Chapitre V : Discussion générale et conclusions

L’étude de la stabilité du génome et des gènes de correction des mésappariements chez les plantes est d’une importance cruciale. À l’inverse de la plupart des organismes, les plantes sont incapables de se déplacer et sont continuellement soumises à des mutations exogènes comme le rayonnement UV ou les polluants du sol. Les mutations qui se produisent chez les plantes peuvent être fixées au cours ou suite à la réplication de l’ADN et se transmettre aux générations subséquentes, d’où l’importance de les limiter afin d’assurer la stabilité du génome. Pour ces raisons, les plantes requièrent un système de réparation d’ADN efficace afin de maintenir l’intégrité de leur matériel génétique.

La détermination du taux de mutation chez les plantes s’avère utile à la compréhension des mécanismes génétiques qui protègent le génome végétal des erreurs de la réplication de l’ADN. Dans ce contexte, nous avons utilisé les microsatellites comme outil d’analyse de la stabilité du génome des plantes. Les microsatellites sont des séquences dispersées dans le génome de tous les procaryotes et les eucaryotes examinés à ce jour, sont intrinsèquement instables et constituent un indicateur sensible de la stabilité du génome. L’instabilité des microsatellites découle de leur propension à s’allonger et à se contracter au cours de leur réplication à cause du dérapage de l’ADN polymérase. Le taux de mutation des microsatellites peut varier de 10-6 à 10-2 par génération selon les espèces (Schlötterer, 2000). Ce taux augmente considérablement lorsque le système de correction des mésappariements est défaillant. Plusieurs recherches ont été conduites pour mesurer l’instabilité des microsatellites chez divers organismes, de la bactérie Escherichia coli aux mammifères (Sia et al ., 1997b; Tran et al ., 1997; Flores et Engels, 1999; Eckert et Yan, 2000; Tijsterman et al ., 2002; Yamada et al ., 2002; Leonard et al ., 2003). Dans ce projet, un système rapporteur a été développé afin de mesurer le taux de mutation des microsatellites aussi bien chez des lignées sauvages d’Arabidopsis que chez des lignées déficientes en certains gènes de réparation de l’ADN.

La présente étude effectuée dans le cadre de la compréhension des mécanismes de correction des mésappariements de l’ADN et de la recombinaison génétique des plantes, en particulier chez l’espèce modèle Arabidopsis thaliana , visait deux objectifs principaux. Il s’agissait, dans un premier temps, de développer un système rapporteur permettant de mesurer le taux d’instabilité de microsatellites artificiels. Ensuite, on souhaitait utiliser cet outil rapporteur pour étudier l’impact de l’inactivation de gènes de correction des mésappariements, les gènes AtPMS1 et AtMSH2 , sur l’instabilité des microsatellites. La deuxième partie de l’étude visait à démontrer l’importance des gènes MMR dans le maintien de la stabilité du génome.

D’après les résultats présentés dans le chapitre II, l’outil rapporteur ayant permis de mesurer le taux de mutation des microsatellites a été développé avec succès. Cet outil, basé sur le gène rapporteur GUS codant pour la β-glucuronidase, repose sur la réversion d’allèles du transgène GUS dans lequel des microsatellites artificiels ont été insérés hors cadre de lecture. La protéine produite est si sévèrement tronquée, à cause de l’apparition d’un codon stop huit acides aminés en aval du microsatellite, qu’elle est devenue inactive. La délétion d’une paire de bases ou l’insertion de deux paires de bases restaurent le cadre de lecture de la protéine, ce qui permet de visualiser les réversions d’allèles du transgène GUS . Le système rapporteur GUS a été validé par l’insertion d’un microsatellite en cadre de lecture afin de maintenir la protéine codée active. Les plantes issues de cette transformation sont totalement colorées en bleu car toutes leurs cellules expriment le gène GUS . Le choix du système rapporteur GUS est judicieux car les plantes ne montrant pas d’activité endogène glucuronidase qui pourrait interférer avec l’expression de la protéine exogène. De plus, la sensibilité de ce système nous a permis de détecter des réversions au niveau cellulaire. Le rapporteur GUS possède aussi l’avantage d’être robuste puisque l’insertion d’un fragment contenant un microsatellite n’a pas perturbé son expression. Ce rapporteur a déjà été utilisé par Leonard et al . (2003) pour étudier le taux de mutation au sein des séquences répétées chez les plantes.

Dans la première partie de la présente étude (Chapitre II), nous avons pu démontrer, grâce au système rapporteur GUS, que l’instabilité des mononucléotides (microsatellites dont l’unité répétée est composée d’une seule base) est directement corrélée à leur longueur. En d’autres termes, plus le microsatellite est long, plus il est sujet à de l’instabilité génétique, un résultat qui corrobore d’autres travaux réalisés chez plusieurs organismes tels que la bactérie E. coli (Bichara et al ., 2000), la levure S. cerevisiae (Sia et al ., 1997b), le nématode C. elegans (Degtyareva et al ., 2002), les cellules mammifères (Yamada et al ., 2000) et même Arabidopsis thaliana (Leonard et al ., 2003). Dans ce travail, la répétition simple constituée de 16 guanines s’est avérée la plus instable de la série des microsatellites insérés au génome de la plante (G13, G10 et G7). Le microsatellite G16 s’est avéré être trois fois plus instable que G13, six fois plus instable que G10 et 82 fois plus instable que G7. L’accroissement de l’instabilité des microsatellites n’était pas linéaire; il était brusque entre G7 et G10, puis devenait plus modéré entre les plus longues répétitions. Un système particulier existerait, probablement le système MMR, qui stabiliserait les longues séquences répétées qui dépassent les 10 paires de bases. L’augmentation de l’instabilité dans les microsatellites longs serait due à l’infidélité de l’ADN polymérase. En effet, son activité exonucléolytique (l’édition) serait moins efficace en présence de longues séquences répétées. Des études in vitro ont montré que le dérapage de l’ADN polymérase est proportionnel à la longueur du microsatellite (Bebenek et al. , 1990; Kroutil et al ., 1996).

Les résultats obtenus nous ont aussi permis de démontrer que l’instabilité des microsatellites est fonction de leur orientation. Des études antérieures chez E. coli (Gawel et al ., 2002) et chez la levure (Gragg et al ., 2002) confirment cet effet. Dans notre cas, un mononucléotide de 16 C étant trois fois plus stable que son complément constitué de 16 G, suggérant qu’il y aurait réparation préférentielle d’un brin par rapport à un autre. Il a été rapporté chez E. coli que le brin matrice est plus sujet aux mutations que le brin complémentaire, la fréquence de mutations pouvant augmenter jusqu’à cinq fois en inversant artificiellement l’orientation du microsatellite. Toutefois, le mécanisme exact de cette préférence de réparation demeure encore incompréhensible pour les microsatellites (Gawel et al ., 2002). Une autre hypothèse serait l’existence d’une relation entre la réparation de l’ADN et la transcription (réparation couplée à la transcription). Des études chez la levure ont démontré une relation entre l’instabilité accrue des microsatellites et un taux élevé de la transcription. Cette dernière aurait deux effets; réduire l’efficacité du système MMR ou augmenter le taux d’erreur de l’ADN polymérase. Une transcription élevée causerait un sur-enroulement des domaines du chromosome et une réduction de l’efficacité de l’interaction de l’ADN, soit avec l’ADN polymérase soit avec les protéines du système MMR (Datta et Jinks-Robertson, 1995; Wierdl et al ., 1996). Nous ne disposons pas à l’heure actuelle d’informations qui nous permettraient de favoriser l’hypothèse de la réparation préférentielle par rapport à celle de la transcription pour expliquer la différence d’instabilité entre les microsatellites G16 et C16.

Au cours de ce projet, nous avons par ailleurs constaté la présence d’une variabilité entre lignées portant le même microsatellite, et attribué cette variation du taux de mutation au nombre de copies du transgène. Ainsi nous avons démontré que le taux de mutation était élevé chez les lignées ayant plusieurs copies du transgène, alors que ce taux était plus faible lorsqu’une seule copie du transgène avait été insérée dans la plante. D’autres paramètres pourraient aussi contribuer à expliquer cette variabilité, tels l’effet de position ou le taux de transcription du transgène. Il serait intéressant d’explorer ces deux hypothèses afin de mieux comprendre la variation existant entre les différentes lignées ayant une même construction génétique, lesquelles auraient dû montrer un taux de mutation semblable.

Comme mentionné, le taux de mutation est très élevé dans les microsatellites constitués d’une longue répétition (G16). Ce taux de mutation a été déduit du nombre de secteurs observés sur les feuilles, et reflète donc une fréquence de mutations somatiques puisque celles-ci se sont produites dans les tissus somatiques. Les mutations au sein du microsatellite G16 étaient si fréquentes qu’elles nous ont permis d’observer des mutations germinales. Cela n’était pas le cas chez les microsatellites plus courts (G13, G10 et G7), où aucune plante révélant une mutation germinale n’a été observée. Les plantes ayant subi ce type de mutation étaient entièrement bleues suite à la coloration GUS. Les plantes, contrairement aux animaux, n’ont pas de cellules spécialisées pour la production des gamètes. Les gamètes chez les plantes dérivent de cellules méristématiques qui ont subi plusieurs divisions somatiques. Chez une espèce comme Arabidopsis qui peut posséder plusieurs méristèmes floraux, les mutations somatiques se produisant au cours du développement ont une grande opportunité de se transmettre de manière germinale. Les mutations germinales se sont produites au cours des premières phases du développement de la plante, probablement dans les cellules méristématiques indifférenciées, alors que les mutations somatiques apparaissent plus tard (Kovalchuk et al ., 2000; Hays, 2002). Le système rapporteur développé dans cette étude nous a ainsi permis de mesurer aussi bien les taux de mutations somatiques et germinales. À notre connaissance, aucune autre étude n’a rapporté jusqu’ici des révertants germinaux résultant d’une instabilité des microsatellites.

Bien que l’activité exonucléolytique de l’ADN polymérase et le système de correction des mésappariements soient tous deux capables de corriger les erreurs de réplication, seule la déficience du système MMR a été associée de manière convaincante à l’instabilité des microsatellites. En effet, le système de correction des mésappariements est adapté à réparer les additions et les délétions dans les longues répétitions, alors que l’édition joue un rôle mineur dans la prévention des mutations dans ce type de séquences (Strauss et al ., 1997; Tran et al ., 1997). Il a déjà été rapporté chez plusieurs organismes que le taux de mutation des séquences répétées augmente considérablement lors de l’inactivation des gènes MMR (Strand et al ., 1993; Sia et al ., 1997a et b; Strauss, 1999; Boyer et al ., 2002; Degtyareva et al ., 2002).

Le chapitre III de ce projet portait sur le rôle du gène AtPMS1 sur l’instabilité des microsatellites chez Arabidopsis. L’inactivation de ce gène a été réalisée par l’approche de dominants négatifs, une approche consistant à sur-exprimer de manière constitutive des versions altérées de la protéine-cible et à générer un phénotype dominant négatif. Ce phénotype est similaire à celui produit par une délétion du gène PMS1 . Nous avons utilisé cette approche car au moment de l’étude fonctionnelle du gène AtPMS1 , des mutants insertionnels n’étaient pas encore disponibles dans notre laboratoire. Les transformants obtenus ont été croisés avec des lignées rapporteuses portant deux types de microsatellites, un G7 ou un G16. Une comparaison du taux de réversion somatique chez les transformants Atpms1 avec celui de plantes témoins a montré que l’instabilité des microsatellites est accrue chez les mutants. L’inactivation du gène AtPMS1 a ainsi provoqué une augmentation du taux de mutation des microsatellites. En effet en utilisant le rapporteur G16, les plantes transformées avec les isoformes altérées d’ AtPMS1 ont montré en moyenne six fois plus d’instabilité que les plantes témoins, alors que ce rapport était de 28 fois en présence du microsatellite G7. Ces augmentations sont néanmoins très modestes par rapport à ce qui a été observé chez d’autres organismes comme la levure, où l’inactivation du gène PMS1 a induit une augmentation de 1,500 à 3,100 fois en présence d’un G18 (Sia et al ., 2001).

En complément à ces travaux, le chapitre IV de cette étude portait sur l’impact du gène AtMSH2 , gène clé du système MMR, sur l’instabilité des microsatellites. Des travaux antérieurs effectués chez la levure ont montré que l’altération du gène MSH2 cause un accroissement de l’instabilité des séquences répétées. Une mutation dans le gène MSH2 a induit d’une part une augmentation de 6,300 fois de l’instabilité du microsatellite G18 (Sia et al., 1997b) et d’autre part un accroissement de 10,000 fois de l’instabilité d’un mononucléotide A14 (Tran et al ., 1997). Dans la présente étude, l’inactivation du gène AtMSH2 a été réalisée par mutagenèse insertionnelle. Les lignées mutantes ont été obtenues par une recherche BLAST à partir de la banque de données de l’Institut Salk. Le mutant Atmsh2 a été croisé avec des lignées rapporteuses portant le microsatellite G7 ou G16. L’accroissement de l’instabilité du microsatellite G7 a été pratiquement de quatre fois entre les lignées mutantes et les lignées sauvages. Une étude utilisant le même mutant msh2 et effectuée chez Arabidopsis, a rapporté une augmentation de l’instabilité d’une répétition simple G7 de cinq fois (Leonard et al ., 2003). Ces résultats, comme les nôtres, étaient basés sur le dénombrement de secteurs bleus apparus suite à la coloration, lesquels correspondent à des mutations somatiques.

Concernant l’instabilité du microsatellite G16 chez les mutants Atmsh2 , nous avons déterminé dans cette étude le taux de mutation germinal. Comme le microsatellite G16 utilisé est très instable (comparativement aux autres microsatellites de même composition; G7, G10 et G13), nous avons été en mesure d’identifier des révertants germinaux parmi les mutants Atmhs2 . Des mutations somatiques ont également été observées, mais leur nombre élevé a rendu le décompte difficile. En outre, la taille de certains secteurs bleus était tellement grande qu’ils masquaient d’autres secteurs plus petits, et la détermination du taux de mutation somatique aurait été imprécise dans ce cas. Toutefois, l’accroissement du nombre et de la taille des secteurs entre les lignées mutantes et les lignées sauvages étaient visuellement très clairs. Dans le cas d’un croisement effectué entre les lignées rapporteuses G16 et les lignées mutantes msh2 , un accroissement de 52 fois de l’instabilité du microsatellite G16 a pu être noté. Ce taux est largement plus élevé que celui obtenu avec les révertants somatiques de la présente étude ou celle de Leonard et al . (2003).

L’accroissement de l’instabilité des microsatellites G7 et G16 était à l’inverse très modéré si l’on considère les mutations somatiques à la fois pour les mutants Atpms1 et Atmsh2 . Il semblerait que chez Arabidopsis, une perte de fonction d’un gène du système MMR entraîne un effet modeste sur l’instabilité des microsatellites par rapport aux autres eucaryotes. Il a été suggéré que l’impact relativement modeste d’une déficience du système MMR sur l’instabilité des séquences répétées serait dû au fait que dans les tissus différentiés des plantes, la fidélité de la réplication de l’ADN n’est pas un facteur critique. Dans les cellules somatiques de mammifères, où les mutations qui engendrent des tumeurs menacent la survie de l’organisme, l’énergie allouée au système MMR est donc justifiée, ce qui n’est pas le cas des cellules somatiques végétales puisque des maladies comme le cancer n’existent pas (Leonard et al ., 2003). De plus, chez les plantes, les tissus différenciés ne contribuent pas à la production des gamètes. Ceci expliquerait le faible niveau d’expression des gènes MMR dans les tissus différenciés, tel que démontré dans notre laboratoire par Adé et ses collaborateurs (1999). Une autre hypothèse pourrait expliquer l’augmentation modeste du taux de mutation des microsatellites : les plantes montrent un niveau basal de mutations spontanées déjà élevé comparativement aux autres organismes. Ce taux est 1,000 à 1,500 fois plus élevé que celui observé chez les bactéries, la levure ou la souris (Kovalchuk et al ., 2000), et il pourrait être difficile d’accroître encore ce taux de mutation par l’inactivation d’une seule composante du système MMR.

En conclusion, le système rapporteur GUS développé au cours de cette étude constitue un outil puissant pour la détermination du taux d’instabilité des microsatellites chez Arabidopsis thaliana . Il nous a permis d’établir le lien entre le taux de mutation et la longueur ou l’orientation des microsatellites. L’implication des gènes de correction des mésappariements chez les plantes, en particulier AtMSH2 et AtPMS1 , a été confirmée grâce à l’utilisation du système rapporteur créé. Ces gènes du système MMR sont impliqués dans le maintien de la stabilité génétique des microsatellites. Le système rapporteur GUS pourrait servir d’outil pour mesurer également la stabilité du génome en général, et pourrait être employé chez d’autres espèces végétales.