Entête

Conclusion générale

Les études antérieures ont démontré les propriétés immunomodulatrices des probiotiques sans pour autant parvenir à élucider clairement tous les mécanismes impliqués dans les effets observés. Le présent travail a pour objectif principal d’étudier le potentiel immunomodulateur de certaines souches de bifidobactéries en déterminant in vitro et ex vivo l’effet de leurs composants endo et exocellulaires sur les paramètres immunologiques indicateurs de la réponse immunitaire spécifique chez la souris. Les résultats obtenus démontrent que les composants cellulaires des bifidobactéries lysées exercent un effet immunostimulant significatif sur les splénocytes de souris. En effet, la paroi cellulaire et le contenu cytoplasmique des bifidobactéries stimulent la prolifération des lymphocytes et augmentent la production de deux cytokines, IFN-γ et IL-10, jouant un rôle clé dans les mécanismes de l’immunomodulation. Cependant, les effets observés dépendaient de la souche ou espèce de bifidobactérie, du composant cellulaire et de la dose utilisée. La souche B. lactis Bb12 s’est avérée potentiellement mitogène.

Les EPS produits par les bifidobactéries dans le milieu de culture n’induisent pas d’effets stimulants significatifs sur la réponse immunitaire. Les EPS ont été extraits et purifiés par une méthode conventionnelle impliquant une précipitation des macromolécules à l'aide d'un solvant organique, une précipitation des protéines avec le TCA, une purification par la dialyse et une lyophilisation. Cette méthode d’extraction et de purification semble affecter la nature et l’activité mitogénique des EPS produits. Il serait donc intéressant d’utiliser d’autres méthodes comme la technique d’ultrafiltration permettant de préserver l’activité biologique des EPS.

L’étude comparative des fractions peptidiques et protéiques du cytoplasme B. lactis Bb12 a mis en évidence la présence de peptides et de protéines de nature acide et basique, de faible hydrophobicité et de poids moléculaire très variable. Les peptides acides stimulent significativement la prolifération des splénocytes et induisent la sécrétion de IFN-γ et IL-4 impliqués dans les mécanismes de la stimulation de la réponse immunitaire. Cependant, la présence d’éventuels oligonucléotides dans les fractions peptidiques/protéiques acides et basiques brutes obtenues à partir du cytoplasme de B. lactis Bb12 n’a pas été vérifiée. Il serait donc intéressant de déterminer à l’avenir la teneur de ces composants intracytolplasmiques et leurs effets sur la réponse immunitaire.

En outre, la méthode de fractionnement par RP-HPLC n’a pas permis d’obtenir des fractions peptidiques et protéiques pures, ceci pourrait s’expliquer par la faible hydrophobicité montrée par les peptides et les protéines du cytoplasme des bifidobactéries. Il serait donc plus judicieux d’employer une autre méthode de fractionnement comme la chromatographie d’échange d’ions pouvant améliorer la séparation des peptides et des protéines intra cytoplasmiques. Par ailleurs, la quantité de matériel (peptides et protéines) obtenue à partir du cytoplasme est très limitée, ceci nécessiterait alors une production maximale de biomasse bactérienne dans des conditions de culture optimales.

Dans cette étude, nous avions utilisé deux méthodes de mesure de la prolifération cellulaire différentes par leur principe. La méthode basée sur l’incorporation du BrdU dans l’ADN des cellules immunitaires est longue et nécessite un test ELISA. Par contre, la technique à Alamar Blue, basée sur la coloration de cet indicateur en présence d’un métabolisme cellulaire (potentiel d’oxydoréduction), est plus rapide, simple et génère moins de variabilité dans les résultats.

Les résultats de cette étude laissent suggérer que les cellules bactériennes viables ne sont pas nécessairement requises pour influencer le système immunitaire de l’hôte. Ceci laisserait penser que les composants cellulaires (surtout la paroi) issus de l’autolyse des bifidobactéries ou de la lyse enzymatique ou acide dans le milieu gastro-intestinal, peuvent donc stimuler la réponse immunitaire. Par ailleurs, l’utilisation de cellules non viables offre plus d’avantages en permettant une longue durée de vie ou de stockage des produits probiotiques à potentiel immunomodulateur.

Compte tenu de la complexité de la composition de la paroi cellulaire et du cytoplasme des bifidobactéries, il serait fort intéressant d’envisager d’autres études afin d’identifier d’autres agents responsables de l’immunomodulation, particulièrement les molécules favorisant l’activité des cellules T régulatrices. La compréhension de ces fonctions immunomodulatrices offrirait certainement une opportunité unique pour prévenir ou traiter les désordres intestinaux associés aux allergies et aux maladies de l’inflammation de l’intestin et auto-immunes. Ainsi, les bactéries probiotiques pourraient être utilisées comme suppléments nutritionnels destinés aux personnes âgées ou aux nouveau-nés, dont la fonction immunitaire est réduite. L’utilisation des probiotiques comme ingrédients dans les aliments fonctionnels nécessiterait cependant des études cliniques. Etant donné que les bifidobactéries et les bactéries lactiques appartiennent à la flore naturelle habitant l’intestin de l’homme sain, et qu’elles sont déjà utilisées avec innocuité dans les aliments depuis longtemps partout dans le monde, il serait donc convenu d’utiliser les bifidobactéries comme probiotiques ou agents immunomodulateurs sous forme de nutraceutiques pour la prévention et le traitement des maladies médiées par le système immunitaire.

Comme la viabilité des souches probiotiques est requise pour obtenir d’autres effets bénéfiques sur la santé comme la prévention ou le traitement des infections intestinales (compétition d’exculsion), la réduction du taux de cholestrol, la digestion du lactose, la production de vitamines, nous avions aussi songé à développer dans ce projet des anticorps monoclonaux spécifiques aux bifidobactéries afin de détecter à l’état viable les espèces appartenant à ce genre bactérien dans les produits probiotiques. Pour cela, nous avions mis à profit l’immunogénicité de la paroi des bifidobactéries pour produire des anticorps dirigés contre leurs protéines de surface. L’analyse du profil protéique de la paroi de plusieurs espèces de bifidobactérie nous a révélé des protéines communes (poids moléculaire: 34 à 58 kDa) et des différences entre les espèces étudiées. Les protéines de la paroi se sont avérées immunogènes chez les souris Balb/c (immunisées) en générant une forte production d’anticorps polyclonaux.

Un anticorps monoclonal dirigé contre les protéines de la paroi de B. longum ATCC 15708 a été produit avec succès. Cet anticorps est caractérisé par sa réactivité croisée avec les autres espèces de bifidobactéries testées ( B. breve, B. infantis , B. bifidum , B. pseudolongum et B. animalis) . L’anticorps montre une réaction croisée avec une souche de L. rhamnosus qui semble avoir une similitude antigénique avec les bifidobactéries. L’antigénicité partagée chez les bifidobactéries a par ailleurs été confirmée par la méthode western blot qui a révélé un épitope commun supporté par une protéine de poids moléculaire de 58 kDa. La fixation de l’anticorps sur la paroi (protéines) de bifidobactéries a été observée au microscope électronique. L’anticorps développé est capable de détecter les bifidobactéries de facon non spécifique puisqu’il reconnaît aussi les lactobacilles. Il serait donc judicieux de rechercher un autre anticorps de haute spécificité pour les bifidobactéries. Néanmoins, l’anticorps ainsi obtenu s’est montré sensible (105 cfu/ml).

Par ailleurs, l’anticorps produit a permis de développer un test immunologique de détection des bifidobactéries. Comparé aux autres méthodes existantes, ce test présente l’avantage de détecter des bifidobactéries vivantes lorsqu’il est combiné avec la culture bactérienne sur plaque (immuno-culture). Ces résultats laissent suggérer une possibilité d’utilisation de cet anticorps comme outil moléculaire pour la détection ou l’identification des bifidobactéries vivantes dans les aliments et les tissus. Néanmoins, l’anticorps produit devrait être testé sur des échantillons d’aliments fermentés supplémentés avec des bifidobactéries afin de rendre possible l’utilisation du test à l’échelle industrielle.

© Tahar Amrouche, 2005