Entête

1. Revue Bibliographique

Table des matières

Les quelques 150 millions de semis de conifères cultivés chaque année dans les pépinières québécoises sont susceptibles aux pourritures racinaires. Au Canada, Cylindrocladium floridanum (Sobers et Seymour) est le plus important agent causal de pourritures racinaires dans les pépinières (Morin 1999 et al., Hamelin 1996 et al., Saunders 1992 et al.). On as retrouvé C. floridanum pour la première fois dans une pépinière du Minnesota, puis en Ontario et au Québec vers la fin des années soixante. L’impact de cette maladie sur la production de semis prend plusieurs formes. Premièrement, une forte mortalité des semis en pépinière peut être observée; dans certains cas, cette mortalité peut aller jusqu'à 50% de la production (Juzwik 1988 et al.). Ensuite, les semis infectés montrent un fort taux de mortalité après avoir été replantés sur un site de reboisement. On rapporte par exemple 40% de mortalité chez les semis Picea mariana un an après avoir été replantés et 60% chez Pinus resinosa après deux ans (Hamelin 1996 et al. , Saunders 1992 et al.).

Ce champignon produit des microsclérotes pouvant survivre dans le sol pendant des années et atteindre des densités allant jusqu’à 60 propagules par gramme de sol (Thies and Patton 1970). Ces structures servent d’innoculum aussitôt qu’un hôte susceptible se présente (Morin et al. 1999). Ensuite, il envahit l’apex racinaire pour se propager vers la couronne causant sur son passage une nécrose du cortex extérieur. Les symptômes visibles comprennent une chlorose et une croissance très réduite des nouvelles pousses. Au niveau des racines, on peut observer des lésions dès les premiers stages de la maladie; ces dernières sont souvent accompagnées de résinoses (Saunders et al. 1992). Les moyens de contrôle et de lutte contre cet agent pathogène sont rares. Certaines pratiques culturales peuvent contribuer à réduire l’incidence de la maladie. Par exemple, la rotation des cultures avec des plantes qui ne favorisent pas le développement du champignon (le millet et le lin par exemple) peut donner de bon résultats (MRNFP 2003). Dans le cas de la lutte chimique, la vie souterraine du champignon en fait une mauvaise cible pour les fongicides conventionnels. Pour contrer ce problème, la fumigation des sols avec des composés tels le bromure de méthyl (BM) et la choropicrine ont été largement utilisés. De plus, la fumigation semble être le seul moyen efficace pour réduire la population de microsclérotes dans le sol (Morin et al. 1999). Cependant, la maladie peut être présente même dans des champs fumigés, ce qui peut être attribuable à une recolonisation du sol par le pathogène, une fumigation insuffisante ou à l’élimination de microorganismes bénéfiques.

Durant le dernier siècle, une somme considérable de recherche a maintes fois démontré que plusieurs microorganismes de diverses origines phylogénétiques sont capables d’inhiber différents agents pathogènes. Les interactions plante-microorganismes sont complexes et celles menant au biocontrôle peuvent inclure l’antibiose, la compétition, l’induction des mécanismes de défense de la plante et la prédation (Benizri et al. 2001). Au niveau de la rhizosphère et du contrôle des agents pathogènes telluriques, la lutte se fait principalement via des bactéries appartenant aux genres Streptomyces, Bacillus, Agrobacterium et Pseudomonas et des champignons des genres Ampelomyces, Candida , Coniothyrium et Trichoderma . La majorité des études montrent que de 1 à 10% des isolats du sol peuvent avoir un certain pouvoir antagoniste in vitro , mais de ce nombre, très peu ont la capacité de supprimer les agents phytopathogènes dans divers sols et conditions de croissance et encore un plus petit nombre encore est capable d’inhiber un large spectre d’espèces pathogènes (McSpadden Gardener and Fravel 2002).

Les Pseudomonas forment un large groupe colonisant le sol, les plantes et l’eau. Ces bactéries Gram négatives, non sporulantes, sont aérobes obligatoires, à l’exception de certaines pouvant utiliser le NO3 comme accepteur d’électrons. Leur mobilité est assurée par plusieurs flagelles polaires, et elle ont un métabolisme mésophile et chimioorganothorphe, la plupart étant saprophytes (Bossis et al. 2000). Quelques espèces comme P. syringae , sont phytopathogènes et certaines peuvent causer des infections chez l’humain. Particulièrement P. aeruginosa , reconnu comme pathogène opportuniste et causant des infections pulmonaires mortelles chez les patients atteints de fibrose kystique (Mavrodi et al. 2001). Plusieurs études ont souligné le haut degré de diversité au sein de P. fluorescens , ce qui a mené à la subdivision de cette espèce en différents biovars (Bossis et al. 2000).

Dans le sol, les Pseudomonas représentent une grande fraction de la communauté microbienne partageant leur milieu avec des commensaux représentant principalement les genres Bacillus et Actinomyces . On les retrouve sous tous les horizons, particulièrement sur les systèmes racinaires des plantes. Les différentes espèces de Pseudomonas qui colonisent la rhizosphère possèdent plusieurs charactéristiques intrinsèques qui les rendent particulièrement intéressantes pour une utilisation comme agents de lutte biologique. Premièrement, leur capacité à coloniser les racines et à y maintenir une forte densité de population est remarquable (Haas and Keel 2003). Cette grande rhizocompétence vient sans doute de leur taux de croissance plus élevé que celui de la plupart des autres rhizobactéries et de leur capacité à métaboliser efficacement plusieurs composés des exudats racinaires (Chin-A-Woeng et al. 2002). De plus, ces bactéries sont très faciles à isoler et à cultiver au laboratoire et se prêtent aisément aux manipulations génétiques (Chin-A-Woeng et al. 2001, Fenton et al. 1992).

Les Pseudomonas , principalement l’espèce P. fluorescens , sont connues depuis longtemps pour leur aptitude à réduire l’incidence des maladies racinaires dans certains champs, ainsi qu’à inhiber la croissance d’un grand nombre d’agents phytopathogènes in vitro . Cette capacité d’inhibition peut se faire selon plusieurs mécanismes incluant la production d’une large gamme de métabolites antagonistes et de sidérophores. Ces derniers permettent de compétitionner farouchement pour l’acquisition du fer. Dans un milieu comme le sol où cet élément est présent en très faible quantité, cela peut nuire à la croissance saprophyte de plusieurs agents pathogènes et ainsi réduire la sévérité de la maladie. On note également pour certaines souches une capacité à induire les mécanismes de défense chez la plante (Kim 2004 et al., Iavicoli 200 et al.). Mais dans la plupart des cas d’inhibition, le facteur déterminant est la production d’antibiotiques qui agissent directement sur l’agent pathogène.

Le premier rapport sur l’utilisation d’un Pseudomonas produisant un antibiotique pour le contrôle d’un agent pathogène racinaire, en l’occurrence Rhizoctonia solani , est venu de Howell et Stipatovic en 1979. Ces auteurs identifièrent la pyrrolnitrine produite par une souche de Pseudomonas fluorescens comme facteur permettant d’inhiber le pathogène. Par contre, on doit à Thomashow et Weller, neuf ans plus tard, la première démonstration expérimentale, utilisant une approche génétique pour démontrer l’implication d’un antibiotique produit par une souche de Pseudomonas dans la suppression d’un agent phytopathogène. Ces derniers ont utilisé une souche de P. fluorescens productrice d’acide phénazine carboxilique, isolée de la rhizosphère du blé, et fortement antagoniste envers Gaeumannomyces graminis . Des mutants de cette souche, déficients dans leur capacité à produire l’antibiotique, ont été comparés à la souche mère dans des tests d’inhibition in vitro et in situ . Les mutants étaient alors incapables d’inhiber le champignon en boites de pétris et de prévenir la fonte des semis au champ. De plus, une fois complémentés génétiquement par un plasmide provenant d’une banque d’ADN génomique de la souche mère, les mutants voyaient leurs capacités d’inhibition restaurées (Thomashow and Weller 1988). Ce type de démonstration a depuis lors été réalisé également pour d’autres composés comme le DAPG, la pyrrolnitrine, la pyoluteorine et le HCN (Haas and Keel 2003). D’autre part, l’utilisation de mutants surproducteurs contribua plus tard à soutenir la thèse de l’importance du rôle des antibiotiques, car les souches produisant plus d’antibiotiques voyaient leur capacitée de suppression d’autant augmentée. Certaines souches ont également été manipulées génétiquement afin de leur permettre de produire plusieurs antibiotiques (Bakker et al. 2002, Chin-A-Woeng et al. 2001) Ensuite, l’utilisation de gènes rapporteurs et de sondes pour mesurer l’expression des gènes impliqués dans la production d’antibiotiques a permis de détecter l’activité des ces gènes lors de la colonisation des racines (Chin-A-Woeng et al. 1998). Finalement, l’isolation et la quantification d’antibiotiques directement dans la rhizosphère a été réussie pour le PCA et le DAPG suite à l’introduction des souches productrices de ces composés, ce qui permit de confirmer que ces antibiotiques sont bien produits in situ (Thomashow et al. 1990, Bonsall et al.1997, Raaijmakers et al.1999).

L’idée que des rhizobactéries peuvent être utilisées pour lutter contre les agents pathogènes telluriques découle en partie de certaines études faites sur les sols suppressifs (Keel et al. 1996, Mazzola et al. 2002, Raaijmakers et al. 1997, 1998). Un sol suppressif se caractérise par une très faible incidence d’infection, ou l’absence totale de maladie, malgré la présence d’un organisme capable d’infecter la plante et d’un hôte susceptible (Weller et al. 2002). Bien que certains facteurs physiques comme le pH, la proportion de matière organique et d’argile puissent influencer la capacité de suppression, cette dernière est généralement directement liée à la communauté microbienne. Certains auteurs ont également postulé que plusieurs espèces de plantes ont développé une stratégie de défense contre les pathogènes telluriques qui implique la stimulation sélective et le support de populations de microorganismes antagonistes (Cook et al. 1995).

On rencontre deux types de sol suppressifs : premièrement, ceux offrant une suppression dite générale. Ce type de suppression est lié à la biomasse microbienne totale qui compétitionne avec le microorganisme nuisible. Dans ce cas, aucune espèce unique n’est responsable et la suppressivité n’est pas transférable d’un sol à l’autre. Deuxièmement, la suppression spécifique, qui se superpose à la suppression générale, est causée par l’action d’un groupe précis de microorganismes et est transférable (Weller et al. 2002). Le rôle des microorganismes dans la suppression a été avancé par plusieurs études montrant que le potentiel de suppression d’un sol peut être transféré à un sol conductif par le simple transfert d’une petite quantité de sol suppressif. Également, la capacité de suppression disparaît sitôt le sol pasteurisé (Weller et al. 2002, Mazzola et al.2002).

Des sols suppressifs ont été caractérisés pour plusieurs pathosystèmes différents. On rencontre des sols dans lesquels des agents pathogènes comme les nématodes Heterodera spp. , la bactérie Streptomyces scabies , les champignons Fusarium oxysporum, Rhizoctonia solani et Gaeumannomyces graminis ainsi que l’oomycète Phytophthora cinnamomi sont incapables de croître convenablement et d’infecter leurs hôtes (Weller et al. 2002). C’est plus particulièrement l’étude des sols favorisant le déclin du piétin échaudage du blé causé par Gaeumannomyces graminis var tritici . qui aiguillonna les chercheurs sur la piste des Pseudomonas fluorescens producteurs d’antibiotiques. En effet, on a observé depuis longtemps que certains champs du nord-ouest des États-Unis où l’on pratiquait une monoculture de blé depuis plusieurs années pouvaient, après une sévère épidémie de piétin échaudage, voir la sévérité de la maladie baisser graduellement jusqu'à sa suppression. On remarqua alors que les racines des plants de blé poussant dans ces sols abritaient une grande densité (2 x 106 CFU g-1 de racine) de Pseudomonas fluorescens capable de produire l’antibiotique 2,4-diacéthylphloroglucinol. À l’opposé, la proportion de la population de Pseudomonas capable de produire cet antibiotique était nulle ou très faible dans les rhizospheres de blé provenant de 4 sites propices à la maladie. Finalement, l’introduction à faible dose d’une souche de Pseudomonas fluorescens capable de produire le DAPG, dans un sol conductif, permit de contrôler la maladie aussi bien que dans le sol suppressif (Thomashow 1988). Outre-Atlantique, des phénomènes semblables de suppression impliquant les Pseudomonas producteurs d’antibiotiques ont également été étudiés. Par exemple, dans la région de Morens en Suisse où le pathogène Thielaviopsis basicola, agent causal de la pourriture noire du tabac, est présent avec sa plante hôte mais ne cause pas de dommages (Ramette et al. 2001). Dans ce cas, ces bactéries furent massivement isolées de ces sols. Elles inhibaient fortement l’agent pathogène in vitro et conféraient une capacité de suppression lorsqu’inoculées dans un sol conductif. Cette habileté était perdue suite à un traitement à la vapeur (Ramette et al. 2001). Dans ces deux cas la suppressivité des sols était directement corrélée à la densité de population de Pseudomonas portant les gènes de production de DAPG (Ramette et al. 2001).

En plus de cette découverte sur les sols suppressifs dans le nord-ouest des États Unis, des souches de Pseudomonas productrices d’antibiotiques ont été isolées sous plusieurs horizons géographiques différents et associées aux rhizosphères d’une grande variété de plantes agricoles. Par exemple, en plus du blé, des rhizosphères de betteraves à sucre en Irlande, de concombre et de tomates en Suisse, de coton au Texas et de tabac au Ghana ont livré des souches productrices de DAPG (Raaijmakers et al. 1998). Mais à ce jour, aucune étude n’a porté sur leur présence dans les rhizosphères de plants forestiers.

Les phloroglucinols sont des métabolites secondaires phénoliques produits par des plantes, algues et bactéries. Plus d’une soixantaine de dérivés ont été décrits pour leurs activités antimicrobiennes, antivirales, antihelminthiques, phytotoxiques, cytotoxiques et antioxydantes (Bender and Rangaswamy 1999, Dwivedi and Johri 2003). De ce nombre, c’est l’activité antimicrobienne qui a attiré le plus l’attention des chercheurs. En effet, plusieurs études ont démontré que les souches de Pseudomonas spp. productrices de DAPG peuvent supprimer une large gamme d’agents phytopathogènes, incluant bactéries, champignons et nématodes. Les travaux sur les sols suppressifs ont permis de démontrer l’importance des Pseudomonas producteurs de DAPG dans le phénomène de suppression. Mais le rôle déterminant de l’antibiotique dans l’inhibition de l’agent pathogène a également été clairement démontré, notamment par le blocage de la voie métabolique par mutation. Les mutants non producteurs de DAPG sont incapables d’exercer une pression sur plusieurs pathogènes fortement inhibés par les souches mères.

Le groupe de gènes responsable de la formation du DAPG a été identifié et caractérisé chez la souche Q2-87 (Bangera et al. 1996, 1999). L’analyse des séquences de ces gènes a permis d’élaborer un modèle pour la biosynthèse du composé. On peut fixer avec certitude que le monoacéthylphloroglucinol (MAPG) est le précurseur immédiat du DAPG. À ce jour, le précurseur du MAPG n’a pas été clairement identifié mais la présence de groupements hydroxyles en position alternantes sur le noyau phloroglucinol pointe vers un mécanisme de synthèse semblable à celui des polycétides. Les polycétides sont une famille de molécules naturelles produites par condensation successive de petits acides carboxyliques selon un procédé similaire à la synthèse des acides gras. Trois types de polycétides synthases (PKS) sont connus. On retrouve chez les microorganismes des PKS de types I et II principalement, les premières étant de larges enzymes multi-fonctionnelles alors que les autres sont formées d’un complexe multi-enzymatique de 4 à 6 sous-unités. Parallèlement, on retrouve chez les plantes des PKS de type III. Ces enzymes végétales sont composées d’une protéine homodimérique capable d’assurer les étapes de condensation et de cyclisation menant à la synthèse de nombreux composés phénoliques impliqués dans les réactions de défense (Bangera and Thomashow 1999).

Chez P. fluorescens Q2-87, six gènes désignés phlA, phlB, phlC, phlD, phlE et phlF , faisant partie de la voie métabolique, ont été identifiés sur un fragment génomique de 7.2 kb. L’enzyme PhlD est essentielle pour la synthèse du MAPG . Cela a été démontré tant chez P. fluorescens Q2-87, que chez E. coli exprimant les gènes phl . En effet, en l’absence de cette enzyme, les cellules étaient capables de convertir le MAPG exogène en DAPG mais ne pouvaient produire d’elles-mêmes aucune des deux molécules (Bangera and Thomashow 1999). De plus, l’enzyme PhlD cache une caractéristique remarquable : une forte homologie structurale avec les membres de la famille des chalcones synthétases (CHS) et stilbènes synthétases (STS). Cette homologie est surprenante car avant cette découverte, tous les autres polycétides microbiens étaient connus pour être synthétisés par des PKS de types I et II seulement alors, que PhlD serait une PKS de type III. Cette ressemblance structurale laisse entrevoir une origine évolutive commune et le parallèle entre le rôle joué par ces deux enzymes dans la défense de la plante permet de spéculer sur un possible événement d’échange génétique entre la plante et ses colonisateurs bactériens (Bangera and Thomashow 1999, Cook et al. 1995). Cependant, une étude sur les relations phylogénétiques entre les séquences d’acides aminés de PKS III de différentes plantes et bactéries Gram positives met cette conclusion en doute. En effet, selon ces résultats, la PKS la plus près de PhlD serait celle de S. griseus (Ramette et al. 2002). Il est donc possible que la ressemblance entre PhlD et les CHS végétales soit le fruit d’une évolution convergente dans la biosynthèse de métabolites secondaires plutôt qu’un événement de transfert horizontal. Dans le cas de l’activité catalytique de PhlD, l’analogie structurale avec d’autres enzymes permet de croire à une condensation d’un précurseur (possiblement l’acéto-acétyl-CoA) pour former un polycétide linéaire à huit carbones. Ensuite, PhlD serait responsable de la cyclisation de ce composé pour former le MAPG.

Pour le reste de la voie métabolique, il semble que les produits des gènes phlA, phlC et phlB travaillent de concert. Cette affirmation se base sur le fait qu’une mutation dans n’importe lequel de ces gènes cause un même phénotype. Il semble aussi que ces enzymes occupent un double rôle. D’abord, le groupe serait nécessaire pour catalyser la réaction de condensation formant le précurseur utilisé par PhlD. Ensuite, les trois enzymes seraient nécessaires et suffisantes pour la transformation du MAPG en DAPG par une activité acétyle transférase. Malheureusement, l’analyse des séquences de PhlA et PhlB ne permet pas de tirer de conclusions car aucun motif reconnaissable n’est présent et il n’y a pas d’homologies significatives avec d’autres protéines connues. La protéine PhlC, pour sa part, affiche des caractéristiques structurales typiques des enzymes de condensation, ces caractéristiques étant en accord avec les fonctions de synthèse du précurseur et d’acétylation du MAPG. Les autres gènes présents sur l’opéron ne sont pas impliqués dans la biosynthèse du DAPG mais codent plutôt pour des protéines importantes dans la régulation et l’exportation de l’antibiotique. PhlE, par exemple, montre des similitudes structurales avec des perméases membranaires et des protéines de transport que l’on retrouve encodées sur certains regroupements de gènes impliqués dans la synthèse de polycétides. De plus, il a été observé qu’une mutation insertionnelle de phlE avait pour incidence une réduction de la production de DAPG et la perte du pigment rouge caractéristique des phloroglucinols. Dans la cas de phlF , ce gène transcrit de façon divergente à partir de l’extrémité 5’ produit une protéine régulatrice. En effet, le produit de phlF montre un motif hélice-tour-hélice, ce qui trahit une activité de liaison à l’ADN. Le site de liaison se situe dans la région intergénique phlF-phlA (Delaney et al. 2000).

Finalement, le regroupement des gènes phl chez P. fluorescens montre un exemple de voie de synthèse de polycétide unique chez les bactéries et conservé à travers les souches de différente origines. Mais bien que l’opéron soit conservé à travers les différents isolats, le gène phlD quant à lui montre un polymorphisme important.

L’isolement de Pseudomonas fluorescens à partir de plusieurs régions géographiques a fourni plusieurs groupes différents de producteurs de DAPG. Premièrement, sur la simple base de la production d’antibiotiques, on remarque deux groupes distincts. D’un côté, ceux produisant le DAPG, le cyanure d’hydrogène (HCN), la pyolutheorine (PLT) et, dans certains cas, la pyrrolnitrine (PYR) ; et de l’autre, ceux ne produisant que le DAPG et le HCN (Mavrodi et al. 2001, Keel et al. 1996). Les souches issues du groupe PLT+ seraient assez homogènes génétiquement malgré diverses origines géographiques et ne seraient présentes que dans les rhizosphères de dicotylédones, alors que le groupe PLT- rassemble des isolats d’une grande variabilité génétique qui sont présents chez les monocotylédones et dicotylédones (Keel et al. 1996, Wang et al.2001). Cette variabilité a d’abord été mise en évidence par l’étude d’une collection de 45 souches DAPG+ isolées de sols suppressifs d’Italie, de Suisse, du Ghana et des États-Unis (Keel et al. 1996). L’analyse des patrons de restriction de l’ADN ribosomique amplifié (ARDRA) a permis de discriminer 3 groupes : le premier comprenant toutes les souches PLT+, le troisième ne regroupant que deux souches et le deuxième englobant toutes les autres. De plus, une certaine diversité génétique au sein des différents groupes ARDRA a également été observée par analyse RAPD. Au niveau phénotypique, les différents isolats montrent également des différences. La production de DAPG et de PLT in vitro par les différents isolats peut varier de 1.3 µg/ml à 63.5 µg/ml pour le DAPG et de 0.1 µg/ml à 127.5 µg/ml pour la PLT (Keel et al. 1996). Dans une autre étude utilisant 138 souches isolées des rhizosphères de blé des États-Unis et des Pays-Bas, des résultats similaires furent obtenus (Landa et al. 2002). L’analyse ARDRA révéla 3 groupes dont un comportant 87% des isolats. De plus, l’utilisation d’une technique d’empreinte génétique (box-PCR) a permis de trouver une variabilité plus étendue en identifiant 13 génotypes différents (Mavrodi et al. 2000, McSpadden-Gardener et al.2000). Dans la même veine, 64 profils RAPD différents ont été obtenus à partir de 188 souches provenant de rhizosphère de maïs (Picard and Bosco 2000). Dans ce cas, les isolats ont été récoltés à différentes étapes du développement de la plante. Les auteurs ont remarqué que la fréquence d’isolement des producteurs de DAPG était plutôt faible au début mais que la rhizosphère était colonisée par un nombre grandissant de producteurs de DAPG au cours de son développement. Parmis les différents isolats, 4 groupes ARDRA ont été identifiés dont un englobant 89.8% des souches. Une forte diversité génétique au sein de ce groupe dominant a ensuite été révélée à l’aide de marqueurs RAPD. Il y aurait de plus une relation entre l’âge de la plante et le niveau de diversité. Ce dernier serait assez constant au cours du développement mais chuterait à la fin du développement alors que les racines sont fortement colonisées (Picard and Bosco 2000). Cela pourrait être expliqué par la plus grande capacité d’un génotype particulier à coloniser les racines de maïs, ce génotype serait alors dominant à la fin du cycle de croissance et la diversité génétique serait moindre. Une autre observation vient appuyer cette hypothèse; la diversité génétique des producteurs de DAPG est plus grande dans le sol rhizosphèrique qu’à la surface même des racines. Cette somme d’information traduit bien le fort degré de diversité génétique présent chez les populations de Pseudomonas producteurs de DAPG, mais ne permet pas de déterminer si cette diversité peut être corrélée avec une diversité dans les gènes de synthèse de DAPG.

La séquences du gène phlD , codant pour l’enzyme clé dans la synthèse du DAPG, a été étudiée chez plusieurs souches. Il en est ressorti la mise en lumière d’un polymorphisme important qui permet de classer les isolats en différents groupes selon leurs profil RFLP. Chose étonnante, ce classement correspond presque parfaitement à celui obtenu par empreinte génétique Box-PCR (Mavrodi et al. 2000, Picard et al. 2003). D’autres études ont démontré que le polymorphisme de ce gène révélé par RFLP pouvait être corrélé à la diversité génomique observée chez les producteurs de DAPG (Mavrodi et al. 2001, Ramette et al. 2001). Dans ces études, les génotypes basés sur l’analyse des patrons ARDRA et sur l’analyse RAPD, correspondaient bien aux différents génotypes obtenus par RFLP sur le gène phlD avec l’endonucléase Hae III. Par contre, dans une collection de 144 souches associées au maïs et incluant 4 groupes ARDRA et 59 groupes RAPD, un seul et même génotype a été identifié par digestion Hae III de phlD (Picard et al. 2003).

La possibilité d’un lien entre les différents génotypes et la production de DAPG a suscité plusieurs études. Par exemple, la quantité de DAPG produite in vitro sur gélose malt et milieu KMB pouvait être jusqu'à 49 fois plus élevée chez les souches de certains génotypes (Keel et al. 1996). Ce même genre d’analyse a été effectué sur une collection de 39 souches représentant 7 génotypes différents pour phlD . Une grande variabilité dans la quantité de DAPG produit par les souches a également été observée (Ramette et al. 2001). Un lien semblable entre la production de DAPG et le génotype de phlD a été souligné par Picard et al. (2003). L’utilisation de l’enzyme Ksp I plutôt que Hae III a permis de classer la banque de 144 souches en deux groupes, selon la présence d’une mutation ponctuelle à la position 520. Les 82 souches possédant cette mutation se sont révélées de meilleures productrices de DAPG (Picard et al. 2003). Il est important de noter que dans tous les cas, le polymorphisme génétique ne se traduit pas en polymorphisme d’acides aminés chez l’enzyme. Les différents niveaux de production ne peuvent donc pas résulter d’une diversité fonctionnelle. Ces résultats ne permettent donc pas de faire un lien direct entre le polymorphisme de phlD et la production du DAPG. Les différences de production de l’antibiotique pourraient être reliées à des différences génomiques ou possiblement à des différences au niveau des mécanismes de régulation de la production d’antibiotiques. De plus, il serait hasardeux d’extrapoler ces résultats obtenus en boîtes de pétris à la réalité de la rhizosphère.

Cette diversité génétique au sein des différentes souches de producteurs de DAPG peut être exploitée afin de trouver des souches ayant un pouvoir de biocontrôle supérieur. Le cas des différences dans la quantité d’antibiotiques produite par les différentes souches est un exemple. De façon plus convaincante, il semble que les souches appartenant à un génotype particulier seraient capables de coloniser les racines de façon plus efficace et de maintenir une densité de population nettement supérieure (Landa et al. 2002, Raaijmakers et al. 2001). La colonisation racinaire est un facteur déterminant pour le biocontrôle, une plus grande capacité de colonisation permet donc une meilleure colonisation de la plante (Haas and Keel 2003).

Dans un groupe de 101 isolats provenant de la rhizosphère du blé, 16 groupes différents ont été identifiés par RAPD. De ce nombre, un génotype occupait plus de 50% de la population totale de producteurs de DAPG. Des études à court et à long terme ont démontré, chez les membres de ce génotype (souche utilisée : Q8r1-96), un niveau d’adaptation supérieur aux rhizosphères de blé. En effet, la souche Q8r1-96 nécessite un inoculum beaucoup plus faible que ses homologues des autres génotypes afin d’établir une forte densité de population sur les racines (107 UFC g de racine-1). De plus, cette souche avait la capacité de maintenir une densité de population de 105 UFC par g de racines après 8 cycles de croissance du blé. Les souches Q2-87 et 1M1-96, pour leur part, voyaient leurs populations diminuer rapidement après 5 cycles et passer sous la limite de détection après 7 cycles. Dans une étude à court terme, les trois souches démontraient une capacité similaire à supprimer la maladie. Par contre, après 8 cycles de croissance, la souche Q8r1-96 offrait encore un niveau de contrôle élevé alors que les deux autres n’étaient plus efficaces (Raaijmakers et al. 2002). Une analyse biochimique a permis de démontrer que le niveau de production de DAPG in situ n’est pas impliqué dans ce phénomène. En effet, cette capacité de colonisation supérieure serait plutôt due à plusieurs différences au niveau génomique. De plus, la capacité de différents génotypes à coloniser la rhizosphère de pois a été déterminée en utilisant 300 souches appartenant à 7 génotypes différents. Encore une fois, les souches appartenant au même génotype que Q8r1-96 se sont révélées capable, de maintenir une densité de population plus élevée que les autres (Landa et al. 2002).

Dans une autre étude, les auteurs ont utilisé deux souches de différents génotypes (Q2-87 et Q8r1-96) dont une (Q8r1-96) appartenant à un génotype dont les membres sont reconnus pour leur capacité supérieure à coloniser les racines. Une étude utilisant l’hybridation soustractive supressive a permis de faire ressortir certaines différences entre les génomes des souches Q8r1-96 et une autre souche isolée du blé (Q2-87) mais montrant une moins grande capacité de colonisation. Plusieurs gènes présents chez Q8r1-96 et absents chez l’autre ont été identifiés (Mavrodi et al. 2002). La présence de ces gènes semble promouvoir une meilleure colonisation. Un total de 32 gènes uniques à la souche Q8r1-96 a été identifiés par hybridation soustractive suppressive. De ce nombre, 12 montraient une homologie avec des protéines hypothétiques, 16 n’avaient aucune homologie avec des séquences connues et 3 séquences ressemblaient à des gènes de régulation retrouvés chez d’autres Pseudomonas .

La biosynthèse de ces composés semble débuter avec l’acide shikimique duquel est tiré le chorismate qui sera transformé en acide 2,3-dihydro-3-oxo anthranillique. Ce dernier pourra alors se dimériser pour former le premier composé de la famille, soit l’acide phénazine-1-carboxylique (PCA). C’est à partir du PCA que seront dérivées les autres molécules comme la pyocyanine , la phénazine-1-carboxamide (PCN) et l’hydroxyphénazine (OH-PCA). Les gènes impliqués dans la synthèse des phénazines sont regroupés sur un même opéron et sont bien conservés entre P. fluorescens 2-79, P. chlororapis PCL1391, P. aeruginosa PA01 et P. aureofaciens 30-84. Dans chacun des cas, on trouve un opéron de sept gènes : phzA,B,C,D,E,F,G dont la séquence de nucléotides montre une homologie de l’ordre de 70 à 95% d’identité entre ces différentes espèces. (Delaney et al. 2001, Chin-A-Woeng et al. 2003, Mavrodi et al. 1998). De plus, chez P. aeruginosa PA01, le génome contient 2 opérons : phzA1,B1,C1,D1,E1,F1,G1 et phzA2,B2,C2,D2,E2,F2,G2 distants de 2.6 Mb et dont la séquence est identique à 98.3 %. Chacun de ces deux opérons est suffisant pour la production de PCA (Mavrodi et al. 2001). Les différentes espèces de Pseudomonas partagent donc des gènes de production de phénazine assez semblables mais elle se démarquent par l’éventail des phénazines qu’elle produisent.

En effet, chez certaines espèces, d’autres enzymes peuvent intervenir pour former différents dérivés à partir du PCA. C’est le cas de P. chlororapis PCL1391, chez qui le gène phzH , situé en aval de phzG , code pour une asparagine synthase responsable de la production de phenazine-1-carboxamide (PCN). Également chez P. aureofaciens , le gène phzO catalyse la conversion du PCA en acide 2-hydroxyphénazine carboxylique qui se transformera de lui-même en 2-hydroxyphénazine (2-OH-PCA) ( Delaney et al. 2001). Finalement, dans le cas de P. aeruginosa PA01, en plus de phzH , deux autres gènes modificateurs entrent en jeu. D’abord, on trouve phzM , à 695 pb en amont de l’opéron phzA1,B1,C1,D1,E1,F1,G1 . Ce gène, transcrit de façon divergente par rapport à l’opéron, code pour une méthyletransférase qui prend en charge la première réaction. Ensuite, l’enzyme PhzS utilise son action monooxygénase pour produire la pyocyanine. Cette protéine est codée par phzS , que l’on retrouve cette fois en aval de phzG1 . On note également que PhzS serait responsable de la formation de 1-hydroxyphénazine à partir du PCA (Ching-A-Woeng et al. 2003).

Les premières études sur le rôle des antibiotiques produits par les rhizobactéries suggéraient une implication dans la survie des microorganismes dans le sol. Cependant, certains auteurs se questionnaient sur la synthèse de ces composés au niveau du sol, étant donné la faible quantité de nutriments, spécialement de composés carbonés, présents dans cet environnement. Le doute fut dissipé suite à l’extraction de PCA directement à partir de racines de blé colonisées par P. fluorescens 2-79 ou P. aureofaciens 30-84 (Mazzola et al. 1992). De plus, le rôle écologique des phénazines produites par ces deux souches a été mis en lumière par l’utilisation de mutants déficients dans la production d’antibiotiques. En effet, la perte de l’aptitude à produire des phénazines se traduit par une réduction marquée de leur aptitudes à coloniser la rhizosphère du blé et à survivre dans le sol en compétition avec la communauté microbienne indigène. Cette capacité de colonisation et de survie est alors restaurée et égale à celle des souches parentales, par la complémentation génétique des mutants (Mazzola et al. 1992). L’avantage de la production de phénazine pour la colonisation et la survie dans la rhizosphère a également été démontré en comparant le comportement des souches parentales et des souches mutantes dans des sols naturels et des sols stérilisés. Dans le sol stérilisé, où la compétition pour l’espace et les nutriments est nulle, les mutants Phz- pouvaient coloniser la rhizosphère du blé aussi bien que les souches Phz+. Par contre, dans le sol naturel à forte compétition microbienne, les souches Phz- étaient largement déclassées par leurs homologues parentaux. Il semble aussi que cet avantage compétitif, soit moins important lorsque les racines sont infectées par le pathogène G. graminis var. tritici . Étant donné que le champignon provoque un état de surabondance des nutriments par son action lytique sur les cellules racinaires, la pression de compétition diminue, de même que l’avantage procuré par la production d’antibiotiques. L’implication des phénazines dans la compétition écologique se traduit également par une action directe sur le biocontrôle des pathogènes racinaires fongiques (Chin-A-Woeng et al. 2003, Cook et al. 1995).

On a souvent remarqué une variation de l’efficacité du biocontrôle par P. fluorescens 2-79 entre différents sites. Étant donné que la performance de cette souche est directement liée à sa production de PCA (Thomashow 1988, Hadman et al. 1991), on peut conclure que ces variations seraient dues, entre autres, à des facteurs physiques influençant la production de PCA. Dans une étude utilisant P. fluorescens 2-79, la capacité de cette souche à stopper l’infection des racines de blé par G. graminis var. tritici a été mesurée dans 10 sols aux caractéristiques différentes. Il semble alors que certaines propriétés du sol auraient un effet négatif sur le biocontrôle. On retrouve, dans cette catégorie, le pourcentage d’azote et de carbone total, la capacité d’échange au champ, l’acidité, le fer, le manganèse et le pourcentage de matière organique. À l’inverse, d’autres facteurs influencent positivement l’efficacité du biocontrôle, ce qui tend à réduire la sévérité de la maladie. Ces facteurs incluent l’azote sous forme ammonium, la quantité de sodium et de soufre, le pourcentage de sable, le pH du sol et finalement le zinc. Dans le cas du zinc, des tests d’amendements ont démontré clairement son effet positif sur le biocontrôle du piétin échaudage par P. fluorescens 2-79. L’ajout de zinc n’a eu aucune incidence sur la sévérité de la maladie chez les semis traités en absence de bactéries mais un contrôle maximal était obtenu dans les sol contenant le plus fort amendement (50µg Zn-EDTA/g de sol) (Ownley et al. 2003). Cette efficacité de suppression accrue peut s’expliquer par une stimulation de la production de PCA car, en culture liquide, la concentration de PCA dans le milieu augmente suite à l’augmentation de la concentration de sulphate de zinc (Slininger et al. 1995). Le pH semble avoir un effet direct tant sur la production de PCA que sur la répression de la maladie. En effet, la concentration de PCA en fermentation liquide est optimale à pH 6.0 et décline rapidement aux valeur de pH supérieures et inférieures (Slininger et al. 1995). De plus, il a été démontré que l’inhibition in vitro de la croissance de G. graminis par la souche 2-79 était plus forte à des valeur de pH entre 6.0 et 6.6 et faible à des pH entre 4.9 et 5.8. Par contre cette même souche était capable de réduire significativement la maladie dans des sols aux pH allant de 4.9 à 8.0 (Ownley et al. 1992). Le pH peut également faire varier l’effets des différents dérivés des phénazines. Par exemple, on note que l’activité antifongique in vitro , à pH 5.7 est 10 fois plus élevée pour le PCN que pour le PCA. (Chin-A-Woeng et al. 2003)

Le spectre d’action étonnamment large des phénazines, ainsi que le mécanisme de cette action au niveau cellulaire ne sont pas à ce jour bien compris. On peut cependant croire, en se référant à la structure de ces molécules, que suite à leur diffusion à travers la membrane de la cellule cible, elle pourraient agir comme accepteur d’électron et court-circuiter la chaîne respiratoire. Cette interférence dans le transport normal des électrons aurait pour effet de produire une grande quantité de peroxyde d’hydrogène (H2O2) et d’ions superoxyde O2 -. La quantité de ces deux molécules cytotoxique serait alors suffisante pour surcharger la superoxide dismutase et mener directement à la mort de la cellule (Delaney et al. 2001). La bactérie productrice est protégée de l’effet de ces molécules par l’activité très élevée de la superoxyde dismutase, comme c’est le cas chez la productrice de pyocyanine P. aeruginnosa (Chin-A-Woeng et al. 2003, Delaney et al. 2001). L’activité de ce genre d’enzyme peut également être à la base des mécanismes de défense chez les agents pathogènes. En effet, il a été démontré que l’addition de doses subléthales de OH-PCA à des cultures liquides de Mycosphaerella graminicola engendrait une forte augmentation de l’activité des catalases, peroxidases et superoxide dismutase, ce qui permet au champignon de survivre en présence des ces antibiotiques (Levy et al. 1992).

L’effet d’une phénazine lors de l’interaction plante-bactérie-agent pathogène a pu être visualisé par une étude en microscopie confocale utilisant P. chlororapis (producteur de PCN) et Fusarium oxysporum f. sp. radicis-lycopersici tous deux marqués avec différentes molécules autofluorescentes (Bolwerk et al. 2003). Durant les 3 premiers jours d’interaction, la croissance et l’attachement des hyphes au système racinaire n’étaient pas affectés par la présence de la bactérie. Cependant, après 7 jours, la densité du réseau d’hyphes était considérablement réduite en présence de P. chlororapis . De plus, aucune pénétration des racines n’était observée à proximité des cellules du Pseudomonas.

Un phénomène de distorsion de la croissance des hyphes est également observé en présence de la bactérie. Cela résulte en des changements abrupts de la direction de croissance des hyphes, une croissance en boucle et une augmentation de la fréquence de branchement des hyphes. On note aussi une forte augmentation du nombre de vacuoles dans les cellules. Dans le mêmes système, lorsque l’on met le champignon en présence directe de PCN purifié, on observe les même altérations de croissance des hyphes, alors que ces altérations sont absentes dans les zones de rhizosphères exemptes de PCN.

Comme pour les autres phénazines, le méchanisme d’action du PCN n’est pas connu avec certitude. Mais les observations sur la distorsion de croissance pointent vers une action sur la croissance polarisée des hyphes. Puisque des courants électriques endogènes sont à la base de l’élongation et du branchement des hyphes, l’activité de transporteur d’électrons du PCN, pourrait affecter ces courants électriques endogènes et ainsi nuire à la croissance normale des hyphes (Bolwerk et al.2003).

La pyrrolnitrine (3-chloro-4-(2’-nitro-3’-chlorophenyl)-pyrrole) est un antibiotique à large spectre isolé pour la première fois dans les années soixante à partir de Pseudomonas pyrrocinia . Par la suite, ce composé a été isolé chez plusieurs autres espèces de bactéries incluant Myxococcus fluvus, Enterobacter agglomerans, Serratia sp., ainsi que plusieurs Pseudomonas et Burkholderia (el-Banna et al. 1998, Hammer et al. 1999). Ce métabolite très actif a également connu un usage médical pour le traitement des mycoses cutanées tandis qu’un dérivé de la molécule a été développé comme fongicide agricole (fludoixonil) (Hammer et al. 1997, McSpadden Gardener et al. 2002). La production de ce composé par P. fluorescens et B. cepacia est impliquée dans le contrôle de certains agents pathogènes racianires comme R. solani , V. dahliae, G. graminis et F. oxysporum (Homma et al. 1989, Howell and Stipatovic1979). Cet antibiotique est synthétisé via l’action de quatre gènes, prnA, prnB, prnC et prnD. Lorsque transférés à E. coli, ces gènes sont suffisants pour permettre la synthèse de pyrrolnitrine et codent pour quatre enzymes responsables des quatre étapes biochimiques menant à la synthèse du composé à partir du tryptophane (Hammer et al. 1999, Kirner et al. 1998). Cette voie métabolique est conservée entre P. fluorescens, B. cepacia ,P. pyrrocinia et M. fluvus. A l’exception de prnA chez M. fluvus , les séquences déduites d’acides aminés partagent une similarité de plus de 59%, ce qui indique que la voie de biosynthèse de la pyrrolnitrine est bien conservée au niveau biochimique (Hammer et al. 1999).

L’étude du gène prnD chez P. fluorescens, B. pyrrocinia, B. cepacia et M. fluvus , a permis de déceler une variabilité dans la séquence de ce gène entre les différentes souches (de Souza et al. 2003)

La pyolutéorine, un autre antibiotique produit par différents Pseudomonas , possède également un pouvoir fongitoxique efficace contre les oomycètes, notamment Pythium ultimun . Cette molécule, isolée pour la première chez P. aeruginosa , est composée d’un anneau résocrinol synthétisé par la voie de polycétide, relié à une partie pyrolle bichlorée (Nowak-Thompson et al. 1997, 1999). Les intermédiaires dans la voie biochimique de synthèse n’ont pas à ce jour été identifiés. Par contre, un regroupement génique de 21kb portant les gènes nécessaires à la production de PLT a été cloné chez la souche Pf-5 (Sarniguet et al.1995). La pyolutéorine est produite par plusieurs espèces de Pseudomonas mais son rôle dans la suppression d’agents phytopathogènes a été étudié surtout chez les souches de P. fluorescens CHA0 et Pf-5 qui produisent également le DAPG et la pyrrolnitrine. Chez ces souches, il semble que l’inactivation des gènes de production de PLT n’ait pas d’effet significatif sur le biocontrôle, puisque les mutant Plt- conservent leurs capacités d’inhibition (Sarniguet et al. 1995). L’absence de pyolutéorine est probablement compensée par la présence des deux autres antibiotiques. Pourtant, parmi ces 3 métabolites, la pyoluteorine s’avère la plus toxique envers P. ultimun. Une quantité de 10µg appliquée à la surface des graines de coton permet de les prémunir contre la fonte des semis (Bender et al. 1999).

La diversité génomique retrouvée chez les producteurs de DAPG ne semble pas être présente chez les producteurs de PLT. Une analyse RFLP d’un fragment du gène pltC avec 8 endonucléases différentes n’a révélée aucun polymorphisme pour ce gène (de Souza et al. 2003). Cela peut s’expliquer par le fait que la production de PLT semble être limitée à un groupe restreint de Pseudomonas qui montrent une très forte similitude génomique (Keel 1996 et al., McSpadden-Gardener et al. 2000, de Souza et al. 2003). En revanche, une souche produisant à la fois la pyolutéorine et le PCA a récemment été isolée (Ge et al. 2004). Cela pourrait fournir une nouvelle source de gènes de production de PLT et révéler des variations dans ces gènes.

La production de HCN par les Pseudomonas est impliquée dans la suppression d’agents pathogènes comme Thielaviopsis basicola , Septoria tritici et Puccinia recondita (Ramette et al. 2003). Une corrélation positive existe entre la production de cyanure d’hydrogène et le poids des plants de concombre confrontés au flétrissement par P. ultimum. Le composé agit directement sur les cellules de l’agent pathogène en bloquant la cytochrome oxidase dans la chaîne respiratoire. Cependant, en plus d’une activité protectrice, le HCN peut également être nocif pour la plante. La différence entre biocontrôle et effet nocif serait probablement due à des différences dans les niveaux d’expression des gènes de production du HCN. Chez les procaryotes, la production de HCN semble confinée aux protéobactérie et elle a été mise en évidence chez plusieurs souches de Pseudomonas fluorescens .

Une fonction écologique de la synthèse de cyanure d’hydrogène a été mise en évidence chez la souche CHA0. Chez cette dernière, la production de HCN compte pour une grande partie du pouvoir inhibiteur envers Thievialopsis basicola (Laville et al. 1998). Au niveau de l’adaptation à la rhizosphère, la production d’HCN peut être avantageuse pour acquérir des nutriments. Par exemple, le HCN cause une augmentation de l’exudation de nutriments par les tissus de la plante (Ellis et al. 2000). Il peut aussi contribuer à l’acquisition de certains ions métalliques en formant des complexes avec ceux-ci (Blummer et al. 2000). De plus, en culture in vitro , la production de HCN peut même inhiber la croissance de plusieurs champignons phytopathogènes via la phase gazeuse (Blummer et al. 2000).

La HCN synthase est une flavoprotéine membranaire qui catalyse la formation de cyanure d’hydrogène et de CO2 à partir de la glycine. Cette enzyme est codée par trois gènes structuraux ( hcnA, hcnB, hcnC ) séquencés chez P. aeruginosa PAO1 et chez P. fluorescens CHAO (Ramette et al. 2003). Les différents isolats de Pseudomonas producteurs de HCN présentent dans les gènes hcnB et hcnC une variabilité permettant de les classer en différents groupes. Cette variabilité génétique se traduit également en une variabilité au niveau des acides aminés. L’analyse d’un fragment de 130 résidus de HcnC a permis de définir quatre groupes phylogénétiques différents (hcn1, hcn2, hcn3, hcn4) (Ramette et al. 2003). Dans le cas des souches produisant le HCN et le DAPG, ce classement s’est avéré en accord avec celui basé sur phlD (Ramette et al. 2001, Wang et al. 2001) et également sur le classement par empreintes génomiques obtenues par RAPD (Keel et al. 1996). L’évolution des gènes de synthèse de HCN se serait probablement faite en parallèle avec celle du génome. Il semble que la distribution de ces groupes soit cosmopolite car, pour chaque plante ou localisation étudiée, au moins deux groupes sont présents et chaque groupe a été retrouvé pour au moins 3 plantes différentes dans trois régions différentes. La seule exception est pour les membres du groupe hcn3 qui ont été retrouvés seulement dans les rhizosphères de blé de l’état de Washington. L’appartenance à un groupe ou l’autre peut avoir une incidence sur le biocontrôle. En effet, les isolats classés dans hcn4 produisent beaucoup moins de HCN in vitro que les trois autres groupes et offrent également une moins grande protection. Par ailleurs, les groupes hcn1 et hcn3 fourniraient les isolats les plus efficaces pour protéger les racines et ce, dans touts les pathosystèmes étudiés (Ramette et al. 2003).

Dans le cas du DAPG , la biosynthèse est régulée par l’action du répresseur PhlF (Bangera et al. 1999, Schnider-Keel et al. 2000, Delaney et al. 2000). La surexpression de phlF cause une répression transcriptionnelle du groupement biosynthétique phlABCD , alors que son inactivation engendre une expression plus élevée et une plus grande synthèse de DAPG à faible densité cellulaire (Schnider-Keel et al. 2000, Delany et al. 2000). La protéine PhlF intervient dans un système de boucle de régulation par rétroaction positive (Haas and Keel 2003). En effet, le signal permettant l’arrêt de la répression serait le DAPG lui-même qui interagirait avec PhlF pour empêcher la répression de la transcription (Schnider-Keel et al. 2000). D’autres composés secondaires, le PLT et le salicylate, peuvent également entrer en jeu pour offrir un contrôle négatif afin d’éviter une escalade de rétroaction positive. Chez la souche CHA0, la régulation positive par le DAPG peut être court-circuitée par certains microorganismes. L’acide fusarique produit par l’agent pathogène Fusarium oxysporum a pour effet de réprimer l’expression des gènes Phl et ainsi de diminuer la production de DAPG et l’activité antagoniste qui y est associée (Notz et al. 2002). Un mécanisme possible pour cette répression serait que l’acide fusarique augmente le pouvoir de liaison du complexe répresseur-promoteur (Duffy et al. 2003). De plus, au sein des diverses souches productrices de DAPG, seulement celles qui produisent également le Plt sont sensibles à l’action de l’acide fusarique (Duffy et al. 2003). Par contre l’amendement de zinc inhibe la production d’acide fusarique et restaure le pouvoir inhibiteur et la production de l’antibiotique (Duffy et a1. 1997). À l’inverse, certains composés fongiques peuvent stimuler la production de DAPG. Chez Pythium debaryanum, le thréalose agit comme signal positif et induit les gènes impliqués dans l’antagonisme (Gaballa et al. 1997).

Plusieurs bactéries régulent la transcription de certains gènes de façon globale, en réponse à l’augmentation de la densité cellulaire. C’est le cas des Pseudomonas, chez qui les gènes de l’opéron Phz sont soumis à ce type de régulation. Le mécanisme de détection du quorum se base sur la communication entre les cellules par la diffusion de petites molécules de signal : les N -acyl-homosérines lactones (AHL). Ce système de régulation est fréquemment basé sur une paire formée d’une AHL et d’un régulateur de transcription appartenant souvent à la famille des protéines de type LuxR. Ces dernières, une fois activées par une AHL, se fixent à un élément promoteur et peuvent ainsi activer la transcription des gènes cibles. Un tel système contrôle la synthèse des phénazines chez P. aureofaciens 30-84 et P. chlororapis PCL 1391. Dans leurs cas, la protéine de type LuxR, PhzR, est activée par une AHL produite par l’enzyme PhzI. De plus, chez ces deux souches les autres produits extracellulaires comme le HCN ou les exoprotéases ne sont pas sujets au contrôle par PhzR/PhzI, ce qui suggère que ce système de régulation soit spécifique à cette voie métabolique (Haas and Keel 2003). Le système de détection du quorum permet donc aux bactéries d’avoir atteint un certain seuil de population avant de déclencher la synthèses d’antibiotiques. Ainsi, les antibiotiques sont produits au moment où ils seront efficaces, c’est à dire lorsqu’il y aura suffisamment de cellules (dans une microcolonie par exemple) pour en produire en quantité inhibitrice.

Plusieurs rhizobactéries du genre Pseudomonas ont la capacité d’induire une résistance systémique chez la plante, ce qui engendre une protection contre un grand nombre d’agents pathogènes fongiques et bactériens. Parmi les facteurs déterminants pour l’induction de la résistance systémique par les Pseudomonas , on remarque les lipopolysaccharides, les sidérophores et l’acide salicilique (van Loon et al. 1998). Dans le cas des lipopolysaccharides (LPS) de P. fluorescens , tant les cellules mortes que les LPS purifiés sont en mesure d’induire les réactions de défense permettant de protéger les plants d’oeuillet du flétrissement fusarien (van Loon et al. 1998). Les sidérophores, semblent être surtout importants dans des conditions limitantes en fer. Également, un souche productrice d’antibiotiques ( P. fluorescens CHA0) s’est avérée capable d’induire une résistance systémique envers Peronospora parasitica chez Arabidopsis thaliana (Iavicoli et al. 2003). Plus encore, la production de DAPG par P. fluorescens CHA0 semble être impliquée dans l’induction de cette résistance systémique. En effet, lors de la confrontation entre P. parasitica et A. thaliana colonisée par différents mutants de CHA0 chacun déficient dans la production soit de HCN, DAPG, pyolutéorine, exoprothéases et sidérophores, seulement les mutations interférant dans la production de DAPG menaient à une baisse significative de la résistance systémique induite.

L’introduction de souches de Pseudomonas comme agents de biocontrôle peut avoir des effets sur la communauté de microorganismes indigènes. Deux approches ont été utilisées : l’étude de l’impact sur des espèces spécifiques (espèces bénéfiques et symbiotiques) et l’évaluation de l’impact sur la population microbienne totale (Walsh et al. 2001). Dans le premier cas, une grande attention a été portée aux champignons mycorrhiziens qui forment d’importantes associations symbiotiques avec les plantes. Heureusement, plusieurs études ont démontré qu’une souche productrice de DAPG (F113) de même que des mutants surproducteurs ne causent pas d’interférence avec les symbioses entre Glomus mosseae et Lycopersicon esculentum . De plus, il semblerait que ces souches puissent même avoir un effet stimulateur sur le développement mycélien de G. mossea ainsi que sur la germination des spores (Barea et al. 1998). Cette stimulation ne serait pas reliée à la production de DAPG, car un mutant non producteur produit le même effet stimulateur.

On note également que l’introduction d’une souche productrice de DAPG (F113) dans la rhizosphère de bettrave à sucre cause un changement dans la population de Pseudomonas fluorescens indigènes. Ce changement se traduit par une augmentation de la population capable d’assimiler le tryptophane, l’érythritol et l’adonitol, alors que ces trois composés ne sont pas assimilés par l’inoculant. Plus encore, ce changement se fait seulement au niveau du rhizoplane et n’affecte pas les proportions relatives des différents groupes phylogénétique (Moënne-Loccoz et al. 2002). D’autre part, l’effet de l’introduction des souches de Pseudomonas putida modifiés pour produire le PCA et le DAPG a été étudié dans le cas de la microflore du blé (Bakker et al. 2002, Viebahn et al. 2003, Glandorf et al. 2002). Après deux années d’introduction successives, il s’est avéré que les trois souches n’ont aucun effet majeur sur le nombre de bactéries et champignons cultivables. Mais cette introduction produit un changement temporaire dans la composition de la communauté de champignons.

Dans une autre étude, l’introduction de la souche CHA0 et d’un mutant surproducteur d’antibiotiques dans la rhizosphère de haricot a causé une altération dans la communauté fongique. Par contre, une autre souche mutante ne produisant pas d’antibiotiques n’a pas produit ce genre d’altération (Shaukat et al. 2003, Girlanda et al. 2001). L’ensemencement du sol avec P. fluorescens CHA0 a causé un changement marqué dans la composition de la communauté de champignons cultivables, alors qu’un mutant non producteur ne causa aucun effet, même après plusieurs cycles de croissance.

La rhizosphère représente assurément un puits de diversité microbienne. Dans cet environnement, les interactions plante-microorganismes sont nombreuses et complexes. Plusieurs bactéries commensales se développent sans incidence sur la croissance de la plante, d’autres par contre ont la capacité d’en promouvoir le développement. Cela peut se faire via la production de phytohormones agissant sur la régulation de la croissance, mais aussi en limitant la croissance d’organismes néfastes, par le relâchement de molécules antagonistes.

Ces bactéries qui colonisent la surface des racines et les espaces intercellulaires dépendent en bonne partie des nutriments fournis par les exudats racinaires et leur survie peut dépendre de leur capacité à coloniser les racines et à s’accaparer cette manne de nutriments. Par contre, d’autres microorganismes ne se limitent pas à une croissance saprophyte mais vont plutôt infecter les racines et ainsi causer leur pourriture et la mort de la plante. Ces agents pathogènes causent d’importants dommages lors de la production de végétaux tant en milieu agricole que forestier. Traditionnellement, les méthodes de lutte contre ces pathogènes telluriques se sont basées sur l’utilisation abondante de fongicides chimiques et d’agents fumigeants. Par contre cette approche de lutte chimique n’est plus acceptable en raison de ses effets néfastes sur l’environnement et la santé humaine. Il est donc nécessaire de trouver une alternative biologique pour contrer les problèmes de maladies racinaires.

La connaissance des mécanismes par lesquels les rhizobactéries peuvent protéger les racines nous permet maintenant d’utiliser ces bactéries dans des programmes de luttes biologiques. Parmi les différents mécanismes impliqués dans la protection des racines, l’antibiose apparaît comme un des plus important et des plus étudié. La connaissance des gènes impliqués dans la synthèse de ces antibiotiques nous permet alors de cribler les populations de rhizobactéries productrices d’antibiotiques et d’isoler rapidement de potentiels agents de biocontrôle. A ce titre, les rhizobactéries de genre Pseudomonas s’avèrent très prometteuses car, en plus d’êtres présents dans les rhizosphères de toutes les plantes cultivées, elles colonisent activement ces dernières et produisent une large gamme de composés antifongiques.

Des souches de Pseudomonas provenant de partout à travers le monde ont maintes fois démontré leur capacité à inhiber plusieurs pathogènes fongiques chez une variété d’espèces agricoles. Certaines on même réussi à parcourir la route menant à la commercialisation. Parmi celles-ci nous pouvons citer en exemple des produits comme le Cedomon®, à base d’une formulation de P. chlororaphis , utilisé pour protéger les semences de blé et d’autres céréales contre une large gamme d’agents pathogènes du sol. Cependant, peu d’études ont porté sur l’écologie et la diversité de ces Pseudomonas producteurs d’antibiotiques dans les rhizosphères de conifères. Il est donc important de sonder cet environnement pour trouver des souches pouvant agir comme agents de biocontrôle qui seraient adaptées aux rhizosphères de conifères. Ainsi, la production des dizaines de millions de semis voués au reboisement pourra se faire plus efficacement et en réduisant l’usage de pesticides chimiques.

Bakker, P. A., D. C. Glandorf, M. Viebahn, T. W. Ouwens, E. Smit, P. Leeflang, K. Wernars, L. S. Thomashow, J. E. Thomas-Oates, and L. C. van Loon. 2002. Effects of Pseudomonas putida modified to produce phenazine-1-carboxylic acid and 2,4-diacetylphloroglucinol on the microflora of field grown wheat. Antonie Van Leeuwenhoek 81:617-624.

Bangera, M. G., and L. S. Thomashow. 1996. Characterization of a genomic locus required for synthesis of the antibiotic 2,4-diacetylphloroglucinol by the biological control agent Pseudomonas fluorescens Q2-87. Mol. Plant Microbe Interact. 9:83-90.

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© Mathieu Allaire, 2005