4.0 Discussion

Dans le but d’étudier les mécanismes de la régulation transcriptionnelle du gène fah , nous avons entrepris d’identifier les sites d’initiation de la transcription (SIT) à partir d’ARNm pleine longueur par la méthode de 5’RLM-RACE. Grâce à cette méthode, nous avons remarqué que certains des SIT trouvés chez l’humain sont plus en amont que celui précédemment identifié à –56 pb (Phaneuf et al . 1991) (figure 6B et figure 9A). En effet, un des 5’UTR analysés, est positionné à -71 pb. De plus, deux sites d’initiation se retrouvent davantage en amont, soit à -172 pb et l’autre à –208 pb. Une délétion de 120 pb par rapport à l’ADN génomique humain a été observée dans les 5’UTR qui contenaient ces deux sites (figure 7). La technique utilisée suggère également que dans les tissus murins étudiés soient le cerveau, le foie et le rein, il y a absence de SIT ayant une spécificité tissulaire. De plus, tous les sites d’initiation identifiés chez la souris étaient situés davantage en amont du site identifié à –46 pb par Klebig et al. (1992) (figure 8B et tableau 9B).

Ensuite, nous avons étudié à l’aide de la méthode d’alignement phylogénétique, l’identité de séquence entre différentes portions de l’ADN génomique entourant la région du gène fah humain et murin. L’alignement des séquences promotrices des ces gènes orthologues n’a pas permis d’identifier des régions d’ADN avec un pourcentage d’identité supérieur à 50% (figure 10). Par contre, l’alignement des séquences exoniques et introniques de ces deux gènes confirme que la séquence des exons est très conservée entre ces deux gènes (figure 11). Les 13 premiers exons sont conservés à 75% et plus d’identité tandis que le 14e est conservé à plus de 60%. De plus, certaines régions d’ADN sont conservées dans les parties introniques (figure 11). Les plus importantes pour un rôle dans la régulation transcriptionnelle du gène fah serait les régions conservées dans les premiers et derniers 1000 pb de l’intron 1. La nature de ces portions introniques conservées est inconnue.

Nous avons ensuite concentré nos efforts sur le gène fah de souris afin de poursuivre notre étude de promoteur. Nous avons recherché les sites putatifs de liaison à l’ADN pour des facteurs de transcription dans la région promotrice murine. Cette analyse a permis de mettre en évidence la présence de sites de liaison potentiels à l’ADN pour certains facteurs de transcription. Nous retrouvons dans cette séquence promotrice, deux boîtes TATA, deux boîtes CAAT, plusieurs sites pour les facteurs de la famille HNF et dix sites Sp1 (figures 13 et 14B). Ces caractéristiques semblent différer de celles retrouvées dans le promoteur humain puisque celui-ci ne contient aucune boîte TATA ni CAAT ni de site de liaison pour les membres de la famille HNF (Labelle et al . 1993). Étant donné que la région d’ADN génomique analysée par Labelle et al . (1993) était plus courte que celle que nous avons analysé chez la souris (996 pb et 2000 pb en amont de l’ATG respectivement), nous avons recherché les sites de liaison potentiels sur 2000 pb en amont de l’ATG du gène humain (figure 14A). Nous avons trouvé une boîte TATA, une boîte CAAT et un site de liaison à HNF4. De plus, plusieurs sites de liaison potentiels pour les facteurs ubiquitaires de la famille AP (AP1 et AP4) ont été trouvés. Dix sites de liaison potentiels additionnels pour le facteurs Sp1 ont été identifiés en plus des 11 sites trouvés par Labelle et al. (1993). Donc, la différence entre les deux études résidaient dans la longueur de la séquence étudiée pour le promoteur humain. En limitant notre analyse aux 996 pb, nous confirmons les résultats de Labelle et al. (1993).

Nous avons cloné une portion d’ADN s’étendant jusqu’à 1893 pb en amont du codon de départ du gène fah devant le gène rapporteur de la luciférase. À partir de cette région, nous avons effectué des délétions en 5’ pour obtenir de plus petits fragments d’ADN, contenant une région promotrice de plus en plus courte. Nous avons vérifié l’effet de ces délétions sur l’expression du gène rapporteur par transfection transitoire dans trois lignés cellulaires : les cellules NIH3T3 dérivées de fibroblastes de souris, les cellules HeLa dérivées de fibroblastes humains et les cellules HepG2 dérivées d’hépatocytes humains. Le résultats des essais luciférase n’ont pas permis de mettre en évidence un patron d’expression du gène rapporteur qui laisserait présager une quelconque spécificité tissulaire de l’expression du gène rapporteur. En effet, la construction la plus courte, pGL2-mp-290, permet une expression constitutive du gène rapporteur dans tous les types cellulaires étudiés et semble être le promoteur basal du gène fah murin (figure 15).

Plusieurs cas d’hétérogénéité du 5’UTR d’un seule espèce d’ARNm ont été répertoriés. Par exemple, le gène humain du transporteur du folate réduit ( Reduced folate carrier ) est exprimé ubiquitairement, mais le niveau d’expression de ce gène dépend du tissu étudié (Whetstine et al . 2002). L’utilisation de sept exons non-codants permettraient d’expliquer la régulation différentielle entre chaque tissu. De plus, cette hétérogénéité peut être causée par l’utilisation d’un mécanisme d’épissage alternatif ou de l’utilisation de SIT différents.

L’importance de bien identifier ces SIT est primordiale pour entreprendre l’étude d’un promoteur. En effet, le 5’UTR peut être plus long que la normale déplaçant le promoteur davantage en amont de la séquence codante. Par exemple, le gène p27Kip1 de la souris possède un long 5’UTR de 502 pb (Coleman et al . 2001). De plus, la présence d’épissage alternatif dans le 5’UTR d’un gène peut placer sa région promotrice à plusieurs kb du codon initiateur de la traduction. C’est le cas du gène du récepteur de type 5 de la somatostatine ( Somatostatin receptor subtype 5 ) qui est lié à l’inhibition de la stimulation de la sécrétion de l’insuline par le glucose chez la souris. Un 5’UTR de 94 nucléotides a été identifié. Les 30 premières pb de ce 5’UTR sont situées immédiatement en amont de l’ATG de départ tandis que les 64 autres sont situées à 6,1 kb de la séquence codante (Petersenn et al . 2002). Plus remarquable encore, le SIT le plus en amont de la séquence codante du récepteur muscarinique M2 ( Muscarinic M2 receptor ) est situé à 146 kb de cette séquence (Fenech et al . 2004).

De plus, l’utilisation de SIT ne dépendant pas de l’épissage alternatif peut aussi expliquer la spécificité tissulaire de l’expression d’un gène. Par exemple, le gène de l’acétyl-CoA carboxylase 1 possède trois promoteurs distincts (Mao et al . 2003). Chacun de ces promoteurs possède ses propres SIT. L’utilisation des promoteurs PI et PII de ce gène semblent ubiquitaire, tandis que l’expression par le promoteur PIII semble confiné, au cœur, au cerveau, aux muscles squelettiques et aux tissus adipeux (Mao et al . 2003).

Finalement, l’utilisation de sites d’initiation différents n’est pas seulement l’apanage des gènes spécifiques à un tissu, mais peut résulter de l’utilisation d’un promoteur à l’apparence ubiquitaire. En effet, ce type de promoteur est généralement dépourvu d’élément cis qui assure une forte définition du SIT contrairement au promoteur ayant une boîte TATA ou CCAAT. Par exemple, la région promotrice humaine du facteur-gamma de maturation des cellules gliales ( neuroglia ) est dépourvue de boîte TATA, est riche en GC et possède quatre sites d’initiation situés dans un site de liaison pour le facteur Sp1 (Kawai et al . 2003).

L’étude de l’initiation de la transcription du gène fah par 5’RLM-RACE a permis d’identifier une hétérogénéité dans l’utilisation des 5’UTR. Nous suggérons que les sites identifiés proviennent d’un promoteur ubiquitaire et qu’il n’existe pas de promoteurs alternatifs ayant une spécificité tissulaire. En effet, la plupart des sites d’initiation identifiés sont dans la région proximale de la séquence codante du gène fah chez les deux espèces. Malgré la découverte d’un intron possible dans le 5’UTR chez l’humain (figure 7), il semble peu probable que l’utilisation de ces promoteurs alternatifs aurait des propriétés de spécificité tissulaire considérant l’étude bioinformatique réalisée sur la séquence nucléique du gène fah humain (Labelle et al . 1993).

De plus, le site précédemment identifié à –56 pb par (Phaneuf et al . 1991) est situé dans la région immédiate du codon de départ tout comme la plupart de ceux identifiés dans notre étude. La différence de longueur entre le 5’UTR trouvé par notre équipe (-50 pb) et celui identifié précédemment (-56 pb), résulte probablement dans la différence entre les échantillons de foie humain utilisés. En effet, nous avons utilisé un échantillon de foie humain plus récent (du moins pas le même) que celui sur lequel l’extension d’amorce à été utilisé. Il est possible que les SIT diffèrent entre les individus à cause d’un polymorphisme entre les individus surtout étant donné que le promoteur du gène fah semble être un promoteur faible et, donc ayant un site d’initiation mal défini.

Notre analyse dans les tissus murins a permis d’identifier les SIT à –64 pb et –60 pb qui sont davantage en amont que celui trouvé précédemment (-46 pb) par (Klebig et al . 1992). La technique utilisée par cette équipe ne cible pas l’ARNm pleine longueur. En effet, ils ont identifié le site qui avait le 5’UTR le plus long par criblage d’une banque d’ADNc à l’aide d’une sonde d’ADN génomique. De plus, nos souris ne proviennent de la même souche de souris que celle utilisée par Klebig et ses collègues (1992). Ils ont utilisé des souris de la souche C57 Black 6, tandis que nous avons utilisé des souris dérivées de la souche BALB/cR1. Puisque les génomes diffèrent légèrement, il est possible qu’il existe aussi, comme pour l’humain, des polymorphismes modifiant le site d’initiation de la transcription. Il serait possible de tester cette hypothèse en isolant l’ARN du foie de différentes souches de souris et d’identifier par 5’RLM-RACE les différents SIT. Si le SIT majoritaire diffère d’une souche à l’autre, ceci serait considérer comme une preuve de polymorphismes dans la région promotrice murine du gène fah .

Puisque les SIT situé à –64 pb et à –60 pb sont retrouvés dans tous les tissus étudiés, nous suggérons que la spécificité tissulaire de l’expression de la FAH n’est pas le résultat de l’utilisation de promoteurs alternatifs et que l’initiation de la transcription possède des caractéristiques propres aux promoteurs ubiquitaires, hypothèse qui est appuyée par l’analyse antérieure effectuée chez le rat (Labelle et al . 1991).

En effet, l’étude de l’initiation de la transcription du gène fah effectuée dans le foie et le rein de rat suggère un mécanisme similaire à celui identifié par notre étude chez la souris (Labelle et al . 1991). En effet, les auteurs ont entrepris d’identifier par extension d’amorce et par 5’RACE, la distribution des sites d’initiation dans le foie et les reins de rat. Ils en sont venus à la conclusion que la spécificité tissulaire de l’expression de la FAH chez cette espèce ne peut pas être expliquée par l’utilisation de différents SIT ou de l’épissage alternatif. De plus, ils ont situé le site d’initiation de la FAH du rat à -69 pb.

L’analyse bioinformatique du gène de la fah de souris ainsi que de sa région promotrice révèle des caractéristiques qui diffèrent de celles retrouvées chez l’humain. Premièrement, l’analyse phylogénétique du promoteur murin et humain de la fah n’a pas permis l’identification de région conservée qui pourrait avoir un rôle dans la régulation transcriptionnelle de ce gène. Qu’est-ce qui peut expliquer cette différence? Il est possible que les paramètres du logiciel n’ont pas été correctement réglés pour l’étude du promoteur. Cette hypothèse est peu probable puisqu’en utilisant ces mêmes paramètres pour étudier la distribution des exons entre la souris et l’humain, nous avons montré qu’il y a une forte identité de séquence entre ces deux espèces. Nous pensons plutôt que cette différence serait plutôt due à la divergence de ces deux espèces durant l’évolution. Le gène fah n’est pas le seul cas dans la littérature où il y a divergence entre les séquences promotrices de diverses espèces pour un même gène. Une analyse de la divergence entre 51 gènes humains et leurs orthologues chez les rongeurs et les primates a démontré qu’une proportion de 32% à 40% des sites de liaisons à l’ADN fonctionnels chez l’humain, ne le sont pas chez les rongeurs (Dermitzakis and Clark 2002).

Il est important de souligner que les deux études bioinformatiques des séquences promotrices humaines et murines ont identifié la présence de nombreux sites de liaison possibles pour le facteur Sp1. Il est possible que la présence des nombreux sites Sp1 dans le promoteur murin et humain soit le reflet d’une utilisation des ces sites in vivo . De plus, malgré l’observation de la divergence entre les séquences promotrices, il est possible que le mécanisme transcriptionnel soit conservé par l’utilisation de ces boîtes Sp1 puisqu’elles sont communes aux deux régions promotrices. Il serait important d’effectuer une analyse par mutagénèse dirigée des sites Sp1 afin d’élucider leur rôle dans la régulation de la transcription du gène fah .

La présence de deux boîtes TATA et CAAT possibles dans le promoteur de la fah murine semble suggérer la présence de promoteurs alternatifs. Cependant, l’analyse des 5’UTR n’a pas révélé la présence de sites d’initiation à proximité de ces deux types de boîtes. Les boîtes TATA doivent être situées de 25 à 30 pb en amont du SIT. Il semble donc peu probable que les boîtes TATA soient fonctionnelles dans ce cas. Les boîtes CAAT doivent être situées à environ 100 pb du site d’initiation, ce qui n’est pas le cas du promoteur de ce gène. Cette logique peut s’appliquer à la boîte TATA et à la boîte CAAT trouvées dans les 2000 pb de la séquence promotrice humaine. Il ne faut pas oublier, qu’en général, les logiciels d’analyse sont capables de découvrir des sites de liaison véritables mais ils génèrent un grand nombre de résultats qui sont faux-positifs.

En considérant l’absence de patron d’expression spécifique à un tissu dans l’utilisation des SIT et dans l’étude des transfections transitoires, nous suggérons que la région promotrice de souris clonée possède des caractéristiques des promoteurs dits ubiquitaires. En effet, une région d’ADN comprenant les 290 pb en amont du codon de départ du gène fah se révèle suffisante pour l’expression constitutive du gène rapporteur dans tous les types cellulaires étudiés (figure 15). De plus, la région de 290 pb contient 3 sites Sp1 et un site pour HNF6. La délétion de ces sites n’a pas été effectuée mais pourrait se révéler importante pour l’identification des mécanismes de régulation transcriptionnelle de ce gène. Malgré l’identification des sites de liaison pour les nombreux membres de la famille des HNF, leur délétion influence peu l’expression de la luciférase dans les HeLa et dans les NIH3T3 (figures 15A et B). Par ailleurs, la délétion séquentielle de la région comprenant 1893 pb semble avoir plus d’effet dans les HepG2 (figure 15C), mais l’induction du gène rapporteur est plus faible que dans les autres lignées cellulaires. La raison de cette observation n’est pas connue. Il est possible que le taux de transfection soit plus faible dans cette lignée mais, le contrôle positif pRSV-L a une expression plus forte dans les HepG2 que dans les autres lignées cellulaires (figure 15D). Le promoteur du virus du sarcome de Rous régule de façon constitutive l’expression du gène rapporteur sous son contrôle peu importe les tissus dans lesquels ce promoteur est transfecté. De plus, c’est un promoteur fort, qui conduit à une forte transcription des gènes sous son contrôle. Il aurait été important d’utiliser un vecteur contrôle contenant une région d’ADN, connue pour jouer un rôle dans l’expression à spécificité tissulaire hépatique d’un gène rapporteur pour s’assurer de l’absence de spécificité tissulaire observée pour nos essais luciférase. D’autres études seront nécessaires pour étudier la liaison de ces facteurs de transcription aux séquences identifiées par analyse bioinformatique à la séquence promotrice clonée.

Il se peut que le fait de transfecter nos constructions dans des cellules dérivées de tissus humains empêchent d’observer la véritable activité promotrice de la région clonée. Cependant, cette hypothèse est peu probable puisqu’il est généralement accepté que les facteurs de transcriptions et les mécanismes de régulation soient fortement conservés entre les mammifères (Dermitzakis and Clark 2002). Il serait souhaitable de vérifier cette hypothèse en transfectant les constructions obtenues dans des lignées cellulaires dérivées de tissus murins. De plus, l’utilisation d’un contrôle positif spécifique au foie souris aurait permis de vérifier l’effet d’un promoteur murin dans des cellules humaines. Il serait également souhaitable d’obtenir des souris transgéniques exprimant un transgène rapporteur en aval de la région promotrice murine de 1893 pb et de vérifier si l’expression de ce transgène est confinée aux hépatocytes. En se basant sur les résultats des essais luciférase, il semble que d’autres régions d’ADN soient nécessaires pour l’expression spécifique à un tissu du gène de la fah

Les résultats des transfections transitoires de la région promotrice murine supportent les résultats antérieurs observés pour les transfections transitoires de différentes régions promotrices humaines (St-Louis 1996). L’auteur a transfecté diverses délétions d’une région promotrice humaine de 1477 pb dans les cellules HeLa, HepG2, Chang liver (foie humain), CV-1 (rein de singe), 293 (rein humain), SW-13 (glandes surrénales), H4 (cerveau humain) et A549 (poumon humain). Peu importe le type cellulaire transfecté, aucun patron spécifique à un tissu particulier n’a été observé.

De plus, l’équipe du Dr Gavin Kelsey a effectué des essais de protection à la DNAse I sur la région promotrice murine du gène de la FAH (Kelsey 1996). Ils ont observé trois régions protégées, deux en amont du gène de la FAH et une dans l’intron 1. De ces sites, celui le plus en amont devant le gène de la fah et celui dans l’intron sont retrouvés seulement lorsque des extraits nucléaires de foie et de rein sont mis en présence de l’ADN génomique de souris. De plus, le site de l’intron 1 est plus protégé de la DNAse I dans le foie que dans le rein tout comme l’expression de la FAH dans ces tissus. Ils ont aussi transfecté la région d’ADN contenant les deux sites protégés devant la FAH et n’ont pas pu observer de patron d’expression spécifique à un tissu en particulier.

Il a été démontré que la tyrosine aminotransférase (TAT) est exprimée de façon spécifique dans le foie et que son expression, est induite par les glucocorticoïdes et le glucagon par une voie de signalisation impliquant l’AMPc et réprimée par l’insuline. Une étude du promoteur de la TAT a révélé l’utilisation de deux séquences activatrices, une située à –2,5 kb et l’autre à –3,6 kb par rapport au SIT (Nitsch et al . 1993). Ils ont aussi montré la présence, dans la séquence activatrice située à –3,6 kb, d’un site pour le facteur HNF4 qui coopère par synergie avec un élément de réponse à l’AMPc ( cAMP response element , CRE) pour conférer une stimulation spécifique aux hépatocytes suite à l’induction par l’AMPc. Pour la séquence située à –2,5 kb, un site HNF3 coopère par synergie avec un élément GRE. Une analyse subséquente des régions régulant le gène de la TAT a étudié le rôle d’une séquence activatrice située à -11 kb du SIT de la TAT (Nitsch and Schutz 1993). Deux régions sont importantes dans cette séquence, un fragment de 221 pb et un fragment de 35 pb. Le fragment de 221 pb possède un site de liaison pour le facteur HNF3 et sa délétion résulte en une perte de 90% de l’activité de la séquence activatrice. Des expériences de gel de mobilité suggèrent que la séquence de 35 pb pourrait être liée par des facteurs de transcription ubiquitaires mais les auteurs n’ont pas pu identifier lequel des facteurs ubiquitaires s’y liait. Finalement, une étude a identifié le promoteur basal du gène de la TAT (Schweizer-Groyer et al . 1994). Les auteurs ont montré que les 350 pb les plus proximales du SIT de la tat sont capables d’activer la transcription spécifique à un tissu du rapporteur de la chloramphénicol acétyltransférase (CAT). Des expériences de protection à la DNAse I ont permis de montrer que certains complexes protéiques se lient à cette séquence de manière ubiquitaire et d’autres de manière spécifique à un tissu. Les expériences de gel de mobilité ont permis d’identifier la liaison du facteur ubiquitaire NF-Y à un site situé entre -71 pb et -77 pb du SIT. De plus, ces expériences ont montré la liaison des facteurs spécifiques au foie HNF1 et NF1foie situés respectivement à -161 pb et à -281 pb du SIT de la tat . Donc, le gène de la TAT est exprimé principalement dans le foie et son expression est régulée par trois séquences stimulatrices situés à -11 kb, -3,6 kb et -2,5 kb qui contiennent surtout des sites de liaison pour les membres de la famille HNF, mais est aussi régulée par le promoteur basal situé à 350 pb du SIT de la TAT qui contient des sites de liaisons pour des facteurs de transcription ubiquitaires (NF-Y) et spécifiques à un tissu (HNF1 et NF1foie).

L’activité de la 4-hydroxyphénylpyruvate dioxygénase (HPPD) a été détectée principalement dans le foie et quelque peu dans les reins chez les mammifères (Fellman et al . 1972). La séquence d’ADN flanquant ce gène contient des sites de liaisons possibles à plusieurs facteurs de transcription spécifiques au foie comme HNF1, HNF4 et C/EBP (Awata et al . 1994a). De plus une boîte TATA se retrouve à 17 pb devant une séquence similaire à la séquence consensus d’un site de coiffage de l’ARNm (Awata et al . 1994a). La vérification de cette hypothèse, par expérimentation, n’a pas été explorée pas les auteurs. Une étude subséquente a identifié le site majeur d’initiation de la transcription à 36 pb en amont du codon initiateur de la HPPD par extension d’amorce, une position qui diffère de la séquence consensus de coiffage de l’ARNm (Ruetschi et al . 1997). Il reste que la boîte TATA est toujours à une distance qui lui permettrait de jouer un rôle dans la transcription de ce gène. Cette étude a permis de situer le promoteur basal dans une région comprise entre –441 pb et +13 pb du SIT. Cette région possède des sites de liaisons pour le facteur HNF4, Sp1 et CRE. La liaison de ces facteurs de transcription à la séquence promotrice de la hppd n’a pas été étudiée plus en détails par les auteurs. Cependant, ils ont montré, par essai de chloramphénicol acétyltransférase (CAT), que cette région conférait une réponse à l’AMPc directement ou par stimulation avec un effecteur de cette la voie, le PKA. Le gène de la HPPD a été localisé sur le chromosome 12 dans la région q24.31 (Aarenstrup et al . 2002). Cette étude a également montré, par essai CAT, qu’une construction contenant la région –271 à –1 du SIT de ce gène contenait le promoteur minimal. De plus, quatre régions de la séquence promotrice humaine sont protégées de la DNAse I en présence d’extraits nucléaires de foie de rat. L’analyse des sites de liaison dans ces quatre régions révèle que les facteurs de transcription C/EBP, HNF3, HNF4 et CREB pourraient jouer un rôle dans la régulation du gène de la HPPD. Selon les auteurs, le site HNF4 situé à la position –267 à –244 serait très important pour la régulation de la HPPD. En effet, ce site est protégé de la DNAse I in vitro , et les expériences de transfections transitoires ont montré que le promoteur basal qui inclut ce site putatif (-271/-1) est suffisant pour induire la transcription basale du gène rapporteur. Donc, le gène de la HPPD est exprimé principalement dans le foie et les 271 pb en amont du SIT, qui contiennent un site putatif pour HNF4, sont suffisantes pour la régulation de façon spécifique à un tissu.

Le gène de l’enzyme homogentisate oxidase (HGO) est situé sur le chromosome 3 humain dans la région q13.3-q21 (Schmidt et al . 1997). De plus, l’amplification de l’ARNm de ce gène par RT-PCR montre qu’il semble être exprimé ubiquitairement chez la souris. Le SIT de ce gène a été identifié par extension d’amorce et est situé à 167 pb en amont de l’ATG de la HGO (Granadino et al . 1997). De plus, cette étude a identifié une boîte TATA à 31 pb du SIT qui est identique à celle retrouvée pour le gène de la HGO. L’analyse bioinformatique des sites de liaison des facteurs de transcription montre la présence de deux sites de liaison aux facteurs HNF3, un situé à –1025 pb et l’autre à -351 pb du SIT. De plus, la transfection transitoire dans les HepG2 de la séquence –1074 pb à +89 pb est capable d’activer la transcription du gène rapporteur CAT. Le promoteur de la HGO n’a pas été étudié plus en détails. Le promoteur du gène de la HGO possède une boîte TATA 31 pb devant le SIT identifié et deux sites de liaisons putatifs pour HNF3 ont été identifiés dans une région d’ADN qui confère une activité promotrice capable d’activer la transcription d’un gène rapporteur.

Le gène humain de l’enzyme maléylacétoacétate isomérase (MAI) aussi connu sous le nom de glutathion transférase zêta 1 (GSTZ-1) est localisé dans la région q24.3-q31.1, sur le chromosome 14 (Fernandez-Canon et al . 1999). La MAI est principalement exprimée au niveau du foie chez le rat et a été immunoprécipitée à partir d’homogénats de foie, de cœur, de testicules et de cerveau (Lantum et al . 2002). Des analyses immunohistochimiques ont montré que la GSTZ-1 est exprimée dans tous les tissus de rat mais pas dans tous les types cellulaires qui composent ces tissus (Lantum et al . 2002). Rien n’est connu sur la régulation transcriptionnelle de ce gène puisqu’il a été très peu étudié. Ces données suggèrent que le gène est exprimé de façon ubiquitaire.

La région promotrice de la FAH ne possède pas beaucoup de similarité avec celles des trois premières enzymes du sentier catabolique. Le promoteur et les séquences activatrices de la TAT possèdent de nombreux sites de liaison aux facteurs de transcription enrichis dans le foie, dont les HNF, qui ont été vérifiés expérimentalement. La région promotrice de la HPPD possède une boîte TATA qui est dans une bonne position par rapport au SIT pour influencer la transcription de ce gène. De plus, des expériences suggèrent la liaison des facteurs de transcription enrichis dans le foie HNF3, HNF4 et C/EBP. Ces deux enzymes répondent, de plus, à la signalisation par l’AMPc ce qui n’est pas le cas pour la FAH. Le promoteur de la HGO possède aussi une boîte TATA qui pourrait jouer un rôle dans sa transcription et possèderait un site de liaison pour HNF3 qui serait important pour l’activation de la transcription de façon importante dans le foie. Cependant, ce gène semble être exprimé de façon ubiquitaire chez la souris contrairement à la FAH. De plus, aucun des gènes de ce sentier catabolique ne se retrouve sur le même chromosome, suggérant que ces gènes ne sont pas co-régulés. Donc, le promoteur de la FAH diffère des enzymes du sentier et il faut chercher ailleurs la raison de sa spécificité tissulaire.

Une région intronique pourrait jouer un rôle dans la régulation transcriptionnelle du gène de la fah . Il existe quelques cas dans la littérature pour ce genre de régulation. Le premier intron du gène de la β-caséine de souris contient des éléments régulateurs de la transcription (Kolb 2003). De plus, cette région est conservée entre le rat, l’humain, le bœuf et la souris. Un élément intronique du transporteur d’acides aminés du système A ( System A amino acid transporter ) possède un élément de réponse aux acides aminés ( Amino acid response element , AARE) qui confère une régulation en réponse à la privation en acides aminés (Palii et al . 2004). L’élément AARE est conservé entre l’humain, le rat et la souris. En plus, les observations du Dr Kelsey (Kelsey 1996) pour le gène murin de la FAH suggèrent qu’une région de l’intron 1 serait liée par un complexe protéique spécifique au foie et aux reins de cette espèce. De plus, l’alignement de l’intron 1 entre l’humain et la souris révèle la présence de régions où il y a conservation de la séquence en acides nucléiques (figure 11). Il est possible que ces régions contiennent des sites de liaison important pour la régulation du gène. Donc, il serait important d’obtenir la séquence génomique de l’intron I du gène de la FAH murine afin de savoir si certaines portions de cet intron seraient, en partie, responsables de la régulation ubiquitaire ou de la spécificité tissulaire observée dans l’expression de ce gène.