dans des plaques six puits, traitées pour la culture cellulaire. Les cellules étaient laissées à adhérer toute la nuit dans du DME +10% SVF +P/G. Le milieu était alors changé par un milieu contenant peu de sérum (DME +0.5% SVF + Pen/Gen) pour 24 heures afin de synchroniser le cycle cellulaire des cellules. Les cellules étaient enfin cultivées dans des milieux DME + 10% SVF + Pen/Gen contenant 10, 5, 2.5, 1, 0.1, 0.01 ou 0.001μg/mL de RGTA ou dans un milieu contrôle ne contenant pas de RGTA. Alternativement, les cellules étaient cultivées dans des milieux composés de DME 0.5% SVF + Pen/Gen + 0.35ng/mL FGF-b ( facteur de croissance du fibroblaste, basique aussi appelé FGF-2 ; acronyme de la terminologie de langue anglaise, Fibroblast growth factor-basic ) (Chemicon) + différentes concentrations de RGTA ou d’héparine (Leo pharma inc.). Les milieux étaient changés aux 48 heures, jusqu’à ce qu’un des puits atteigne la confluence ou qu’une différence marquée apparaisse entre les puits des cellules cultivées en présence de différentes concentrations de RGTA.

II.5. Mesure de la prolifération cellulaire par l’incorporation de thymidine-3 H

Pour les expériences de mesure de l’activation de la prolifération cellulaire par une molécule via l’incorporation de thymidine-3 H, les fibroblastes étaient ensemencés à une concentration de 5x103 cellules/cm2 dans des plaques six puits traitées pour la culture cellulaire. À 85% confluence, le sérum était retiré (DME +0.5% SVF + Pen/Gen) pour 24 heures afin de synchroniser le cycle cellulaire des cellules. Les cellules étaient enfin cultivées dans des milieux DME + 10% SVF + P/G et contenant 10, 5 et 1 μg/mL de RGTA ou dans un milieu contrôle ne contenant pas de RGTA. Alternativement, les cellules étaient cultivées dans des milieux composés de DME 0.5% SVF + Pen/Gen + 0.35ng/mL FGF-b (Chemicon) + différentes concentrations de RGTA ou d’héparine. Les cellules étaient marquées par l’ajout de 0.5μCi/puits de thymidine tritiée. Les cellules étaient cultivées pendant 24 heures. Le milieu était alors retiré et les cellules fixées avec de l’acide trichloroacétique (TCA). L’excès de radioactivité était alors lavé à l’eau courante. L’ADN marquée à la thymidine-3 H était alors extrait via un traitement au NaOH 0.3N. La quantité de radioactivité incorporée pour chaque puits était alors mesurée en désintégration par minute (DPM) avec un compteur béta. La prolifération cellulaire était mesurée par rapport aux contrôles 0.5% SVF ou 10% SVF et calculée selon l’équation 1.

Équation 1 : % de variation dans la prolifération cellulaire évalué par l’incorporation de thymidine-3 H

% de variation dans la prolifération cellulaire = X 100

Les feuillets dermiques reconstruits par auto-assemblage ont été produits selon le protocole précédemment décrit77 avec quelques modifications (voir figure 7). Brièvement, des fibroblastes ont été ensemencés dans des pétris de culture cellulaire de 35 mm de diamètre. Après 24 heures (pour s’assurer de l’adhésion adéquate des cellules), les cellules étaient cultivées en présence de 50μg/mL d’acide ascorbique pendant 30 jours. Pour tester l’effet du RGTA sur les feuillets produits, différentes doses de RGTA (10, 5, 2.5, 1, 0.1, 0.01, 0.001 μg/mL) furent également ajoutées. Les solutions de RGTA étaient préparées par dilution séquentielle avant chaque changement de milieu. L’acide ascorbique était alors ajouté à chaque milieu. Les feuillets contrôles étaient cultivés normalement, sans RGTA et avec la même concentration d’acide ascorbique.

Après 30 jours de culture, une partie des feuillets furent utilisés pour évaluer l’influence du RGTA sur la contractilité des feuillets. Brièvement, les feuillets étaient complètement détachés de leur pétri à l’aide de pinces. Ils étaient laissés à contracter dans leur milieu de culture, à 37°C sous atmosphère contrôlée (8% CO2 ) pour 5, 15 et 30 minutes. Pour évaluer la contraction de chaque feuillet, le milieu de culture était retiré et une photo du feuillet contracté était prise dans son pétri. La surface des feuillets ancrés (correspond à la surface interne du pétri) et détachés (contractés) a été mesurée avec le logiciel d’analyse d’image Scion image. Les pourcentages de contraction furent calculés selon l’équation suivante:

Équation 2 : Calcul du pourcentage de contraction des feuillets

% Contraction = X 100

Après 30 jours de culture, des biopsies des feuillets épidermiques furent prises. Certaines étaient fixées dans l’histochoice et incluses dans la paraffine et d’autres incluses dans l’OCT et conservées à -80°C. Des coupes de 5μm étaient effectuées à partir des tissus inclus dans la paraffine et colorées au trichrome de Masson. D’autres coupes de 5μm étaient préparées à partir des tissus cryopréservés dans l’OCT. Ces coupes ont, par la suite, été traitées pour des marquages immunohistologiques, tel que décrit précédemment. Brièvement, les coupes étaient fixées dans l’acétone (10 minutes à -20°C), incubées avec l’anticorps primaire pendant 45 minutes et ensuite avec l’anticorps secondaire (conjugué) durant 30 minutes. Une contre-coloration des noyaux au Hoechst 33258 était également effectuée. Les anticorps primaires utilisés étaient des anticorps de souris dirigés contre le collagène I humain (Chemicon #19040180; dilution 1/25), le collagène III humain (Chemicon #19070215; dilution 1/200), le collagène V humain (Chemicon #13.2; dilution 1/20) et des anticorps de lapin dirigés contre le collagène IV humain (Chemicon #220195103; dilution 1/200) et le collagène VI humain (Institut Pasteur; dilution 1/50). Le marquage secondaire a été effectué avec des anticorps de chèvre dirigés contre des IgG de souris (Chemicon #23112861; dilution 1/200) ou de lapin (Chemicon #18060760; dilution 1/200) couplés au DTAF. Toutes les coupes ont été observées avec un microscope Nikon Optiphot (Tokyo, Japan) équipé d’un système d’épifluorescence, et photographiées avec une caméra numérique CCD Cool Snap (photos histologiques) ou avec une caméra numérique CCD Sensys (pour les photos d’immunofluorescence sur coupes congelées). L’épaisseur des feuillets était déterminée avec Scion Image en utilisant une calibration appropriée. Afin de minimiser les erreurs dues à la variabilité d’épaisseur à l’intérieur d’un même feuillet, plusieurs biopsies (minimum de 2, maximum de 5; sur coupe paraffinée) furent prises par feuillet. Deux champs (photos) étaient pris par biopsie avec un minimum de 10 mesures par champ.

Les surnageants de culture ont été recueillis au cours des expériences de production de feuillets dermiques, filtrés sur un filtre 0.45μm (pour enlever les débris cellulaires), séparés en aliquotes et entreposés à -80°C. Avant leur utilisation, les aliquotes étaient laissées à dégeler à 4°C. Les analyses zymographiques ont étés effectuées dans des gels de polyacrylamide à 8.5%, contenant 0.1% de gélatine (Ficher G8 500). Les gels de séparation étaient préparés en ajoutant 3.9mL d’un tampon de séparation (contenant 1.5M Tris-HCl et 2mL d’une solution aqueuse de sodium dodecyl sulfate 20% (SDS), le tampon étant ajusté à pH 8.8 et à un volume final de 100mL), 4.4 mL d’une solution aqueuse d’acrylamide 30% + bis-acrylamide 0.8% et 5.7 mL d’eau distillée. Les gels de séparation ne contenaient pas de gélatine et consistaient en des gels de polyacrilamide 5% préparés à partir de 3.75 mL de tampon d’entassement (contenant 0.5M de Tris-HCl et 2mL d’un solution aqueuse à 20% SDS, le tampon étant ajusté à pH 8.8 et à un volume final de 100mL), de 2.5mL d’un solution acrylamide 30% + bis-acrylamide 0.8% et de 8.75 mL d’eau distillée. Les gels étaient polymérisés via l’addition de 50μL (pour les gels de séparation) ou de 90μL (pour les gels d’entassement) de persulfate d’ammonium 10% (Bio-Rad) et 20uL de N,N,N’,N’ -tetramethylethylenediamine (TEMED) (Bio-Rad). Afin de faciliter l’observation des gels, les échantillons étaient d’abord dilués dans un volume approprié d’eau distillée (la dilution choisie était de 1/3), puis dans un tampon non-réducteur (1:1) (contenant 4 mL glycérol, 6mL SDS 20%, 2.5mL tampon d’entassement, 2,5mL bleu de bromophénol 0,1% et 5mL d’eau distillée). Afin de maximiser la séparation des bandes, les gels ont subi une électrophorèse de 2h45 sous un ampérage constant de 15mA. Les gels ont alors subi deux lavages de 15 minutes (sous agitation mécanique) dans une solution de Triton X-100 à 2.5% afin d’éliminer le SDS des gels. Le triton X-100 fut pour sa part retiré par deux lavages à l’eau distillée. Finalement, les gels furent incubés pendant 16 heures à 37°C (sous agitation mécanique) dans un tampon ajusté à pH 7.5 et contenant 0.5M Tris-HCl, 13.24mM CaCl2 et 1.8μM ZnCl2 at pH 7.5. Suivant ce traitement, les gels étaient fixés dans une solution constituée de 40% de méthanol et 10% d’acide acétique pour au moins une heure, puis colorés dans la même solution plus 0.05% de bleu de coomassie. Les gels étaient ensuite légèrement décolorés (dans la solution fixatrice), séchés et numérisés (Microtek 8700). L’activité gélatinase apparaissait comme des bandes claires de différentes intensités sur un gel bleu (voir figure 7). Les résultats concernant MMP2 et MM9 furent normalisés par rapport aux bandes correspondantes d’un standard commercial (2.5μg/mL) contenant MMP-2 et MMP-9 (contient des pro-formes et des formes actives en plus des homo et hétéro-dimers) (Chemicon, #21010662). Les résultats concernant la collagénase (bandes MMP1), étaient pour leurs parts exprimés en fonction du contrôle étant donné que ni le standard ni le milieu de culture ne contenait une forme ou un autre de MMP1.

La quantité de MMP1 (forme clivée et quantité totale) et du peptide C-terminal du procollagène de type I fut évaluée par ELISA (acronyme de la terminologie anglaise Enzyme-linked immunosorbent assay; Titrage immunoenzymatique utilisant un antigène adsorbé). Les manipulations étaient effectuées selon les instructions du manufacturier. Les résultats concernant le dosage de MMP1 proviennent d’un seul dosage. Le peptide C-terminal du procollagène de typeI fut pour sa part dosé en duplicata pour chaque triplicata de conditions (Contrôle, 0.01μg/mL, 0.1μg/mL, 1μg/mL, 2.5μg/mL, 5μg/mL, 10μg/mL RGTA26; surnageants prélevés après 28 jours de culture) provenant de deux expériences individuelles. Les plaques ont été achetées chez Takara Bio Inc (Japon; #MK101).

© Éric Boucher, 2005