Collection Mémoires et thèses électroniques
Accueil À propos Nous joindre

Chapitre IV: Résultats: EFFETS D’UN DEXTRAN SUBSTITUÉ SUR LA PROLIFÉRATION CELLULAIRE ET LA PRODUCTION DE FEUILLETS DERMIQUES

Table des matières

Les effets d’un RGTA sur des cellules humaines, dans un modèle de culture à long terme et dans un modèle de culture en trois-dimensions, n’ont pas encore été étudiés. Le chapitre suivant présente les résultats relatifs à ces modèles de culture cellulaire.

Dans un premier temps, l’efficacité du RGTA26 fut testée dans les conditions de cultures utilisées lors de la production de FDs, c’est-à-dire en présence de DME + 10% SVF + Pen/Gen. L’efficacité du RGTA26 fut vérifiée à des doses de 10μg/mL, 5μg/mL, 2.5μg/mL, 1μg/mL, 0.1μg/mL, 0.01μg/mL et 0.001μg/mL. La prolifération cellulaire a été évaluée en comparant les décomptes cellulaires de puits contenant initialement un nombre identique de cellules. Le cycle cellulaire des cellules a été arrêté par le retrait de sérum avant l’ajout du RGTA. Les résultats sont exprimés en pourcentage du nombre de cellules dans les puits contrôles. La figure8 présente les résultats compilés de sept expériences individuelles effectuées en triplicata sur la même lignée cellulaire utilisée lors des expériences de production de FDs. L’ajout du RGTA26 à un milieu de culture contenant 10% SVF module la prolifération cellulaire de façon dose-dépendante, l’effet maximal étant atteint à 1μg/mL. Même à cette concentration, le RGTA26 n’a qu’un effet modérément positif sur la prolifération cellulaire et n’augmente que de 10% le nombre de cellules par rapport au contrôle (p<0.01). À concentration élevée, les effets du RGTA26 sont inversés, réduisant la croissance cellulaire de 10% et de 15% pour des concentrations de 5μg/mL et 10μg/mL respectivement (p<0.01). Les autres concentrations suivent une courbe dose-réponse, mais les quantités de cellules ne sont pas statistiquement différentes des contrôles.

*: Différences significatives par rapport au contrôle (p<0.01)

**:n=2

Afin de confirmer les résultats obtenus en présence de 10% SVF, la capacité de potentialisation du RGTA26 envers un HBGF, le FGF-b , a également été vérifiée. Le protocole utilisé est décrit en détail au chapitre II. Le FGF-b fut choisi pour sa disponibilité et parce que plusieurs RGTAs sont capables de potentialiser son action40;74 . La concentration de 0.35ng/mL a été choisie pour refléter la littérature40 . La potentialisation du FGF-b était évaluée par une augmentation de la croissance cellulaire par rapport à celle d’un puits contrôle cultivé en présence de 0.5% SVF + Pen/Gen + 0.35ng/mL FGF-b . Les autres contrôles consistaient en un contrôle 10% SVF, un contrôle 0.5% SVF et une série de contrôles cultivés en présence de 0.01μg/mL, 0.1μg/mL, 1μg/mL, 5μg/mL et 10μg/mL RGTA26 + 0.5% SVF, mais en l’absence de FGF-b. Les résultats sont exprimés en fonction du contrôle 0.5% SVF, qui reflète le nombre de cellules initialement présentes dans chaque puits. La figure 9 montre les résultats compilés de deux expériences représentatives effectuées indépendamment. Premièrement, il est apparent que l’ajout de FGF-b a un effet positif sur la croissance cellulaire. En effet, toutes les conditions ayant reçu le facteur de croissance ont augmenté significativement leur croissance cellulaire d’environ 43%. Toutefois, seule la concentration de 5μg/mL RGTA26 est significativement différente du contrôle 0.5% SVF + 0.35ng/mL FGF-b et augmente la croissance cellulaire de 43% par rapport au dit contrôle.

*: Différences significatives par rapport au contrôle 0.5% SVF + 0.35ng/mL FGF-b; p < 0.05

**:Différences significatives par rapport au contrôle 0.5% SVF ; p < 0.05 (pour les contrôles RGTA26 +0.5% SVF)

Le pourcentage de croissance était calculé avec l’incorporation de thymidine-3H sur des cellules à 85% confluence cultivées pendant 24 heures dans un milieu 10% SVF contenant différentes concentrations de deux RGTA-CMDS et d’héparine. Les résultats sont exprimés par rapport au contrôle 10% SVF (voir équation 2).

*= significativement différent du contrôle 10% SVF.

**=significativement différent des autres concentrations de RGTA26

***= significativement différent des autres concentrations de RGTA D120B108

Une méthode alternative et beaucoup plus sensible d’évaluer la croissance ou la prolifération cellulaire est de mesurer l’influence du traitement sur l’incorporation de thymidine tritiée par les cellules. Les expériences précédentes furent donc reprises dans le cadre d’un protocole d’incorporation de thymidine tritiée (voir chapitre II.5). Les effets d’un autre RGTA (lot D120 B104) ayant des d.s. similaires à ceux du RGTA26 (voir tableau 3) a également été testé. Le pourcentage de croissance cellulaire était calculé selon le nombre de DPM de l’échantillon (voir équation 1). Chaque condition a été effectuée en triplicata. Le sous-chapitre présente les résultats obtenus lors de cette expérience préliminaire.

La figure 10 regroupe les résultats concernant les milieux de culture contenant 10% SVF + RGTA26, RGTA D120B108 et un contrôle avec héparine. Contrairement aux expériences de la section IV.1.1, l’expérience d’incorporation de thymidine-3 H montre que le RGTA26 n’est pas capable d’induire une hausse de prolifération lorsqu’il est utilisé à une concentration de 1μg/mL. En effet, l’analyse statistique (test t de Student) des données a montré que le pourcentage de croissance des cellules cultivées dans ces conditions n’était pas significativement différent que celui des cellules cultivées dans le contrôle (10% SVF). La diminution de croissance cellulaire attribuée à des concentrations de 5μg/mL et 10μg/mL de RGTA26 est toutefois conservée. Cette diminution est toutefois perçue comme beaucoup plus intense (53% et 46% du contrôle par rapport à 91% et 83%). Étonnement, le RGTA D120 B108 n’a pas donné des résultats similaires à ceux obtenus avec le RGTA26. En effet, bien que le RGTA D120B108 semble induire une diminution générale de la croissance cellulaire par rapport au contrôle, cette diminution suit une courbe dose-réponse différente de celle observée pour le RGTA26. Comme on pouvait s’y attendre, l’héparine a eu des effets similaires aux RGTAs en causant une diminution significative de la prolifération dépendante de sa concentration.

La figure 11 regroupe les résultats de l’expérience visant à évaluer la capacité des RGTA26 et D120B108 à potentialiser l’effet du FGF-b . Les résultats de l’évaluation par l’expérience d’incorporation de thymidine des capacités de potentialisation du FGF-b par le RGTA26 sont en parfait accord avec les résultats obtenus en décompte cellulaire (voir figure 9). Premièrement, toutes les conditions ayant reçu le facteur de croissance et le RGTA26 ont augmenté significativement leur croissance cellulaire d’un facteur de 1.25. Encore une fois, seule la concentration de 5μg/mL RGTA26 augmentait significativement la croissance cellulaire (d’un facteur de 1.73) par rapport contrôle 0.5% SVF + 0.35ng/mL FGF-b . Encore une fois, le RGTAD120 B108 n’a pas eu la même action que le RGTA26. En effet le RGTAD120 B108 a été incapable de potentialiser le FGF-b et a même causé une diminution de la croissance par rapport au contrôle 0.5% SVF + 0.35ng/mL FGF-b .

Le pourcentage de croissance était calculé à partir de l’incorporation de thymidine-3 H sur des cellules à 85% confluence cultivées pendant 24 heures dans un milieu 0.5% SVF contenant différentes concentrations de deux RGTA-CMDS avec ou sans FGF-b . Les résultats sont exprimés par rapport au contrôle 0.5% SVF (voir équation 2).

*= significativement différent du contrôle 0.5% SVF + 0.35ng/mL.

**=significativement différent des autres concentrations de RGTA26 + 0.35ng/mL.

***=significativement différent des autres concentrations de RGTA2 D120B108

Des FDs ont été cultivés selon le protocole habituel (contrôle) et en présence de 0.001μg/mL, 0.01μg/mL, 0.1μg/mL, 1μg/mL, 2.5μg/mL, 5μg/mL et 10μg/mL de RGTA26. Chaque condition a été effectuée en triplicata et répétée de 3 à 5 fois.

Les FDs cultivés en présence des concentrations les plus élevées de RGTA semblaient sécréter leur MEC plus tard que les feuillets contrôles (observations au contraste de phase corroborées par un observateur à l’aveugle). Une fois les 30 jours de culture complétés, les feuillets dermiques produits par auto-assemblage étaient détachés de leur pétri ou fixés pour fin d’analyses histologiques. Macroscopiquement, les FDs produits en présence de 10μg/mL, 5μg/mL et dans une moindre mesure avec 2.5μg/mL, semblaient avoir une organisation différente des FD contrôles (voir figure 12), les points blancs des feuillets étant plus concentrés, mais en moins grand nombre. De plus, leur manipulation a permis de faire apparaître des différences significatives dans la résistance mécanique des feuillets. En effet, les feuillets produits en présence de 2.5μg/mL, 5m g/mL et 10m g/mL de RGTA26 étaient beaucoup plus fragiles que les feuillets contrôles. La différence entre les FDs cultivés en présence de RGTA et les FDs contrôles était telle que les FDs avaient une texture visqueuse, contrairement aux FDs contrôles qui possédaient une texture élastique, mais solide. Ces observations ont pu être répétées au long des cinq expériences individuelles et ont été corroborées par plusieurs observateurs à l’aveugle.

Une fois détachés de leur pétri, tous les FDs ont commencé à contracter pour atteindre une valeur maximale après 30 minutes. La figure 13 montre la compilation des valeurs obtenues lors de deux expériences de contraction indépendantes. Les valeurs sont exprimées en pourcentage de la surface initiale du feuillet et ont subi une analyse statistique au test t de Student. Une variation dose-dépendante du pourcentage de contraction (voir Chapitre 2, Équation 2) a été observée. L’augmentation de la contraction n’était toutefois pas significative pour les concentrations inférieures de RGTA26 (0.1μg/mL, 0.01μg/mL et 0.001μg/mL) et atteignait sa valeur maximale avec 5μg/mL et 10μg/mL RGTA26. Des résultats similaires ont été observés qualitativement au cours de quatre expériences indépendantes.

*:Différences significatives par rapport au contrôle (0μg/mL) ; p<0.03, N=2

Les feuillets ont également été observés au niveau microscopique, à partir de coupes paraffinées de 5μm des FDs colorées au trichrome de Masson. Afin de minimiser les variations d’organisation et d’épaisseur due à la contraction, les feuillets étaient fixés à l’histochoice directement dans le pétri préalablement à leur découpage et à l’inclusion des biopsies dans la paraffine. La figure 14 montre des champs de coupes provenant d’une même expérience, mais représentatives de cinq expériences individuelles. Les cellules sont colorées en rose, alors que la MEC (collagènes) est colorée en bleu. Les feuillets contrôles étaient relativement épais et contenaient de nombreuses cellules ainsi qu’une MEC épaisse et dense (figure 14-A). Par contre, les feuillets produits en présence de 10μg/mL de RGTA26 étaient minces, constitués d’environ deux couches de cellules et n’avaient pas ou très peu de MEC visible (figure 14-D). Les feuillets produits avec 5μg/mL (figure 14-C) et 2.5μg/mL de RGTA26 (figure 14-B) avaient des caractéristiques intermédiaires par rapport aux feuillets contrôles et 10μg/mL RGTA26. Par exemple, les feuillets produits en présence de 5μg/mL, bien qu’ayant une épaisseur et un nombre de cellules semblable aux feuillets produits avec 10μg/mL, montrent une quantité de MEC plus abondante. De la même façon, les feuillets produits avec 2.5μg/mL montrent un grand nombre de cellules, mais beaucoup moins de MEC visible que les feuillets contrôles. Les feuillets produits en présence de faibles concentrations de RGTA26 (0.01μg/mL et 0.001μg/mL) étaient pratiquement identiques aux contrôles alors que ceux produits en présence de 1μg/mL et 0.1μg/mL de RGTA26 ressemblaient aux feuillets produits avec 2.5μg/mL, mais avec une MEC visible plus dense (figures non-montrées).

Coupes histologiques de feuillets dermiques contrôles (A) et cultivés en présence de 2.5μg/mL (B), 5μg/mL (C) et 10μg/mL (D) de RGTA26 dans un milieu DME + 10% SVF + Pen/Gen. Barre échelon= 20μm

L’épaisseur moyenne des feuillets produits (contrôles et en présence de différentes concentrations de RGTA26) fut également évaluée quantitativement selon le protocole décrit dans le chapitre 2. La figure 15 montre les épaisseurs moyennes des feuillets cultivés lors d’une expérience représentative des cinq expériences effectuées au total. Comme on peut le voir sur les coupes histologiques des FDs produits par auto-assemblage, la présence de concentrations élevées de RGTA26 (5μg/mL et 10μg/mL) a pour effet de diminuer l’épaisseur de 34% par rapport à celles des contrôles(p<0.01). Les concentrations moindres de RGTA26 n’ont pour leurs parts aucun effet significatif sur l’épaisseur des feuillets produits.

*: Différences significatives par rapport au contrôle (0μg/mL), p<0.1

Les surnageants de culture des différents milieux ont été récupérés lors de la production des FDs, filtrés et analysés par zymographie, tel que décrit au chapitre II.9. L’analyse zymographique semi-quantitative (gels de gélatine) a permis de détecter des bandes correspondantes à pro-MMP9, MMP9, pro-MMP2, MMP2, pro-MMP1 et MMP1. Cette analyse a été effectuée après 2, 8, 14, 21, 24 et 28 jours de culture. Un exemple de zymogramme est montré à la figure 16. De façon générale, les bandes augmentent d’intensité avec le nombre de jours de culture.

Zymographie des surnageants de culture prélevés après 14 jours de culture. Puits A: Contrôle; Puits B: 0.001μg/mL; Puits C: 0.01μg/mL; Puits D: 0.1μg/mL; Puits E:1μg/mL; Puits F: 2.5μg/mL; Puits G: 5μg/mL; Puits H: 10μg/mL; Puits I: Standard; Puits J: Contrôle milieu de culture. Chaque puits recevait 20μL d’une dilution 1/3 du surnageant de culture (milieu de culture pour le contrôle).

Les résultats présentés dans la figure 17, ont été obtenus lors de l’analyse d’un zymogramme effectué sur les surnageants prélevés après 28 jours de culture. Les résultats étaient représentatifs d’analyses zymographiques effectuées sur les surnageants correspondants des autres pétris dans le cadre de la même expérience ainsi que ceux obtenus lors d’autres expériences. Les bandes les plus facilement remarquables sur la totalité des zymogrammes (figure 16) étaient situées à 68 KDa et appartenaient à la pro-forme de MMP2. L’analyse semi-quantitative des bandes a révélé que l’intensité des bandes variaient en fonction de la dose de RGTA26 (figure 17-A). L’analyse des zymogrammes a également permis d’identifier des bandes moins intenses situées à 62KDa et correspondant à la forme activée (clivée) de MMP2 (figure 16). Celles-ci répondaient également au RGTA26 d’une manière différente selon la dose. L’intensité de cette MMP2 atteint sa valeur maximale dans les surnageants des FDs produits avec 10μg/mL RGTA26 et dépassait de 17% celle du contrôle (figure 17-B).

Même si l’analyse zymographique des surnageants fut effectuée sur des gels de gélatine, l’analyse des gels a également permis d’identifier des bandes appartenant à d’autres MMPs que les gélatinases (A et B). En effet, des bandes de 52 et 43 KDa ont également été détectées (figure 16). Une revue de littérature et une analyse préliminaire des surnageants par ELISA ont démontré que ces bandes correspondaient respectivement à la pro-forme de MMP1 et à sa forme clivée. Ces bandes étaient présentes dans tous les surnageants dès le huitième jour de culture. Comme pour la MMP2, la forme clivée de MMP1 était moins intense que celle de la pro-MMP1. Les résultats de l’analyse zymographique et du dosage ELISA (résultats préliminaires non-présentés) concordaient et les valeurs maximales de concentration pour la pro-MMP1 (voir figure 17c) et MMP1 (voir figure 17d) étaient atteintes dans les surnageants contenants 1μg/mL et 5μg/mL de RGTA26 respectivement. Le standard commercial ne contenant que les gélatinases MMP2 et MMP9, l’intensité des bandes correspondantes à la pro-MMP1 et à la MMP1 a été mesurée par rapport à l’intensité des bandes du surnageant contrôle.

Finalement, l’analyse zymographique a également permis de détecter la présence de la proenzyme et de la forme clivée de MMP9. La pro-MMP9 était détectable dans le milieu de culture et variait peu dans les différents milieux de cultures (voir figure 16). Le zymogène de MMP9 était donc présent dès le début de la production des FDs, mais semblait disparaître après 14 jours de culture. La forme clivée n’était toutefois présente qu’à partir de 8 jours de culture (résultats non-présentés dans ce mémoire). L’analyse des bandes a montré que leur intensité augmentait avec la concentration de RGTA26.

Représentation graphique des résultats obtenus lors de l’analyse zymographique des surnageants de culture des feuillets dermiques produits par auto-assemblage en absence (contrôle) et en présence de diverses concentrations de RGTA26. Les résultats obtenus lors de cette expérience étaient représentatifs des autres analyses effectuées sur les surnageants d’autres pétris ou d’autres expériences. A. Intensité relative des bandes correspondantes à la pro-forme de MMP2 en fonction de la concentration de RGTA26. B. Intensité relative des bandes correspondantes à la forme clivée de MMP2 en fonction de la concentration de RGTA26. Les résultats relatifs aux formes de MMP2 ont été calculés par rapport à un témoin positif d’une concentration de 2.5μg/mL (mélange commercial de MMP2 et de MMP9 5μg/mL total). C. Intensité relative de la bande correspondante à la pro-forme de MMP1, en fonction de la concentration de RGTA26, par rapport au contrôle sans RGTA26. D. Intensité relative des bandes correspondantes à la forme clivée de MMP1 en fonction de la concentration de RGTA26, par rapport au contrôle sans RGTA26.

© Éric Boucher, 2005