2.0 Matériels et Méthodes

Table des matières

Le réactif Trizol et le DNAzol , le DMEM, le milieu LB et le FBS ont été achetés chez Invitrogen (Carlsbad, Californie) . Les produit RNAqueous Kit , FirstChoice RLM-RACE Kit , la polymérase inverse M-MLV, les oligonucléotides dégénérés et la DNA Free DNAse I proviennent d’Ambion (Austin, Texas) . Le produit diéthylpyrocarbonate (DEPC) et la polyéthylénimine de 25 kDa proviennent de Sigma-Aldrich (Oakville, Ontario). Toutes les enzymes de restriction et la ligase du phage T4 ont été acheté chez New England Biolabs (Beverly, Massachusetts). Les produits QIAprep Spin Miniprep Kit , QIAGEN Plasmid Midi Kit , QIAGEN PCR Cloning Kit (pDrive) et l’ADN polymérase de type HotStarTaq ont été acheté chez Qiagen (Mississauga, Ontario). Les amorces spécifiques aux gènes de la FAH ont été synthétisées chez Invitrogen (Carlsbad, Californie). La polymérase d’ADN Expand High Fidelity a été acheté chez Roche Diagnostics (Laval, Québec). Le protocole d’extraction de bandes à partir de gel d’agarose Eppendorf Perfectprep Gel Cleanup a été obtenu de la compagnie Eppendorf (Brinkman, Mississauga, Ontario). Le protocole d’essai luciférase Dual-Luciferase Reporter 1000 Assay System et les vecteurs pGL2-basic et pRL-CMV ont été achetés chez Promega (Madison, Wisconsin). Les lignées cellulaires HeLa, HepG2 et NIH 3T3 ont été obtenues de l’ATCC (Manassas, Virginie).

L’ARN total de foie humain a été extrait avec le Trizol en suivant le protocole du manufacturier. L’ARN total de foie, de cerveau et de rein de souris ont été extraits à l’aide du protocole RNAqueous Kit en suivant les recommandations du manufacturier. Le cerveau de souris a subi une congélation dans l’azote liquide avant l’extraction de l’ARN total. Après l’extraction, une incubation à la DNAse I sans ADN ( DNA Free ) pendant 30 min a été effectuée dans le but de dégrader l’ADN contaminant. Pour s’assurer de la bonne qualité des ARN totaux, une aliquote de 1 μl et de 2 μl d’ARN (~100 ng et ~200 ng respectivement) ont été déposées sur gel d’agarose dénaturant pour analyser qualitativement le ratio des bandes des ARNr. Un dosage spectrophotométrique à 260/280 nm a été effectué pour connaître la concentration de l’ARN. En effet, l’absorbance théorique de 1 unité de densité optique d’ARN à 260 nm est de 40 μg/ml d’eau. De plus, le ratio de l’absorbance de 260 nm par rapport à celle de 280 nm doit être inférieur ou égal à 1,8. Si le ratio est supérieur à cette valeur, l’ARN est considéré comme étant contaminé.

L’ARN total de chaque tissu a été soumis au protocole de FirstChoice RLM-RACE Kit selon les recommandations du fabriquant. En résumé, 10 μg d’ARN total ont été traités à la phosphatase intestinal de veau (CIP) pendant 60 minutes à 37°C pour déphosphoryler les extrémités 5’ des ARN. Ceci permet d’éliminer les ARNm dégradés et les autres types d’ARN. L’ARN a été extrait de cette solution pour éviter que la CIP interagisse avec l’ARNm pleine longueur. L’ARN a été traité avec 150 μl d’une solution de phénol : chloroforme (6:1). La phase aqueuse contenant l’ARN est prélevée. Pour enlever les résidus de phénol pouvant inhiber les enzymes utilisées dans le protocole de 5’RLM-RACE, 150 μl de chloroforme ont été ajoutés à la phase aqueuse. Cette nouvelle phase aqueuse a été prélévée puisqu’elle contient l’ARN. Le mélange d’ARN a ensuite été concentré par précipitation à l’isopropanol. Le culot d’ARN a été débarrassé de l’isopropanol par un lavage à l’éthanol 70%. Le culot a été ensuite suspendu dans 11 μl d’eau sans nucléases. Ensuite, ces ARN ont été traités à la pyrophosphatase acide du tabac (TAP) pendant 60 min à 37°C, dans le but d’enlever la coiffe de l’ARNm. Un adaptateur d’ARN a été ajouté au mélange et a été ligaturé sur l’ARNm à l’aide de l’ARN ligase du phage T4 pendant 60 min à 37°C. Une transcription inverse a été effectuée à l’aide d’oligonucléotides dégénérés et de la transcriptase inverse M-MLV pendant 60 min à 42°C. L’ARNm pleine longueur a été soumis à l’amplification par PCR. Cette amplification du 5’RLM-RACE a été faite en deux rondes d’amplification dans le but d’augmenter sa spécificité et son rendement (figure 3). Dans le cas des ARN extraits de tissus humains, la première ronde de PCR, le PCR « externe », a été faite avec l’amorce externe spécifique à l’adaptateur et l’amorce externe spécifique au gène de la FAH, RT083. La deuxième ronde de PCR, le PCR interne, a été effectuée avec l’amorce interne spécifique à l’adaptateur et l’amorce interne spécifique au gène de la FAH, RT082 (tableau 1A). Dans le cas des ARNm extraits de tissus de souris, le PCR externe a nécessité l’utilisation de l’amorce externe spécifique à l’adaptateur et l’amorce spécifique au gène de la FAH, mFAH AS +376. Le sigle mFAH AS +376 signifie que l’amorce antisens (AS) par rapport au bris codant sert à amplifier la FAH de souris (m=murine) et que la dernière base en 3’de l’ amorce se lie à 376 pb en aval du codon de départ de la protéine. Le PCR interne a nécessité l’utilisation de l’amorce interne spécifique à l’adaptateur et l’amorce spécifique au gène de la FAH, mFAH AS +232 (tableau 1B). Les réactions PCR ont été déposées sur gel d’agarose 2% pour vérifier la présence d’un produit d’amplification du 5’UTR des ARNm pleines longueurs de la FAH.

Les ADNc obtenus après le PCR interne ont été ligaturés dans le vecteur pDrive et incubés à 16°C pendant 12 à 16 heures. Ensuite, les réactions de ligation ont été utilisées pour transformer les bactéries compétentes INVα. Ces bactéries possèdent une mutation de la sous-unité α de la β-GAL qui permet la détection des colonies contenant une insertion par coloration bleu-blanc en présence de X-GAL, puisque le vecteur pDrive possède un ORF pour le peptide α du gène lac Z pouvant complémenter la mutation. Puisque l’insertion d’ADN dans l’ORF de ce peptide déphase son cadre de lecture, il y a de grande chance qu’un codon de terminaison de la traduction soit produit prématurément, ce qui se traduirait par une incapacité de produire une β-GAL active et le X-GAL ne serait pas clivé. La colonie serait donc blanche. En absence de la ligation de l’insert, il y a complémentation de la β-GAL par le peptide α et le X-GAL est clivé. La colonie devient bleue puisque le produit de la dégradation du X-GAL est un chromophore. Le mélange réactionnel de la transformation contient 50 μl de bactéries compétentes inoculées avec 1 μl de vecteur ligaturé et a été conservé sur glace pendant 30 min. Ensuite, les bactéries ont subi un choc thermique de 30 sec à 42°C et ont été remises sur glace pendant 2 min. Le volume a été complété à 300 μl avec du milieu de culture de type LB (Luria-Bertani) et les bactéries ont été incubées 60 min à 37°C. Après cette incubation, les bactéries ont été ensemencées sur des géloses LB-agar contenant 100 μg/ml d’ampicilline et 40 μg/ml de X-GAL. Les géloses ont été incubées de 12 à 16 heures à 37°C. L’analyse de la ligation des ADNc dans pDrive

Figure 3. Schéma des sondes externes et internes des PCR du 5’RLM-RACE.

Représentation schématique des stratégies d’amplification PCR employées pour cloner et identifier les sites d’initiation de la transcription chez la souris et l’homme. L’adaptateur (A), les exons (Ex) et un 5’UTR hypothétique sont représentés.

A) Les conditions PCR et les amorces utilisées pour l’amplification des ADNc obtenus après 5’RLM-RACE de l’ARNm pleine longueur du foie humain. B) Les conditions PCR et amorces utilisées pour les deux rondes d’amplification des ARNm obtenus après 5’RLM-RACE. Ces conditions ont été utilisées pour tous les tissus murins étudiés.

a été effectuée sur 20 colonies blanches qui ont été ensemencés dans 2 ml de LB contenant 100 μg/ml d’ampicilline. Ces cultures ont été incubées de 12 à 16 heures à 37°C. Ensuite, l’ADN plasmidique a été extrait par lyse alcaline (protocole adapté de (Birnboim and Doly 1979; Ish-Horowicz and Burke 1981). L’ADN plasmidique a été digéré par double digestion à l’aide des enzymes de restriction Hind III et Xho I pendant 1 à 2 heures à 37°C. Ceci a permis d’extraire l’insertion de SIT du vecteur. Le tout a été déposé sur gel d’agarose 2% pour éliminer les plasmides faux-positifs qui ne contenaient pas d’insertion. Les colonies contenant des plasmides positifs à l’insertion ont été ensemencées à nouveau dans 2 ml de LB contenant 100 μg/ml d’ampicilline et incubées de 12 à 16 heures à 37°C. L’ADN plasmidique a ensuite été extrait par lyse alcaline en suivant le protocole QIAprep Spin Miniprep Kit .

Tous les séquençages des SIT ont été effectués par le service de séquençage du pavillon Charles-Eugène-Marchand sur le campus de l’Université Laval. La numérotation des sites et leurs positions ont été déterminées à partir du codon de départ de la fah par notre équipe. Les résultats des séquençages des 5’UTR ont été comparés à la séquence d’ADN génomique de la base de données Ensembl, version de la séquence de ce génome v20.32b.1 émise le 1er avril 2004, a été utilisée pour s’assurer qu’elles étaient exemptes d’erreurs (Ensembl 2004).

L’ADN génomique de foie de souris a été extrait à l’aide du DNAzol selon les recommandations du manufacturier. Ensuite, il a été dosé par spectrophotométrie à 260/280 nm. L’ADN génomique de foie de souris a été amplifié à l’aide de l’amorce sens mFAH FWD -3016 Mlu I et de l’amorce antisens mFAH AS +68 (figure 4). Le site Mlu I en 5’ de l’amorce mFAH FWD -3016 Mlu I est absent de la séquence génomique murine (figure 4). Le PCR consistait en 5 cycles à une température d’hybridation (57˚C) plus basse pour permettre aux amorces de s’hybrider à l’ADN cible et 25 cycles à une température plus élevée d’hybridation (65˚C) pour augmenter la stringence de l’amplification (tableau 2A). Cette amplification a servi de gabarit pour une deuxième amplification PCR à l’aide de l’amorce sens mFAH SS -1893 Mlu I et mFAH REV –24 Xho I (tableau 2B). Le site Xho I en 5’ de l’amorce mFAH REV –24 Xho I est absent de l’ADN génomique.

L’amplicon d’environ 1,9 kpb et a été sous-cloné dans pDrive. Après transformation de bactéries INVα, 15 colonies blanches ont été investiguées. L’ADN plasmidique de deux colonies positives à l’insert de 1,9 kpb a été extrait et purifié par le protocole QIAprep Spin Miniprep Kit . Cet ADN a été dosé par spectrophotométrie à 260/280 nm. Ensuite, 1 μg de cet ADN a été digéré par MluI et XhoI . Tout le volume de digestion a été déposé sur gel d’agarose 1% et une électrophorèse à 100 v/cm2 pendant 45 min a été effectuée. La bande d’ADN correspondant à la taille de 1,9 kpb a été découpée et extraite du gel en suivant le protocole Eppendorf Perfectprep Gel Cleanup . Ensuite, l’insert a été ligaturé au vecteur pGL2-basic, déphosphorylé et digéré préalablement par MluI et XhoI . Le mélange réactionnel contenait l’ADN à ligaturer dans un ratio insert/vecteur de 2/1 pour une quantité total d’ADN de 100 ng. La réaction a été effectuée à la température de la pièce pour 60 min. Une aliquote a été déposée sur gel d’agarose 1% pour s’assurer que la réaction avait eu lieu. Finalement, les réactions de ligation ont servi à transformer des bactéries compétentes de type DH5α. Pour déterminer les colonies positives, dix colonies ont été ensemencées dans 2 ml de milieu LB contenant 100 μg/ml d’ampicilline ont été incubées 12 heures à 37°C. L’ADN plasmidique a été extrait et déposé sur gel. Pour s’assurer de l’absence de mutations, 3 clones positifs ont été séquencés dans les deux orientations et leur séquence comparée à celle de la base de données Ensembl (Ensembl 2004).

Les constructions pGL2-mp-1373, pGL2-mp-445 et pGL2-mp-290 ont été générées par PCR à partir de la construction pGL2-mp-1893 (figures 5A, 5B et 5C respectivement). Les conditions PCR et les amorces utilisées pour ces amplifications sont présentées au tableau 3. Toutes les amplifications ont été sous-clonées dans pDrive. Les inserts ont été digérés par Mlu I et Xho I et ligaturés dans pGL2-basic préalablement digéré par les mêmes enzymes. L’ADN plasmidique a été extrait en suivant le protocole QIAprep Spin Miniprep Kit , déposé sur gel et séquencé pour s’assurer de sa qualité et de l’absence de mutations. Ensuite, l’ADN plasmidique de chacune des constructions a été extrait en

Figure 4.  Schéma des stratégies employées pour l’obtention de pGL2-mp-1893.

Représentation schématique résumant les rondes externes et internes d’amplification PCR pour obtenir la région promotrice murine donnant lieu à la construction pGL2-mp-1893.

A) Amorces et conditions PCR de l’amplification PCR d’une région d’ADN s’étendant jusqu’à 3016 pb en amont de l’ORF du gène fah . B) Amorces et conditions PCR de l’amplification PCR qui a mené à l’obtention de la construction pGL2-mp-1893.

Figure 5. Stratégies de clonage des constructions pGL2-mp-1373, mp-445 mp-290.

Représentations schématiques des amplification PCR effectuées pour obtenir les constructions pGL2-mp-1373 (A), pGL2-mp-445 (B) et pGL2-mp-290 (C) à partir de pGL2-mp-1873.

A) Conditions PCR et amorces utilisées pour le clonage de pGL2-mp-1373. B) Conditions PCR et amorces utilisées pour l’obtention de pGL2-mp-445. C) Les conditions PCR et amorces utilisées pour l’obtention de pGL2-mp-445.

grande quantité pour effectuer des transfections transitoires. Pour ce faire, une partie des bactéries compétentes obtenues ont servi à repartir des cultures de 30 ml de LB contenant 100 μg/ml d’ampicilline. L’ADN plasmidique de chacune des quatre constructions a été extrait en suivant le protocole QIAGEN Plasmid Midi Kit . Ces ADN ont été dosés par spectrophotométrie à 260/280 nm et déposés sur gel d’agarose 1% avant d’être utilisés pour le protocole de transfections transitoires.

Toutes les lignées cellulaires ont été cultivées dans le milieu de culture DMEM high glucose contenant 10% de FBS à 37ºC et en présence de 5% de CO2. Des cellules HeLa à 70-80% de confluence ont été ensemencées dans des plaques de six puits à raison de 1,5X105 cellules par puits. Les cellules NIH3T3 à 70%-80% de confluence ont été également ensemencées dans des plaques de six puits à raison de 1X105 cellules par puits. Les cellules HepG2 à 70% de confluence ont été ensemencées dans des plaques de 6 puits à raison de 2,0x105 cellules par puits. Ces manipulations ont été effectuées la veille de la transfection. Le lendemain, le milieu de culture des cellules a été remplacé par du milieu frais, une heure avant la transfection. Pour les cellules HeLa et HepG2, 3 μg total d’ADN ont été transfectés. Pour les cellules NIH3T3, 2 μg total d’ADN ont été transfectés. Chaque réaction de transfection pour les HeLa et les HepG2 contenait : 2,97 μg de pGL2-basic (contrôle négatif), ou : 2,97 μg d’une des quatre constructions ou : 2,97 μg de pRSV-L (contrôle positif; ORF de la luciférase devant un promoteur dérivé du virus du sarcome de Rous); 0,03 μg de pRL-CMV (contrôle interne qui permet de normaliser chaque puits de transfection), 6 μg de polyéthylénimine (PEI) de 25 kDa (Boussif et al . 1995) et une solution de NaCl 150 mM est ajoutée pour un volume final de 100 μl. Pour les NIH3T3, le mélange réactionnel contenait : 1,98 μg de pGL2-basic, ou 1,98 μg d’une des constructions ou 1,98 μg de pRSVL; 0,02 μg de pRL-CMV; 4 μg de PEI et une solution de NaCl 100 mM est ajoutée pour un volume final de 100 μl. Ces mélanges réactionnels sont incubés 10 min à la température de la pièce. Ensuite, ils ont été ajoutés à chaque puits et ont été incubés entre 12 et 16 heures dans un incubateur à cellule à 37°C et à 5% de CO2. Le lendemain, chaque puits a été rincé deux fois avec du PBS 1X et du milieu frais a été ajouté. Les cellules ont été incubées 48 heures après le changement de milieu avant d’être lysées.

Les essais luciférase ont été effectués en respectant le protocole Dual-Luciferase Reporter 1000 Assay System . Tous les puits ont été lavés trois fois avec du PBS 1X. Ensuite, les cellules ont été recueillies à l’aide d’un grattoir à cellules ( cell scraper ), 48 heures après le changement de milieu dans le tampon de lyse passive (PLB). Les lysats ont été incubés 10 min à –80°C pour augmenter l’efficacité de la lyse. Pour procéder aux essais luciférase, il a fallu combiner 30 μl de chaque lysat à 100 μl de réactif d’essai luciférase Luciferase assay Reagent (LARII). Le tout a été mélangé par vortex et a été incubé 30 sec à la température de la pièce, avant la première mesure de luminosité. Cette lecture quantifiait la lumière émise par la luciférase de l’espèce Photinus pyralis contenue dans le vecteur pGL2-basic, les constructions et le contrôle positif pRSV-L. Ensuite, 100 μl de solution Stop & Glow ont été ajoutés. Le milieu réactionnel a été agité par vortex et incubé 5 sec à la température de la pièce. Une deuxième lecture de luminosité a été prise sur le luminomètre. Cette lecture quantifiait la lumière émise par la luciférase de l’espèce Renilla reniformis contenue dans le co-vecteur pRL-CMV. Toutes les lectures ont été obtenues grâce au luminomètre LKB Wallac 1251.