Chapitre I : Revue de littérature

Table des matières

Les cellules de tous les organismes vivants contiennent des quantités appréciables d’information génétique dans leur ADN. La réplication précise des millions ou milliards de paires de bases qui composent le génome des organismes uni- ou multicellulaires constitue un défi de taille. Cette réplication est un processus très fidèle mais malgré tout imparfait à cause des agents mutagènes endogènes ou exogènes qui agissent sur l’ADN au cours de la vie de la cellule. Si ces lésions et changements ne sont pas réparés, le bagage génétique de la cellule s’en trouvera modifié, ce qui pourrait menacer à plus long terme la survie de l’espèce. Depuis la description originelle de la structure en double hélice de l’ADN par Watson et Crick (1953), plusieurs études ont montré que des systèmes multiples assurent la sauvegarde et la stabilité de l’information génétique en limitant la fixation des mutations (Kunkel, 1992). Grâce à ces systèmes de réparation ou de correction, le taux net de mutation, des microbes jusqu’aux mammifères, est très faible et varie généralement entre 10-9 et 10-10 mutations par base répliquée (Echols et Goodman, 1991).

La fidélité de la réplication de l’ADN détermine en grande partie la stabilité du génome. Le faible taux de mutation observé durant la synthèse nucléotidique n’est pas la conséquence intrinsèque de la seule précision de la réplication de l’ADN, mais reflète aussi l’existence de mécanismes capables de corriger les erreurs de l’ADN polymérase (Umar and Kunkel, 1996; Kunkel et Bebenek, 2000). En bref, la fidélité de la réplication, aussi bien chez les bactéries que chez les cellules eucaryotes, est déterminée à trois niveaux agissant de manière séquentielle (Kunkel, 1992; Schaaper, 1993; Roberts et Kunkel, 1996; Umar et Kunkel, 1996; De Wind et Hays, 2001). Premièrement, une importante contribution à la fidélité de la réplication est conférée par la sélection de base par voie de complémentarité assurée par l’ADN polymérase durant la polymérisation nucléotidique. Deuxièmement, les erreurs faites par l’ADN polymérase peuvent être corrigées par une activité exonucléolytique associée à la polymérase, appelée «proofreading» ou édition. Finalement, un système post-réplicatif de réparation des mésappariements (ou MMR, de l’anglais « mismatch repair ») corrige les erreurs de réplication ayant échappé au « proofreading ».

La fidélité de la réplication dépend non seulement de la sélection de base de l’ADN polymérase, mais aussi de son activité exonucléolytique 3’->5’. L’ADN polymérase génère deux types d’erreurs au cours de la réplication : les substitutions survenant lorsqu’un nucléotide mal apparié est incorporé, et les changements du cadre de lecture qui résultent de la délétion ou de l’insertion d’un nucléotide supplémentaire. Ces erreurs peuvent être repérées et corrigées par l’ADN polymérase elle-même grâce à son activité de correction d’épreuves, ou « proofreading ». Il en résulte ainsi une augmentation de la fidélité de la réplication. Au cours de l’élongation nucléotidique dans le sens 5’->3’, si une erreur est commise par la polymérase, l’enzyme repart en sens contraire (3’->5’) et excise la dernière base ajoutée, créant un site libre qui pourra être occupé par un autre nucléotide (Figure 1.1) (Kunkel, 1990; Lewin, 1999; Kroutil et al ., 1996).

Cette fonction « proofreading » de l’enzyme devient particulièrement importante en présence de séquences répétées car l’ADN polymérase génère alors plus fréquemment des erreurs d’insertion et de délétion de bases. Durant la réplication des microsatellites, l’activité exonucléolytique de la polymérase est très sollicitée. Malgré cela, sa capacité à corriger ses propres erreurs diminue lorsque le nombre de répétitions augmente (Kroutil et al ., 1996).

En complément, le système de correction des mésappariements (MMR) participe au maintien de l’intégrité du génome chez les organismes vivants. Ce système, conservé des bactéries jusqu’aux mammifères, reconnaît et corrige spécifiquement les erreurs de réplication ayant échappé à l’ADN polymérase, telles les bases mésappariées et les petites insertions/délétions. C’est donc un système de réparation ou de correction post-réplicatif. En plus de ce rôle majeur, le système MMR est également impliqué dans la restriction de la recombinaison entre les séquences d’ADN non-identiques par inhibition de leur interaction, de manière à maintenir l’intégrité des espèces en réduisant la fréquence des recombinaisons (Modrich et Lahue, 1996; Kolodner, 1996; Harfe et Jinks-Robertson, 2000b; Schofield et Hsieh, 2003).

Figure 1.1 : L’ADN polymérase et son activité exonucléolytique de correction d’épreuves . 1 . L’ADN polymérase incorpore un nucléotide selon la sélection de base par complémentarité. 2. Le nucléotide entre et une liaison se forme. 3 . L’enzyme avance d’un nucléotide . 4 . Un mauvais appariement entraîne le retrait du nucléotide et l’enzyme recule de 1 pb (tiré de Lewin, 1999).

Les protéines «Mut» du système MMR ont été initialement identifiées chez l'organisme procaryote Escherichia coli (Modrich, 1991). Trois protéines majeures, MutS, MutL et MutH, sont impliquées dans la correction des mésappariements. Comme nous l’avons expliqué plus haut, les mésappariements résultent soit d’une mauvaise incorporation nucléotidique soit d’un dérapage de la polymérase ayant échappé à la correction d’épreuves (Lu et al ., 1983). La première étape de la correction des erreurs de réplication implique l’homodimère MutS, qui reconnaît le mésappariement et se lie à la base incorrecte afin d’initier la cascade des événements du système MMR (Figure 1.2). L’hydrolyse de l’ATP assure le mouvement bi-directionnel de l’ADN vers MutS afin de former une structure en boucle. En présence d’ATP et d’un mésappariement, MutS recrute un homodimère constitué de la protéine MutL. L’assemblage de ce complexe formé au niveau de la structure en boucle de l’ADN stimule l’activité endonucléolytique de MutH, laquelle clive le brin d’ADN nouvellement synthétisé à partir d’une séquence voisine GATC non-méthylée. Le brin clivé est ensuite dégradé par une exonucléase, puis la correction du mésappariement est complétée par une nouvelle synthèse d’ADN effectuée par une polymérase spécifique (polymérase III) suivie d’une ligature qui assure la continuité de la restauration du brin (Modrich et Lahue, 1996; Jiricny 1998; Schofield et Hsieh, 2003).

Chez les eucaryotes, les caractéristiques générales du système MMR sont conservées, mais le nombre de gènes MMR est supérieur à celui retrouvé chez les bactéries et variable selon les espèces (Harfe et Jinks-Robertson, 2000a). À titre d’exemple, chez la levure, il existe six homologues de MutS (MSH1-MSH6) et quatre homologues de MutL (MLH1, MLH2, MLH3 et PMS1). Parmi les homologues de MutS, seules les protéines MSH2, MSH3 et MSH6 interviennent dans la correction de mésappariments. MSH1 est impliquée dans la réparation et le maintien de l’ADN mitochondrial (Reenan et Kolodner,

Figure 1.2: Correction d’un mésappariement chez E. coli . (i) Le mésappariement serait dû à une erreur de la polymérase. (ii) La protéine MutS se lie au mésappariement pour initier la cascade des évènements du système MMR. (iii) L’hydrolyse de l’ATP assure le mouvement bi-directionnel de l’ADN vers MutS, dans le sens des flèches. Les protéines MutL et MutH viennent alors se joindre à l’ensemble MutS-base mésappariée. L’assemblage du complexe au niveau de la structure en boucle stimule l’activité endonucléolytique de MutH, qui clive le brin d’ADN nouvellement synthétisé. (iv) Le brin d’ADN non-méthylé est dégradé par une exonucléase puis (v) resynthétisé par une polymérase. Le dernier lien est fait par une ligase qui assure la correction de l’erreur (adapté de Harfe et Jinks-Robertson, 2000a).

1992) ; pour leur part, MSH4 et MSH5 interviennent dans les processus de recombinaison méiotique (Ross-Macdonald et Roeder, 1994; Hollingsworth et al ., 1995). Parmi les autres eucaryotes, la drosophile possède le plus faible nombre de gènes MMR, où seuls les homologues de MSH2 ( spel1 ), MSH6, MLH1 et PMS1 ont été identifiés. La drosophile ne dispose d’aucun homologue de MSH1, MSH3, MSH4, MSH5, MLH2 ou MLH3 (Flores, 2001). De tous ces gènes, le gène MSH2 joue un rôle central dans le système MMR car son altération entraîne une augmentation importante du taux de mutation (Reenan et Kolodner, 1992).

Contrairement aux procaryotes, où les protéines MutS et MutL fonctionnent en homodimères, les protéines MMR agissent en hétérodimères chez les eucaryotes. Des études génétiques et biochimiques indiquent que le complexe MSH2-MSH6 (appelé MutSα) répare les bases mésappariées et les petites insertions/délétions constituées d’un ou deux nucléotides, alors que le complexe MSH2-MSH3 (MutSβ) joue un rôle majeur dans la correction de plus grandes boucles d’insertions/délétions, ayant entre 2 et 8 nucléotides.

Pareillement, chez les eucaryotes, il existe plusieurs homologues de MutL, lesquels forment également des hétérodimères. La toute première protéine MMR identifiée chez la levure fut PMS1, un homologue de MutL (Williamson et al ., 1985). En l’absence de ce gène, un phénotype particulier avait été observé, soit une ségrégation post-méiotique, c’est-à-dire la présence de deux allèles différents d’un gène au sein d’un produit haploïde de la méiose. C’est ce phénotype qui a donné son nom (« post-meiotic segregation », PMS) à cet homologue de MutL. Les autres homologues eucaryotes de MutL (MLH1-MLH3) ont été identifiés sur la base de la conservation de la séquence d’acides aminés (Prolla et al ., 1994; Modrich et Lahue, 1996; Flores-Rozas et Kolodner, 1998). Parmi ces homologues, MLH1 est le composant central puisqu’il forme des hétérodimères avec les trois autres homologues de MutL (Wang et al ., 1999). Les complexes MutLα (MLH1-PMS1) et MutLγ (MLH1-MLH2) interviennent dans la correction des mésappariements, alors que l’hétérodimère MutLβ (MLH1-MLH3) intervient dans la recombinaison méiotique et supprime les mutations (Harfe et Jinks-Robertson, 2000a). La mutation des gènes PMS1 ou MLH1 chez la levure entraîne une augmentation du taux de mutation comparable à celle observée chez les mutants msh2 (Prolla et al ., 1994), d’où l’importance de ces gènes dans la correction des mésappariements.

Jusqu’à présent, aucun homologue de la protéine MutH n’a été trouvé chez les eucaryotes. Il est généralement postulé que la discrimination du brin à réparer se fait par un mécanisme autre que par la méthylation de l’ADN. Les coupures au niveau du brin nouvellement synthétisé constituerait une cible à la réparation. Les étapes de la resynthèse et de la ligature achèveraient le processus de correction de façon analogue à ce qui se passe chez les procaryotes (Harfe et Jinks-Robertson, 2000a).

Malgré l’importance du système MMR dans le maintien de la stabilité du génome des eucaryotes, ce n’est qu’en 1997 que le premier homologue de MutS a été identifié chez Arabidopsis thaliana, par Culligan et Hays. Six homologues de MutS ont été ensuite identifiés dans le génome d ’Arabidopsis thaliana  : AtMSH1, AtMSH2, AtMSH3, AtMSH4, AtMSH6 et AtMSH7 (Adé et al ., 1999; Culligan et Hays, 1997 et 2000). Une analyse fonctionnelle du gène AtMSH2 faite dans notre laboratoire a confirmé la participation de ce gène à la correction des mésappariements au sein de l’ADN (Adé et al ., 2001). La protéine MSH2 forme des hétérodimères avec MSH3 et MSH6 in vitro , et le complexe qui en résulte reconnaît spécifiquement le mésappariement, comme c’est le cas chez la levure. Culligan et Hays (2000) ont montré que la protéine MSH2 d’ A. thaliana peut également former in vitro des dimères avec MSH7. Le gène AtMSH7 n’a été observé que chez Arabidopsis et possède une forte homologie avec AtMSH6 . Des analyses phylogénétiques suggèrent une divergence entre les deux protéines, qui se serait produite au cours de l’évolution des eucaryotes. Trois homologues de MutL ont été identifiés à ce jour chez Arabidopsis ( AtMLH1 , AtMLH3 et AtPMS1 ). Dans notre laboratoire, AtMLH1 a été isolé par Jean et al . (1999), et AtPMS1 a fait récemment l’objet d’une caractérisation structurale (Alou et al ., 2004b) ainsi que fonctionnelle (Alou et al ., 2004a).

Comme nous l’avons déjà mentionné, la fidélité de la réplication de l’ADN est aussi fonction de la nature de la séquence d’ADN à répliquer. Les microsatellites, qui constituent une fraction particulière du génome, montrent un taux de mutation plus élevé que le reste du génome.

Le génome de tous les eucaryotes observés jusqu’à ce jour contient une fraction de séquences répétées d’ADN (Charlesworth et al ., 1994). Cette classe comprend les ADN satellites (hautement répétés en tandem), les minisatellites et les microsatellites (modérément répétés en tandem) et les éléments transposables (modérément répétés, séquences dispersées et mobiles). Parmi ces séquences répétées, les microsatellites suscitent un intérêt majeur dans diverses applications telles la cartographie génétique, les études de la diversité génétique et l'identification variétale.

La définition des microsatellites est quelque peu arbitraire. Sia et ses collaborateurs (1997a) ont défini les microsatellites comme des régions du génome où une à dix paires de base sont répétées en tandem huit fois ou plus. D’autres auteurs définissent les microsatellites d’une façon plus restrictive, comme étant des séquences de un à six nucléotides répétés en tandem. Les types de microsatellites connus diffèrent selon la longueur et la composition en nucléotides de l’unité répétée. Les microsatellites se trouvent aussi bien dans les régions codantes que dans les régions non-codantes, mais ils sont beaucoup plus abondants au sein de ces dernières (Umar et Kunkel, 1996; Ellegren, 2004).

Les microsatellites sont des séquences intergéniques très polymorphes (Ellegren, 2004). Ce polymorphisme est dû à un taux relativement élevé de mutation dans ces séquences, comparativement à d’autres régions du génome. Les ADN polymérases effectuent des erreurs d’insertion ou de délétion même durant un processus normal de réplication de l’ADN. Cependant, la plupart de ces erreurs sont éliminées par la correction d’épreuves de la polymérase et le système MMR (Maehara et al ., 2001).

Les données disponibles chez la levure, les mammifères et la drosophile suggèrent que les altérations dans les microsatellites, particulièrement les répétitions simples, reflètent le dérapage de l’ADN polymérase qui produit des mésappariements entre une ou plusieurs bases répétées (Strand et al. , 1993; Harfe et Jinks-Robertson, 2000a). Dans une souche sauvage ayant un système de réparation fonctionnel, le mésappariement peut être corrigé pour restaurer le nombre originel d’unités répétées. Par contre, chez une souche déficiente pour un gène de correction de mésappariement, au fur et à mesure que l’ADN polymérase progresse le long de la séquence répétée, une transition a lieu entre le brin natif et le brin complémentaire. Les deux brins peuvent se réassocier dans une configuration de mésappariement. Si la base mésappariée est sur le brin natif, le microsatellite s’allonge par addition d’une unité répétée, alors que le mésappariement d’une base sur le brin complémentaire servant d’amorce entraîne une délétion (Figure 1.3) (Strand et al ., 1993; Umar et Kunkel, 1996; Sia et al ., 1997 a et b).

Figure 1.3: Schéma illustrant l’instabilité d’un microsatellite (GT)5.

Si les nucléotides mésappariés sont sur le brin natif, il en résulte une insertion transitoire, alors que les nucléotides mésappariés sur le brin complémentaire entraînent une délétion transitoire. Ces intermédiaires peuvent être corrigés, en présence d’un système de réparation fonctionnel, par un réalignement ou une excision 3’—> 5’ du brin natif avant que la synthèse ne continue. Si la correction n’a pas lieu durant la réplication, le brin nouvellement synthétisé peut être réparé une fois la réplication achevée en utilisant le brin parental comme gabarit complémentaire. Cependant, la continuation de la polymérisation de ces intermédiaires sans « proofreading» ni réparation provoque une insertion ou une délétion dans le brin nouvellement synthétisé (adapté de Umar et Kunkel, 1996).

Les additions et les pertes de bases sont fréquentes dans les microsatellites, par rapport à d'autres régions du génome, ce qui leur confère ce caractère d'instabilité. L'addition ou la délétion d’un motif dans la séquence répétée entraîne l’augmentation ou le raccourcissement de la séquence et constitue un obstacle majeur au maintien de la stabilité génétique (Umar et Kunkel, 1996; Sia et al ., 1997a; Strauss, 1999).

L'instabilité des microsatellites a des conséquences importantes qui peuvent s’avérer bénéfiques ou néfastes. Les changements de taille des séquences répétées à l’intérieur ou à proximité des gènes peuvent altérer l’expression et la fonction de ces gènes. Par exemple, il existe chez l’homme un certain nombre de maladies génétiques reflétant l’expansion des séquences répétées, telle la maladie de Huntington affectant le système nerveux (Nasir et al ., 1996; Sia et al ., 1997a). L’instabilité des microsatellites est également observée chez les patients souffrant d’un type de cancer du colon (HNPCC, hereditary non-polyposis colon cancer), une maladie souvent associée au dysfonctionnement du système de correction des mésappariements (Kolodner, 1995). En conséquence, l’augmentation de l’instabilité est un outil diagnostique de certains cancers humains associés à une déficience du système de réparation des mésappariements (De La Chapelle et Peltomaki, 1995). Un aspect utile de l’instabilité des séquences répétées est le polymorphisme allélique qui est très utilisé en cartographie génétique (Slatkin, 1995).

Le taux d’instabilité est affecté par plusieurs caractéristiques du microsatellite lui-même: la longueur de l’unité répétée, la composition de l’unité répétée, le nombre de répétitions de cette unité de base, le taux de transcription du microsatellite, la pureté de la séquence répétée (ex. présence d’interruptions dans la répétition) et la composition de la séquence flanquante. Ces différents paramètres seront développés dans les paragraphes suivants.

Il a été observé que des suites mononucléotidiques sont plus instables que les dinucléotides, qui sont à leur tour plus instables que les trinucléotides, etc... Ceci a été rapporté chez E. coli (Bichara et al ., 2000), chez la levure (Henderson et Petes, 1992; Sia et al ., 1997b), ainsi que chez les mammifères (Boyer et al ., 2002). Il s’en dégage une tendance claire à l’effet que plus l’unité répétée est longue, plus le microsatellite sera stable, à nombre égal de répétitions bien entendu.

La composition en bases influence également le taux de mutation dans les microsatellites. Les répétitions de G ou de C sont plus instables que celles composées de A ou de T (Boyer et al ., 2002). Chez la levure, par exemple, des mononucléotides constitués de 10 C ou 10 G sont de trois à 19 fois plus instables que ceux composés de 10 A ou de 10 T (Harfe et Jinks-Robertson, 2000c).

La localisation d’un microsatellite peut aussi affecter sa stabilité de trois façons : 1) via des effets de contexte local des séquences avoisinantes ; 2) en fonction de l’activité transcriptionnelle dans la région en question ; et 3) selon l’orientation du microsatellite. En effet, Harfe et Jinks-Robertson (2000c) ont montré que la composition de la séquence avoisinant le microsatellite affecte le taux de mutation au sein d’une suite mononucléotidique chez la levure. Il a également été rapporté qu’un taux de transcription élevé déstabilise une séquence répétée à cause de l’augmentation du dérapage de l’ADN polymérase. Une transcription élevée causerait un sur-enroulement des domaines du chromosome et une réduction de l’efficacité de l’interaction de l’ADN, soit avec l’ADN polymérase soit avec les protéines du système MMR (Datta et Jinks-Robertson, 1995; Wierdl et al ., 1996). Finalement, une étude chez E. coli (Morel et al ., 1998) a montré que l’instabilité d’un microsatellite d’une longueur donnée dépend de son orientation par rapport au sens de la réplication, l’instabilité d’un poly(TG) étant deux fois plus élevée que celle d’un poly(AC) de même longueur. D’autres travaux ont aussi montré que l’instabilité d’un trinucléotide est affectée par son orientation (Kang et al ., 1995; Maurer et al ., 1996). Par contre, une étude chez la levure a montré que le taux d’instabilité d’un poly(GT) est indépendant de cette orientation (Henderson et Petes, 1992).

Enfin, la longueur de la séquence répétée, c’est-à-dire le nombre de fois qu’est répétée l’unité de base, affecte l’instabilité des microsatellites (Wierdl et al ., 1997; Yamada et al ., 2002; Ellegren, 2004). La fréquence de dérapage de l’ADN polymérase dans les mononucléotides est d’autant plus élevée que le microsatellite est long (Kroutil et al ., 1996). Chez une souche sauvage de levure, un microsatellite de 14 adénines est par exemple 400 fois plus instable que son homologue contenant 4 adénines (Tran et al ., 1997). Une étude récente effectuée chez Arabidopsis a montré que l’instabilité d’un mononucléotide constitué de guanine est positivement corrélée à sa longueur (Leonard et al ., 2003).

Tel que discuté précédemment, les gènes MMR participent au maintien de l’intégrité du génome chez les organismes vivants. De nombreux travaux antérieurs (Strand et al ., 1993; Kolodner, 1995; Sia et al. , 1997b; Strauss et al ., 1997; Tran et al ., 1997, Flores et Engels, 1999) ont montré que ces gènes jouent un rôle important dans la stabilité des séquences répétées aussi bien chez les procaryotes que chez les eucaryotes (levure, drosophile, mammifères, ...). Différentes études effectuées chez la levure ont montré que l’inactivation du gène MSH2 provoque une augmentation de 350 fois de l’instabilité du dinucléotide (GT)17 (Strand et al ., 1993), une augmentation de plus de 1000 fois de l’instabilité d’un mononucléotide (C)8 (Strauss et al., 1997) et un accroissement de près de 10,000 fois de l’instabilité d’une répétition simple (A)14 (Tran et al ., 1997). Chez la drosophile, une mutation du gène Spel1 (l’homologue de MSH2 de levure) a provoqué une réduction de la stabilité des dinucléotides (Flores et Engels, 1999). Chez les plantes, le gène AtMSH2 a fait l’objet d’une étude récente sur l’instabilité des séquences répétées, son inactivation provoquant une réduction de la stabilité de ces séquences (Leonard et al ., 2003).

Ce qui est vrai pour MSH2 l’est également pour d’autres gènes MMR. Plusieurs travaux permettent d’illustrer un effet semblable suite à la mutation du gène PMS1 de levure (ou son homologue chez d’autres eucaryotes). Par exemple, Strand et al . (1993) ont montré qu’une mutation dans le gène PMS1 de levure se traduisait par une augmentation de l’instabilité du microsatellite (GT)17 d’environ 700 fois. Chez la souris déficiente en PMS2, Yao et al . (1999) ont noté une augmentation de 50 fois de l’instabilité du mononucléotide (A)24 ainsi qu’un accroissement de 24 fois du dinucléotide (CA)33 par rapport aux souris sauvages.

Les travaux rapportant l’étude de l’instabilité des microsatellites ont généralement fait appel à des gènes rapporteurs. Ainsi, des gènes bactériens comme le gène LacZ ou le gène de résistance à la néomycine (neo) ont servi d’outils pour la mesure du taux de mutation des séquences répétées dans différents organismes comme C. elegans , la souris ou les cellules humaines (Boyer et al. , 2002; Tijsterman et al ., 2002; Yamada et al ., 2002; Schmid et al ., 2003). Chez la levure, les gènes rapporteurs les plus utilisés sont le gène LYS2 codant pour une enzyme de la voie de la synthèse de la lysine (Tran et al ., 1997; Harfe et Jinks-Robertson, 1999) et le gène URA3 (Strand et al ., 1993). Afin de détecter les mutations dans les cellules humaines et chez la souris, le gène PLAP codant pour la phosphatase alcaline du placenta humain a également été utilisé avec succès (Hersh et al ., 2002). Chez les plantes, Leonard et al . (2003) ont utilisé le gène rapporteur GUS codant pour la β-glucuronidase (uid A, GUS) d’ Escherichia coli pour étudier l’instabilité des microsatellites. En général, l’approche consiste à insérer un microsatellite artificiel dans le gène rapporteur utilisé, de façon à mettre la protéine codée hors-cadre de lecture. L’avènement d’une mutation (délétion ou addition d’une ou plusieurs bases) dans le microsatellite restaure le cadre de lecture et rend la protéine fonctionnelle. Dans le cas du gène GUS , ces mutations se traduisent par des secteurs bleus qui apparaissent sur le tissu végétal.

Le gène GUS a déjà été utilisé comme rapporteur chez les plantes pour étudier les recombinaisons homologues, notamment chez le tabac et Arabidopsis thaliana (Puchta et Hohn, 1991; Swoboda et al ., 1994; Puchta et al. , 1995). Ce gène a également été utilisé chez Arabidopsis pour mesurer la fréquence des mutations spontanées (Kovalchuk et al ., 2000). Le principal avantage du gène rapporteur GUS chez les plantes est que ces dernières ont des niveaux de GUS quasiment indétectables, seuls les vertébrés et les microorganismes possèdent l’enzyme (Martin et al ., 1992). L’analyse a aussi l’avantage d’être non-radioactive, sensible, quantitative et qualitative. Les essais quantitatifs utilisent des substrats fluorigéniques tel le 4-MUG (4-méthylumbelliferryl-β-glucuronide), alors que le substrat X-gluc (5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-glucuronide) est utilisé pour les essais qualitatifs (Walden et Schell, 1990). Lorsque les plantes exprimant la β-glucuronidase sont mises en présence du substrat X-glucuronide (X-gluc), on observe une coloration bleue qui peut être détectée par des méthodes histochimiques. Dans cette étude, la coloration bleue de certaines cellules d’Arabidopsis indique la présence de mutations survenant dans le microsatellite. Le système rapporteur développé dans ce projet permet ainsi la détection d’un changement dans la longueur du microsatellite inséré artificiellement, et la mesure de son taux de mutation.

Grâce à l’identification et à la caractérisation antérieures de certains gènes du système MMR ( AtMSH2 , AtMLH1 et AtPMS1) dans notre laboratoire, nous pouvions dans cette étude mesurer le taux de mutation dans les microsatellites aussi bien chez des lignées d’Arabidopsis de type sauvage que chez des lignées déficientes en gènes MMR. Dans ce contexte nous avons postulé au départ que :

- Les microsatellites sont des régions instables du génome et leur taux de mutation est plus élevé qui celui d’autres régions du génome ;

- La longueur du microsatellite affecte son taux de mutation ;

- L’orientation du microsatellite par rapport à son origine de réplication influence son degré d’instabilité ;

- L’inactivation chez Arabidopsis des gènes AtPMS1 ou AtMSH2 entraîne une augmentation du taux de mutation dans les microsatellites.

Le premier volet de ce projet (chapitre II) a porté sur la création d’un système rapporteur basé sur le gène GUS, qui nous a permis d’étudier l’instabilité des microsatellites chez Arabidopsis et d’établir que certains paramètres du microsatellite (longueur, orientation) peuvent influencer sa stabilité. Dans le deuxième volet (chapitre III) nous avons étudié l’impact de l’inactivation du gène AtPMS1 par des allèles dominants négatifs sur l’instabilité des microsatellites. Dans le troisième volet (chapitre IV), nous avons étudié l’instabilité des microsatellites chez des lignées d’Arabidopsis mutantes où le gène AtMSH2 avait été inactivé par mutagenèse insertionnelle. Finalement, le dernier chapitre résume les principaux résultats de ces travaux et les perspectives qu’ils offrent dans la recherche en génétique des plantes.