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La présente étude nous a permis de développer un système rapporteur, basé sur le gène bactérien codant pour la β-glucuronidase (GUS), afin de mesurer l’instabilité des microsatellites chez Arabidopsis thaliana . Les microsatellites sont des séquences particulières du génome susceptibles à des mutations fréquentes qui se produisent au cours de la réplication. On a démontré dans ce projet une corrélation entre la longueur du microsatellite et son taux de mutation. De même, l’orientation du microsatellite influence son instabilité. Dans deux études ultérieures, nous avons également étudié l’implication des gènes de correction des mésappariements (système MMR, « Mismatch repair ») dans l’instabilité des microsatellites. Le système MMR corrige les erreurs survenues au cours de la réplication des microsatellites. Nous avons montré que l’inactivation des gènes AtPMS1 et AtMSH2 entraîne l’augmentation de l’instabilité des séquences répétées, d’où l’importance de ces gènes dans le maintien de la stabilité des microsatellites en particulier et du génome en général.

The present study allowed us to develop a reporter system based on a bacterial gene encoding for β-glucuronidase (GUS), in order to measure microsatellite instability in Arabidopsis thaliana . Microsatellites are particular regions of the genome undergoing frequent mutations during replication. A correlation between length of the repetitive tracts and microsatellite instability was demonstrated. Besides, the orientation of the microsatellite influenced its instability. In two later studies, we have also studied the effect of mismatch repair genes (MMR) on microsatellite instability. Mismatch repair system corrects errors that occur during the replication of microsatellites. We showed that inactivation of AtPMS1 and AtMSH2 genes increased tracts instability, hence the importance of these genes in the maintenance of microsatellite stability and genome stability in general.

La fidélité de la réplication de l’ADN est très importante pour assurer la stabilité génétique nécessaire à la survie de l’espèce. L’un des mécanismes qui intervient dans le maintien de la fidélité de la réplication de l’ADN est le système de correction des mésappariements. Ce système a été caractérisé chez plusieurs organismes vivants dont les végétaux. Il joue un rôle important dans la fidélité de la réplication des microsatellites, qui sont des séquences particulières du génome reconnues pour leur instabilité supérieure à la moyenne. L’instabilité des microsatellites se manifeste par l’élongation ou la réduction de la séquence répétée. Le changement de longueur des microsatellites est essentiellement dû au dérapage de l’ADN polymérase durant la réplication.

Afin de mesurer le taux d’instabilité des microsatellites chez Arabidopsis thaliana , un système rapporteur basé sur le gène GUS a été développé. L'insertion d’un microsatellite dans le gène GUS entraîne un changement du cadre de lecture, lequel rencontre un codon stop rendant la protéine produite tronquée. Certaines mutations dans le microsatellite peuvent restaurer le bon cadre de lecture et l’activité du gène GUS , se traduisant par l’apparition de secteurs bleus formés de cellules dans lesquelles le gène GUS est actif. Ces secteurs bleus renseignent directement sur le taux de mutation. Dans le cas où la mutation se produit dans les cellules du méristème qui donneront naissance aux cellules germinales, certaines plantes de la descendance seront totalement bleues. Il s’agit dans ce cas de réversions germinales, à l’opposé des réversions somatiques.

Dans la première partie de la thèse, nous avons étudié le taux de mutation de plusieurs microsatellites constitués d’une seule base dans leur unité répétée (G7, G10, G13, G16 et C16). Nous avons montré que l’instabilité des microsatellites est directement corrélée à la longueur de la séquence répétée. Le taux de mutation des microsatellites varie également en fonction de leur orientation.

Afin d’élucider le rôle du système de correction des mésappariements (système MMR) chez les plantes, nous avons étudié l’instabilité des microsatellites chez des lignées d’Arabidopsis déficientes en certains gènes du système MMR. Dans le deuxième volet de cette étude, nous avons montré que l’inactivation du gène AtPMS1 par des allèles «dominants négatifs» entraîne une augmentation de l’instabilité des microsatellites. Cet accroissement était de 6 fois dans le cas du G16, et de 28 fois dans le cas du G7. Dans la dernière partie de ce projet, l’étude a porté sur le rôle du gène AtMSH2 , gène clé de la machinerie MMR, dans l’instabilité des microsatellites. Nous avons noté une augmentation considérable de l’instabilité des séquences répétées, les mutants msh2 porteurs du microsatellite G16 s’avèrent 52 fois plus instables que les témoins. L’accroissement du taux de mutation des microsatellites chez les mutants montre que les gènes du système MMR sont impliqués dans le maintien de la stabilité du génome.

Le système rapporteur développé dans la présente étude s’est avéré puissant tout en étant sensible. Il nous a permis de visualiser les mutations qui ont lieu dans les microsatellites et de déterminer leur fréquence. Ce système pourrait servir d’outil pour mesurer la stabilité du génome en général et pourrait être exploité chez d’autres espèces végétales.

Cette thèse s’inscrit dans le cadre des travaux réalisés dans notre laboratoire portant sur la caractérisation et la fonction du système de correction des mésappariements (MMR) chez Arabidopsis thaliana . Durant ces dernières années, mes collègues de laboratoire ont cloné plusieurs gènes impliqués dans le système MMR (Adé et al ., 1999 ; Jean et al ., 1999 ; Alou et al ., 2004b). Chez d’autres organismes, ces gènes sont nécessaires pour assurer une très grande fidélité de la réplication, en particulier des séquences répétées comme les microsatellites (Sia et al ., 1997a). Suite à l’inactivation de ces gènes, on observe typiquement un accroissement important du taux de mutation au sein des microsatellites (Strand et al ., 1993). Mon projet consistait à développer un système rapporteur permettant de mesurer le taux de mutation des microsatellites chez les plantes et d’étudier l’impact de l’inactivation des gènes de correction des mésappariements sur l’instabilité de ces séquences répétées. Nous montrons ainsi l’importance des gènes MMR dans le maintien de la stabilité du génome.

La thèse est composée de cinq parties. La première est une revue de littérature décrivant les mécanismes génétiques, dont le système MMR, intervenant dans la stabilité du génome et plus particulièrement des microsatellites. Les trois chapitres qui suivent sont rédigés en anglais sous forme de manuscrits afin de permettre une diffusion plus large des résultats. Le premier manuscrit, où je suis auteur principal, décrit le développement d’un système rapporteur permettant de quantifier aisément l’instabilité des microsatellites en fonction de leur longueur ou de leur composition. Le deuxième article rapporte des travaux qui visaient à étudier l’implication du gène AtPMS1 , une composante du système MMR, dans le maintien de la stabilité des microsatellites. J’ai contribué dans cet article par la génération des lignées rapporteuses G7 et G16 et l’étude de l’instabilité des microsatellites chez les lignées d’Arabidopsis déficientes pour le gène AtPMS1 . Je suis co -premier auteur de ce manuscrit publié dans le revue Plant Molecular Biology . Quant au troisième article, il porte sur l’implication du gène AtMSH2 , autre composante du système MMR, dans l’instabilité des microsatellites et la recombinaison homéologue. Dans ce manuscrit, j’ai contribué par la génération des lignées rapporteuses G7 et G16 afin d’étudier l’instabilité des microsatellites suite à la mutation du gène AtMSH2 . J’ai un statut d’auteur secondaire dans cet article. Finalement, une discussion générale et les conclusions des travaux sont présentées dans le cadre d’un cinquième chapitre.

Les références citées dans l'introduction et les conclusions générales se retrouvent à la fin de la thèse, tandis que celles citées dans les manuscrits se trouvent à la fin de ces derniers.

Je tiens d’abord à remercier mon directeur de recherche, le Dr François Belzile, qui m’a accueilli dans son laboratoire et m’a offert l’opportunité de poursuivre mes études doctorales dans une ambiance très agréable. Je vous remercie d’avoir participé à mon développement scientifique et de m’avoir donné tant de conseils qui m’ont aidé à mener à terme ce travail. Merci également d’avoir financé mes recherches et de m’avoir permis de participer à de nombreux congrès qui m’ont apporté un enrichissement scientifique complémentaire. Mon passage dans votre laboratoire restera gravé pour toujours dans ma mémoire. Vous trouverez ici l’expression de mon admiration et de ma reconnaissance.

Je remercie le Dr Dominique Michaud d’avoir accepté de faire la pré-lecture de ma thèse. Ces commentaires ont été très appréciés. Mes remerciements s’adressent également au Dr Louise Brisson et au Dr Armand Séguin qui ont accepté d’évaluer ma thèse.

J’adresse aussi mes remerciements au Dr Martine Jean pour son aide inestimable au cours de mon doctorat. Le Dr Jean a toujours été disponible pour répondre à mes questions. Ses conseils m’ont beaucoup aidé à l’avancement de mes travaux de recherches. Je la remercie vivement.

Je remercie aussi le Dr Abdourahmane Alou, avec qui j’ai eu le plaisir de partager la publication d’un manuscrit dans la revue Plant Molecular Biology, et qui constitue une partie de cette thèse.

Un grand merci aux autres membres, présents et passés, du laboratoire que j’ai fréquentés avec un grand bonheur et qui contribuent tous les jours dans le succès du laboratoire tant sur le plan scientifique que sur le plan humain. Je cite particulièrement Vicki Bourdages, Marie-Pier Dubé et Éric Dion avec qui j’ai tissé des liens d’amitié en plus des liens professionnels.

J’adresse également mes remerciements à mes parents, Zhaïra et Fathi, qui m’ont soutenu tout le long de mes études et qui m’ont toujours encouragé à aller jusqu’au bout de mes rêves. Je vous serai éternellement reconnaissante pour votre soutien, votre confiance et votre fierté. Malgré la distance géographique qui nous sépare ces dernières années, vous êtes présents à chaque fois que j’ai besoin de vous. Je remercie aussi ma sœur Alya, ma meilleure amie, qui m’a transmis son optimisme et sa joie de vivre. Finalement, je remercie mon mari Hédi qui a été à mes côtés ces dernières années. Ta présence et ta patience m’ont permis de réaliser mes études dans une ambiance sereine. Tu as contribué d’une certaine manière à la réalisation de ce travail. J’ai la chance de vous avoir tous les quatre, je vous aime tant.

AA acide aminé

A adénine

ACT gène codant pour l’actine

ADN, DNA acide désoxyribonucléique

ADNc, cDNA ADN complémentaire

ADNg, gDNA ADN génomique

ADN-T, T-DNA ADN de transfert

ARN, RNA acide ribonucléique

ARNi, RNAi ARN interference

ATP adénosine 5’-triphosphate

bp, pb paire de bases

C cytosine

CaMV35S cauliflower mosaic virus 35S promoter,

promoteur du gène 35S du virus de la mosaïque du chou-fleur

Col écotype Columbia

CTAB bromure d’héxa-décyltriméthyl-ammonium

CV coefficient de variation

DMSO sulfoxyde de diméthyle

EDTA acide éthylène-diamine-tétra-acétique

G guanine

GM germination medium , milieu de germination

GUS β-glucuronidase

LB left border, bordure gauche

MLH MutL Homolog, homologue de MutL

MMR mismatch repair, réparation des mésappariements

MSH MutS Homolog, homologue de MutS

MSI microsatellite instability, instabilité des microsatellites

MUG 4-méthylumbelliferryl-β-glucuronide

N2 azote gazeux

NOS nopaline synthase

NPTII néomycine phosphotransférase II

ORF open reading frame, cadre de lecture ouvert

PCR polymerase chain reaction, réaction de polymérisation en chaîne

PLAP phosphatase alcaline du placenta humain

PMS post-meiotic segregation, ségrégation post-méiotique

RB right border, bordure droite

RT-PCR reverse transcriptase PCR

SDS dodécyl sulfate de sodium

Spel 1 Drosophila spellchecker 1

SSC tampon citrate de sodium

T thymine

TCR transcription-coupled repair, réparation couplée à la transcription

Uid A gène codant pour la β-glucuronidase

URA uracile

X-Gluc 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-glucuronide