Entête

Les bifidobactéries sont des bactéries probiotiques exerçant différents effets bénéfiques sur la santé de l’hôte. Parmi les effets revendiqués, la modulation des différentes fonctions immunitaires demeure l’un des effets les plus intéressants. Plusieurs travaux sont rapportés dans la littérature sur les effets immunomodulateurs de certaines souches probiotiques. Cependant, les résultats sont parfois controversés et les mécanismes impliqués dans cet effet immunomodulateur sont encore très peu élucidés. Le but de ce projet est d’évaluer le potentiel immunomodulateur de certaines souches de bifidobactéries isolées à partir de fèces de bébé, et d’identifier les mécanismes moléculaires par lesquels ces bifidobactéries exercent leurs effets sur les différentes fonctions immunitaires. Trois souches de bifidobactéries d’origine fécale productrices d’exopolysaccharides ( B. thermoacidophilum RBL81, RBL82 et RBL64), une souche de Bifidobacterium lactis Bb12 et des souches ATCC ( B. animalis, B. breve, B. longum , B. infantis , B. bifidum et B. pseudolongum) ont été utilisées. Les résultats obtenus montrent que la paroi cellulaire induit la plus forte stimulation de la prolifération cellulaire (splénocytes), accompagnée d’une forte production de IFN-γ et d’une augmentation de la sécrétion de IL-10. Une stimulation des fonctions immunitaires a également été observée avec le contenu cytoplasmique mais à un niveau moindre par rapport à la paroi. Par contre, les exopolysaccharides bruts ou fractionnés n’ont induit aucun effet. Une étude plus approfondie utilisant B. lactis Bb12 comme modèle a démontré que l’activité immunomodulatrice du contenu cytoplasmique est associée à la présence de peptides et/ou protéines acides, de poids moléculaire très variable et de faible hydrophobicité. Par ailleurs, le pouvoir immunogène de la paroi de bifidobactéries a été mise à profit pour produire des anticorps monoclonaux spécifiques capables de détecter les espèces du genre B ifidobacterium . Ces anticorps semblent être spécifiques à une protéine majeure d’environ 58 kDa de poids moléculaire (PM) commune à plusieurs bifidobactéries. Une fois purifiés, ces anticorps ont été utilisés pour développer un test d’immuno-culture original permettant la détection spécifique et sensible des bifidobactéries.

Les bifidobactéries sont des bactéries candidates potentielles aux probiotiques à cause de leurs effets bénéfiques sur la santé de l’homme incluant la prévention et/ou traitement des gastro-entérites, intolérance au lactose, cancer, hypercholestérolémie, etc. Une des propriétés intéressantes des bifidobactéries est leur capacité à moduler certaines fonctions du système immunitaire et remédier à certaines pathologies immunologiques. Cependant, les études rapportées démontrant les effets immunomodulateurs des probiotiques sont basées sur des modèles utilisant des cellules bactériennes vivantes et limités à certaines souches probiotiques. L’effet des composants issus de la lyse cellulaire dans le tractus gastro-intestinal sur le système immunitaire demeure mal connu, d’où alors la nécessité d’élucider les mécanismes d’immunostimulation induits par ces derniers. Le but de ce projet est d’étudier le potentiel immunomodulateur de certaines souches de bifidobactérie isolées d’humains et utilisées à l’état non viable et d’explorer les mécanismes moléculaires impliqués dans cette action immunomodulatrice. Notre étude visait d’une part, à évaluer les effets de certains composants cellulaires de bifidobactérie notamment le contenu cytoplasmique brut, la paroi cellulaire, et les exopolysaccharides (EPS) sur la réponse immunitaire, et d’autre part, caractériser à l’échelle moléculaire les composants à pouvoir immunomodulateur et exploiter leur propriété pour produire des anticorps monoclonaux permettant de détecter spécifiquement les bifidobactéries dans les aliments. Trois souches locales de bifidobactéries, B. thermoacidophilum RBL81, RBL82 et RBL64 (fèces de bébés) productrices d’EPS ont été étudiées et comparées au Bifidobacterium lactis Bb12 (souche de référence). Des souches ATCC de bifidobactéries ont également été utilisées pour développer des anticorps monoclonaux.

Les résultats obtenus montrent des effets immunostimulants dépendant de la souche/espèce, du composant cellulaire et de la dose utilisée. Une meilleure stimulation de la prolifération cellulaire (Indice de stimulation =16) est obtenue avec la paroi cellulaire de B. lactis Bb12 (40 µg/ml). Le contenu cytoplasmique stimule la réponse immunitaire à un niveau moindre que la paroi, par contre, les EPS bruts ou fractionnés n’induisent aucun effet. La stimulation de la prolifération à été confirmée par le dosage des cytokines révélant une forte production de IFN-γ (> 4 µg/ml) générée par la paroi cellulaire, et une stimulation de la sécrétion de IL-10 dans le milieu (< 1 µg/ml). Par ailleurs, les résultats obtenus démontrent que l’effet immunostimulant induit par le cytoplasme de B. lactis Bb12 est associé aux fractions peptidiques et/ou protéiques intracytoplasmiques, notamment les fractions acides. Les peptides et les protéines immunostimulants sont de poids moléculaire très variable et de caractère moins hydrophobe. Toutefois, des études in vivo et cliniques devraient être réalisées afin de valider ces résultats et laisser envisager une perspective d’utilisation des bifidobactéries à l’état de lysats cellulaires comme agents immunomodulateurs commercialisables sous forme de nutraceutiques.

Il était prévu dans ce projet de mettre à profit les propriétés immuno-actives des bifidobactéries pour produire des anticorps monoclonaux spécifiques aux bifidobactéries. Par cette approche, nous voulions aborder une problématique liée à l’utilisation des bifidobactéries comme probiotiques vivants dans les produits alimentaires et se résumant en la difficulté de détecter les souches de bifidobactéries vivantes dans ces produits. Cette partie du projet a pour objectif de produire et caractériser des anticorps monoclonaux dirigés contre les protéines de paroi (antigène de surface) de bifidobactéries en vue de mettre au point des tests immunologiques combinés à la culture bactérienne (en plaque) permettant la détection spécifique et sensible des bifidobactéries vivantes dans les aliments. L’analyse du profil protéique des parois (SDS-PAGE) de six espèces différentes de bifidobactérie ( B. animalis, B. breve, B. longum , B. infantis , B. bifidum et B. pseudolongum) a révélé des bandes différentes et des bandes similaires (PM: 34 à 58 kDa) (protéines communes probables).

Testées pour leur immunogénicité chez des souris Balb/c, une forte production d’anticorps polyclonaux a été mise en évidence (test ELISA) chez les souris immunisées avec les protéines de B. bifidum et B. longum (titre en anticorps de 53333). Ces deux souris ont alors été sélectionnées pour la fusion cellulaire et la production d’anticorps monoclonaux. Les anticorps (IgG) anti- B. longum produits ont montré une réactivité croisée avec l’ensemble des espèces de bifidobactérie testées indiquant une antigénécité partagée entre les espèces de bifidobactéries. En effet, un épitope commun porté par une protéine de 58 kDa (PM) a été révélé par une analyse de type "western-blot".

De plus, une analyse en ELISA directe a permis de confirmer la spécificité des anticorps produits puisque le test s’est révélé négatif avec d’autres souches non apparentées aux bifidobactéries. La fixation de l’anticorps sur les bifidobactéries a été observée au microscope électronique après un traitement immunochimique. La sensibilité de l’anticorps a été estimée par ELISA à 105 cfu/ml. La détection des cellules viables de bifidobactéries par l’anticorps produit a été par ailleurs démontrée par le test d’immuno-culture. Toutefois, les résultats de ce test devraient être validés sur des produits probiotiques (yogourt, lait fermenté, etc) afin de rendre le test utilisable à l’échelle industrielle.

Mots clés : Nutraceutiques, probiotiques, Bifidobactéries, système immunitaire, immunomodulation, prolifération cellulaire, Cytokines, Cytoplasme, Exopolysaccharides, Paroi cellulaire, Anticorps. 

Probiotic bifidobacteria are known to have beneficial effects on host health. One of the interesting properties of these bacteria is their capacity to modulate the host immune function. However, the mechanisms by which the bifidobacteria influence the immune response are not well known. This project aimed to evaluate the immunodulatory potential of some bifidobacterial strains isolated from newborn feces. We tried to determine the cellular and molecular mechanisms involved in immune response induced by cytoplasmic content, cell wall and exopolysaccharides from bifidobacteria. Three exopolysaccharide-producing fecal strains of bifidobacteria ( B. thermoacidophilum RBL81, RBL82, and RBL64) and a commercial available strain ( Bifidobacterium lactis Bb12) were tested using mouse splenocytes. The results demonstrate that a high stimulation of cell proliferation and interferon-gamma (IFN-γ) production were induced by cell wall. In addition, a concomitant stimulation of interleukin-10 (IL-10) secretion was observed. The cytoplasmic content was also shown to be immunostimulating, but less than cell wall. However, the effects observed were dose or strain-species-dependent. B. lactis Bb12 was found to be significantly more immunostimulating than other bifidobacterial strains used. Partially fractionated peptides and acidic fraction from B. lactis Bb12 showed a low hydrophobicity and appeared heat stable and mitogenic. In contrast, no immunostimulating effects were induced by exopolysaccharides. The mitogenic properties of cell wall protein were then explored to develop specific monoclonal antibodies (Mab) able to detect bifidobacteria species in food. Common proteins were revealed in cell wall extracts from bifidobacteria ( B. animalis, B. breve, B. longum , B. infantis , B. bifidum et B. pseudolongum). The proteins obtained were found to be immunonogenic in Balb/c mouse. Monoclonal antibodies (IgG) -anti- B. longum - produced cross-reacted with all bifidobacteria tested. The shared antigenicity shown by bifidobacteria was revealed by an epitope supported by a common protein of 58 kDa. This was confirmed by immune-transmission electron microscopy observation, which showed the specific interaction of these antibodies with bifidobacterial cell wall proteins. The Mab produced was also shown to be sensitive (105 cfu/ml) and specific to members of the bifidobacterial genus. The Mab developed allowed detection of viable cells of bifidobacteria using immuno-culture test.

Key words: Antibodies, bifidobacteria, cell proliferation, cell wall, cytokines, cytoplasm, exopolysaccharides, immunomodulation, immune system, nutraceutics.  

Bifidubaktiri d iprubyuteken (probiotiques) i yetwassnen atas assagi, yeεni ţ-ţibaktiryin mara twarnunt i tgulliyin ţţakent ayen yelhan i tdawsa. Tibaktiriyin agi zemrent ad snernint kra n tsuγnin yeţhuddun γef tfekka mgal atanan n uεebbud d izerman n bnadem. D acu kan, ar assa, ur nessin ara amek tibaktiriyin stanent tafekka. Iswi n usenfar agi d anelmud n unezmar n usnerni n ustan n bifidubaktiri. Ayagi i wakken a d-naf isemduyen n kra n tsegrin n tsiluliyin (cellules) am iferdisen (éléments) yellan daxel, s-ufella neγ i d-deggirent ar berra γef tririt n uhuddu. Krad (3) n ccetlat n bifidubaktiri id-yekkan seg izerman llufan ţwalmendent ţwasdemrent ar yiwet n ccetla tamselγut Bifidobacterium lactis Bb12. Agmuden i d-nessufeγ qqaren-d d akken asnerni yelhan n ufadi n tsiluliyin n udihan (rate) n amumad, i d- yettabaε unerni amuqran n IFN-γ yakw d usennerni n usufeγ (sécrétion) n IL-10, yefkaten-id ulesi n tsilulit (paroi cellulaire). Ayen yellan daxel n tsilulit d tazunin-ines (ipeptidiyen yak tiprutiniyin) snernayent drus γef ulesi. Ma d ayen yεenan EPS (exopolysaccharides) ulac asnnerni i d-yekkan segsen. Ma d tiprutiniyin n ulesi n bifidubakiri ( B. animalis, B. breve, B. longum , B. infantis , B. bifidum et B. pseudolongum) banent-ed d timesnerniyin timuqranin n uhareb γef tfekka n umumad (Balb/c) ssutuyent afares amuqran n tfekkamgalin. Tifekkamgalin i d-yeffγen d yiwet n txellalt (IgG) mgal B. longum ţwafursent-ed s trennawet u sknent-ed tasedmirt tanmidagt (réaction croisée) yakw d ccetlat nniden n bifidubakiri. Anecta yekka-d seg yiwet n teprutint (protéine) tamsihart i yezzayen 58 kd. Tulmist n tfekkamgalin i d-yefursen yeţwasentem-ed s usadez (test) ibaw i d- yelummzen mi ţ-nerεed yakkw d cctali nniden n tbaktiriyin. Tufin n bifidubaktiri yeddren s tfekkamgalin i d-yedran yefursen yedra-d s usadez n immuno-culture. Tifekkamgalin tulmisin i-d yekkan seg yiwet n txellayt id-nessenfel zemrent ad ţwaqedcent i tifin n cctali n bfidobktiri di tgwellyin.

Awalen n tsurra : Nutraceutiques, iprubyutiken, bifidubaktiri, anagraw amhaddan, asnerni uhuddu, afadi n tsiluliyin, cytokines, cytoplasme, exopolysaccharides, alessi n tsilulit, tafekkamgalt.

La présente thèse est le fruit d’un travail de longue halène accompli en quatre années. Elle porte sur un sujet d’actualité traitant principalement des probiotiques et de la modulation de la fonction immunitaire. Ce sujet relève de l’interface entre la microbiologie et l’immunologie et ouvre des perspectives prometteuses dans le domaine de la bactériothérapie. La réalisation de ce projet de doctorat m’a permis de relever un défi en découvrant cette nouvelle interface aussi passionnante que complexe. Cette thèse comporte trois articles scientifiques, dont je suis l’auteur principal, rédigés en anglais et précédés chacun par un résumé en français, et une revue de littérature écrite en français.

L’introduction et le Chapitre I, intitulé « Revue de littérature », présentent la problématique de recherche et font état des connaissances actuelles sur les probiotiques, les prébiotiques et les symbiotiques. L’effet des probiotiques sur la modulation de la fonction immunitaire constitue l’essentiel de cette revue et est introduit comme une propriété prometteuse pour l’utilisation des probiotiques, puisque cette propriété ne semble pas être nécessairement liée à la viabilité des probiotiques. Les travaux rapportés dans la littérature sont discutés et leur analyse m’a permis de cerner la problématique, de poser l’hypothèse et de définir les objectifs de recherche à réaliser.

Le Chapitre II, intitulé « Effects of bifidobacterial cytoplasm, cell wall and exopolysaccharides on mouse lymphocyte proliferation and cytokine production", constitue la première étape de mes travaux. Dans ce chapitre, sont étudiées les propriétés immunomodulatrices des composants cellulaires de bifidobactéries. J’avais effectué mes travaux expérimentaux à l’Université Laval et, en partie, au CEGEP Lévis Lauzon (Qc) sous la supervision du Dr Ismail Fliss et Dr Yvan Boutin respectivement. Guénolée Prioult avait contribué aux tests de prolifération lymphocytaire et à l’analyse des cytokines. Ce chapitre présente intégralement le contenu d’un article scientifique (en anglais) qui est sous presse à : International Dairy Journal.

Le Chapitre III, portant le titre « Effects of bifidobacterial cytoplasm peptide and protein fractions on mouse lymphocyte proliferation and cytokine production », est consacré à l’étude de certains composants intra cytoplasmiques responsables de l’effet immunomodulateur induit par une souche de bifidobactérie ayant montré des propriétés immunostimulantes potentielles dans le chapitre II. Nous avions donc étudié l’effet des fractions peptidiques et protéiques extraites du cytoplasme de B. lactis Bb12 sur la prolifération des lymphocytes et la sécrétion de cytokines. J’ai accompli tous mes travaux expérimentaux à l’Université Laval aux laboratoires du Dr Ismail Fliss, du Dr Sylvie Gauthier et du Dr Julie Jean et au laboratoire d’analyse instrumentale. Dr Najat Attouri avait contribué aux essais de prolifération lymphocytaire, alors que Alain Gaudreau a apporté sa contribution dans l’analyse et le fractionnement des peptides et protéines. Le présent chapitre fait objet d’un article à soumettre prochainement à International Dairy Journal.

Quant au Chapitre IV, intitulé «Production and characterization of anti-bifidobacteria monoclonal antibodies and their application in the development of an immuno-culture detection method» a été réalisé dans le but de développer des anticorps monoclonaux spécifiques capables de détecter des espèces de bifidobactéries viables par un test d’immuno-culture. La fusion cellulaire a été réalisée au laboratoire du Dr Yvan Boutin au CEGEP Lévis Lauzon (Qc). J’ai réalisé la production et la caractérisation des anticorps anti-bifidobactéries, ainsi que le test d’immuno-culture, au laboratoire du Dr Ismail Fliss à l’Université Laval. Olivier Moroni avait contribué à l’extraction des protéines pariétales, alors que Dr Ehab Kheadr et Richard Janvier ont apporté leur contribution dans la réalisation des travaux de microscopie électronique. L’immunisation des souris et la collecte de sang ont été effectuées par Julie Brassard, Mélanie Alain et Vincent Leclerc à l’Université Laval. Le présent travail a eu le mérite du 3ème prix de meilleure présentation-affiche attribué par le comité d’évaluation lors du Symposium international de Montréal (La santé par les probiotiques-Applications dans ce troisième millénaire, 28 et 29 octobre 2004). Ce chapitre est présenté sous forme d’un article scientifique rédigé en anglais et accepté à la publication au Journal of Microbiological Methods.

Enfin, une Conclusion générale est présentée pour donner une vision globale de mes travaux de thèse de doctorat tout en mentionnant les conclusions les plus importantes qui en ressortent, et en soulignant leur impact et les perspectives d’avenir.

Le mérite de ce travail revient à toutes les personnes qui ont participé à sa réalisation et auxquelles d’ailleurs j’exprime ma profonde reconnaissance. La réussite de ce travail ne saurait être possible sans le grand apport de mon directeur Dr Ismail Fliss et de mon co-directeur Yvan Boutin. Je remercie Dr Ismail Fliss de m’avoir offert l’opportunité de réaliser ce projet au sein de son équipe, pour ses conseils précieux, ses orientations scientifiques, ainsi que son optimisme affiché malgré toutes les contraintes. Mes vifs remerciements s’adressent également au Dr Yvan Boutin pour son encadrement tant apprécié assuré pendant l’expérimentation et la rédaction de la thèse, sa rigueur scientifique, ses encouragements et ses conseils judicieux.

Je tiens à remercier FCAR, NOVALAIT, MAPAQ, NSERC et la banque mondiale pour leur support financier. Je voudrai remercier également Dr Sylvie Gauthier et Dr Julie Jean pour l’accès accordé à certains équipements de leurs laboratoires respectifs, pour les conversations scientifiques et leurs encouragements. J’adresse aussi mes remerciements au directeur du CEGEP Levis Lauzon de m’avoir bien accueilli au sein de son établissement, où une bonne partie de mes travaux expérimentaux a été réalisée. Je désire remercier Dr Gisèle Lapointe pour la pré lecture du manuscrit, ainsi que les membres du jury pour avoir examiné et jugé mon travail.

Mes remerciements vont aussi aux Dr Ehab Kheadr et Dr Nadjat Attouri pour leur disponibilité et leur contribution appréciable à ce projet. J’aimerai remercier énormément Julie Brassard, Mélanie Alain et Vincent Leclerc pour toute l’aide fournie au niveau de l’animalerie. J’exprime ma profonde gratitude à toute l’équipe de l’ADVITECH Solution pour l’esprit de coopération manifesté tout au long de ce projet. Je remercie tout particulièrement Josée Fortier, Lynda Labarre, Nicolas. Le personnel de la clinique des maladies d’allergie (Place de la Cité, Sainte-Foy, Québec) est également remercié pour les échantillons de sang de donneurs fournis pour nos expériences préliminaires.

Ce projet n’aurait pu être une réussite sans la contribution de plusieurs personnes parmi elles: Olivier Moroni, Guénolée Prioult, Alain Gaudreau, Richard Janvier, Claude Gosselin, Céline Paquin, Edith Tousignant, Anne-Françoise Allain, Myriam Roy (CEGEP Levis Lauzon), Arezki Djaout et Chem Chi. Que tout le personnel administratif du centre STELA, de l’INAF, du département ALN et de la faculté FSAA (Université Laval) ayant contribué directement ou indirectement à ce projet soit remercié.

Je n’oublierai évidemment pas de remercier toutes les personnes auxquelles revient le mérite de ma formation au Québec et ailleurs. Je remercie également toute ma famille pour son soutien moral à distance et tou(te)s mes ami(e)s avec lesquel(le)s j’ai partagé durant mon séjour au Québec des moments de loisir et d’humour agréables et des soirées inoubliables.

© Tahar Amrouche, 2005