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CHAPITRE 1 – Le virus d’immunodéficience humaine de type 1

Table des matières

Vers la fin des années ’70 et début ’80, on a diagnostiqué, chez un nombre croissant de patients souffrant de troubles immunitaires, une lymphadénopathie généralisée. Les médecins ont alors donné à cette pathologie le nom de SIDA, signifiant syndrome d’immunodéficience acquise. Ce syndrome était parfois accompagné d’infections opportunistes (pneumonies, encéphalites et de méningites) et de cancers plutôt rares pour l’époque tels que le lymphome non-Hodgkinien et le sarcome de Kaposi. L’atteinte physiologique principale observée chez ces patients était une diminution en lymphocytes T CD4+. Par ailleurs, ce syndrome cible principalement deux populations : les utilisateurs de drogues intraveineuses et les homosexuels. Quelques cas ont été associés aux transfusions sanguines et aux partenaires sexuels de patients immunosupprimés. Jusqu’alors, il demeurait envisageable que l’agent causal de cette infection soit un champignon, une réaction à un composé chimique ou même une réaction auto-immune. Cependant, la grande majorité des hypothèses ont mis en cause l’infection virale (85). Le profil épidémiologique de la propagation du syndrome suggérait l’émergence d’un nouveau pathogène. En 1983, des scientifiques de l’Institut Pasteur réussissent sa culture à partir de ganglions lymphatiques de patients souffrant des symptômes de lymphadénopathie généralisée. À ce pathogène isolé, ils ont alors donné le nom de LAV (Lymphadenopathy-associated virus). Après des analyses morphologiques et génétiques, ce nouveau virus a été classé dans la famille des Retroviridea et de genre lentivirus. On lui accorda le nom de virus d’immunodéficience humaine (VIH) quelques années plus tard le type 1 suivant la découverte du type 2.

La simple identification du pathogène et de ses voies de propagation a non seulement permis d’éliminer les cas de transmission par transfusions sanguines, mais également a permis la création d’un plan de prévention efficace. Aujourd’hui, de nombreux efforts sont investis dans le développement de vaccins et d’inhibiteurs, mais les infections par le VIH persistent. Une meilleure compréhension du cycle viral et de la réponse de l’hôte est essentielle.

Les travaux de recherches présentés dans cette thèse de doctorat ont comme principal sujet les interactions entre la cellule-hôte et le VIH durant l’incorporation de protéines étrangères. Par ailleurs, le rôle de l’ICAM-1, en surface du VIH, sur l’action du T-20 a été investigué et sera présenté dans ce document. À priori, il convient d’amener adéquatement notre problématique d’étude par l’introduction du cycle viral du VIH. L’introduction générale qui suivra traite donc des sujets les plus importants dans l’étude du cycle de vie du VIH. Les étapes d’assemblage, de bourgeonnement et de maturation du cycle du VIH seront plus détaillées afin de bien souligner le contexte par lequel l’incorporation de molécules d’origine cellulaire survient. La problématique et les objectifs de recherche ayant conduit aux principaux résultats seront également précisés. Les résultats obtenus au cours de ces recherches ont tous été publiés dans des revues scientifiques. Les textes de ces publications ont été insérés en différents chapitres comprenant tous les sections introduction, matériels et méthodes, résultats, discussions et références. La contribution de chacun des auteurs aux travaux présentés dans ces manuscrits est également précisée à la section « Contributions ». Une conclusion générale ainsi que quelques perspectives de recherches termineront enfin le document.

Le clonage et le séquençage de l’ADN proviral du VIH, purifié à partir de lymphocytes T infectés, ont permis de classer ce virus parmi les lentiviridae (231, 291). Les lentivirus sont connus pour causer de lentes et irrémédiables atteintes des lymphocytes et des macrophages différenciés chez la chèvre, le cheval et le bovin. D’autres lentivirus, génétiquement distincts, ont également été découverts et classés en fonction du VIH : le VIS (virus d’immunodéficience simienne), le visna virus, l’EIAV (equine infectious anemia virus) et le VIH-2. Contrairement à d’autres rétrovirus (le MuLV (Murine leukemia virus), l’ALV (Avian leukosis virus) et le HTLV (Human T-cell leukemia virus)) qui présentent tous une homogénéité génétique, l’ADN proviral du VIH-1, provenant d’isolats de l’Europe, de l’Amérique du Nord et de l’Afrique, ont été comparés et présentent tous une hétérogénéité de séquences (19, 247). La séquence la plus variable analysée correspond à l’env et plus particulièrement à cinq régions hypervariables (V1 à V5) distribuées parmi cinq régions conservées (C1 à C5) (271, 297). Des classifications phylogénétiques plus récentes d’isolats provenant d’Europe et de l’Amérique du Nord ont permis l’identification de plusieurs catégories de virus (« clades » M, O et N). La grande majorité de ces isolats appartiennent à la catégorie M (95%). Toutefois huit sous-catégories (A, B, C, D, F, G, H et J) ont été ajoutés afin d’en apporter une plus grande précision (1, 163, 191). Les isolats appartenant au groupe O ont été obtenus d’individus provenant du Cameroun, de la Guinée équatoriale et du Gabon. Ces isolats sont différents de ceux retrouvés dans le groupe M avec une faible identité de séquences (inférieure à 50%) (276). Le groupe N correspond à des isolats de VIH-1 récupérés de Camerounais dont leur contenu en virus est non-détectable par ELISA standard, l’immunobuvardage est utilisé dans ces situations problématiques (Figure 1) (261). La grande diversité génétique du VIH est en partie expliquée par un haut taux de recombinaison inter-virus. Notons qu’il s’agit d’une propriété importante des rétrovirus. Ces évènements de recombinaison ont été analysés comme des co-infections de plusieurs « clades » de VIH. Il n’est donc pas surprenant d’observer les plus hauts taux de recombinaison entre sous-catégories dans des régions du globe reconnues pour être fortement endémiques comme l’Afrique, l’Amérique du Sud et le sud de l’Asie (88). L’origine exacte du VIH demeure encore aujourd’hui controversée, de nouvelles études phylogénétiques devront ainsi être réalisées afin d’apporter les précisions manquantes.

Le VIH-1, tout comme les autres membres de la famille des Retroviridea, est caractérisé par quatre éléments distinctifs : I) une capside en forme de cône, II) une transcriptase inverse, III) une bicouche lipidique semblable à la membrane plasmique de la cellule-hôte et finalement, IV) une structure membrane/capside permissive à l’ancrage de protéines étrangères. La réplication des rétrovirus, comme celle de tout autres virus, nécessite l’infection d’une cellule et permet la production d’une grande quantité de particules virales matures. La structure de base du VIH provient de deux précurseurs poly-protéiques Gag et Gag/Pol. On dénombre environ 1500 à 2000 poly-protéines Gag par virion, alors que la poly-protéine Gag/Pol est incorporée à environ 150 à 200 copies (39, 42). Durant l’assemblage et une fois le bourgeonnement achevé, la protéase virale (Pol) s’auto-extrait du précurseur immature Gag/Pol (voir à la section -- Le cycle réplicatif du VIH-1 -- Maturation des virions) et clive à certains endroits stratégiques les poly-protéines Gag et Gag/Pol. Ce clivage forme les protéines structurales matures et quelques enzymes. Parmi ces enzymes, on compte la (MA), la capside (CA), la nucléocapside (NC), la protéine de liaison (p6), la transcriptase inverse (p66/51) et l’intégrase (p32) (Figure 2A) (140). L’ensemble des protéines codées par Gag sont conservées lors des étapes d’assemblage et de bourgeonnement. Ces constituants forment des particules virales présentant des concentrations équimolaires en MA, CA, NC et p6. La particule immature est sphérique. Elle possède une capside peu dense et une membrane fluide ressemblant aux vésicules de cellules humaines (Figure 2B). Au cours de la maturation, la morphologie de la particule virale évolue afin de former une structure beaucoup plus dense et icosaédrique d’environ 145 nm de diamètre. La forme de la capside virale et son diamètre sont hétérogènes (Figure 2C) (27, 99, 305).

L’ARN viral est fortement condensé par son association avec la NC. Le complexe ARN/NC est protégé par la capside virale (CA). La capside est ensuite recouverte de la MA, laissant un espacement suffisant à la fixation de protéines étrangères. Notons que la MA interagit avec la bicouche lipidique du virion. Cette couche de lipides, riche en cholestérols et en sphingolipides, maintient les glycoprotéines virales de surface gp120 (SU) et gp41 (TM) (102). Les protéines de l’enveloppe virale originent d’un même précurseur immature, la gp160. Une protéase cellulaire de type furine clive la gp160 pour former les deux glycoprotéines de l’enveloppe qui pourront par la suite former des trimères (un trimère de gp120 et un trimère de gp41). Le nombre de trimères de l’enveloppe incorporés par virion est faible (environ dix trimères par virus) (314). Les protéines ayant une activité enzymatique (RT et IN), à l’exception de la protéase, se retrouvent à l’intérieur de la capside virale.

Le séquençage du génome du VIH, de 9,2 Kb, a permis l’identification de deux protéines régulatrices (tat et rev) et plusieurs protéines accessoires (Vpu, Vpr, Vif et Nef) (Figure 3). Les fonctions de ces protéines accessoires et régulatrices sont de moduler le potentiel infectieux et la transcription du VIH (140). Le génome du VIH est flanqué en 5’ et en 3’ de régions longues et répétées portant le nom de LTR pour « long terminal repeat » qui sont synthétisées lors de la transcription inverse. Ces régions permettent, entre autre, l’intégration du génome virale dans celui de la cellule-hôte. L’expression des gènes viraux s’effectue à l’aide de la machinerie transcriptionnelle de la cellule et implique la formation de poly-cistrons. L’épissage alternatif de l’ARNm de 9 Kb en quatre principaux transcrits permet la production des protéines virales (229). Le premier transcrit produit est d’environ 2 Kb et sa synthèse mène à la formation des protéines régulatrices Tat, Nef et Rev. Le second et le troisième transcrits possèdent une longueur d’environ 4 Kb et conduisent à la production de Vpu, de gp160Env, de Vif et de Vpr. Les protéines accessoires Vif, Vpr et Vpu sont non-essentielles à la réplication chez certaines cellules T humaines, mais régulent à la hausse l’infectivité virale (140). Le quatrième transcrit est de 9 Kb et permet la production des poly-protéines Pr55Gag et Pr160Gag/Pol. Notons que d’autres combinaisons de transcrits sont également possibles, mais leur expression reste faible. Ces transcrits sont ensuite dirigés vers le cytoplasme afin d’être traduits en protéines (voir section Le cycle réplicatif du VIH-1 -- Expression et réplication des gènes viraux). Pour obtenir une propagation efficace de l’infection virale, l’épissage des transcrits viraux et leur transport dans le cytosol sont finement régulés. Ainsi, l’épissage alternatif des transcrits viraux joue un rôle essentiel dans la réplication virale

Pour entrer dans une cellule et initier sa réplication, un rétrovirus doit premièrement interagir avec un récepteur spécifique. Dans le cas du VIH, la protéine de l’enveloppe gp120 (SU) fixe l’antigène CD4 sur une cellule-cible. L’expression du CD4 est restreinte aux lymphocytes T auxiliaires et aux monocytes/macrophages qui sont les principales cibles du VIH. Les premières classification du VIH-1 ont tenu compte des types cellulaires ciblés. En effet, un virus infectant préférentiellement les lymphocytes T est qualifié de tropisme T alors qu’un virus infectant préférentiellement les monocytes/macrophages est qualifié de tropisme M. Les cellules T infectées présentent une régulation à la baisse de leur expression en CD4 (296).

Bien que le CD4 demeure le récepteur principal du VIH, il existe d’autres voies d’entrée. Par exemple, l’interaction d’un virus avec un anticorps permet le transport de ce virion à l’intérieur de la cellule. En effet, la portion Fc de l’anticorps peut interagir avec un récepteur Fc et permettre l’entrée du complexe anticorps/virus. Un autre processus pouvant contribuer à l’attachement du VIH à la surface de cellules dendritiques et macrophages est entrepris par des résidus carbohydrates de l’enveloppe virale (gp120) fixant, sans spécificité propre, certains récepteurs cellulaires, dont MMR, DC-SIGN et MBL (93). Le DC-SIGN (une lectine de type C) est exprimé en surface des cellules dendritiques et possède une forte affinité pour la gp120 du VIH. Ce récepteur joue un rôle important dans la transmission de l’infection entre les cellules dendritiques et les lymphocytes T et dans les mécanismes d’évasion immunitaire (11, 90, 224). Il a également été observé qu’un virus produit sur une lignée cellulaire traitée à l’IFN-γ possède une plus grande facilité à fixer et infecter une lignée CD4 négative (38). Cette propriété est attribuée à la présence de molécules d’adhésion à la surface du virus. Ces protéines facilitent l’entrée de ces virus chez la cellule-cible. En laboratoire, il a été démontré que l’entrée du VIH est initiée par une interaction avec le CD4 de la cellule-cible. Bien que ce récepteur demeure essentiel à l’entrée du virus, d’autres protéines participent à cette étape du cycle viral. En effet, les co-récepteurs CCR5 et CXCR4 sont essentiels à l’entrée et à la fusion du VIH (43, 52, 66). La découverte de ces co-récepteurs a permis la re-classification des souches virales. Sur la base de l’utilisation d’un co-récepteur plutôt qu’un autre, un virus est dit de tropisme R5 ou X4 (20). Notons que le tropisme cellulaire dépend de la spécificité de la gp120 pour le co-récepteur. Les principales cibles cellulaires du VIH (lymphocytes T CD4 et monocytes/macrophages) expriment les deux co-récepteurs à la fois (CXCR4 et CCR5), mais un seul sera préférentiellement utilisé durant l’attachement. On retrouve également des virus ayant la capacité d’infecter à la fois les cellules T CD4 et les monocytes/macrophages. Ces virus sont nommés double tropisme (R5/X4) et ils représentent la majorité des isolats viraux prélevés chez les patients infectés. Afin de démontrer l’importance de ces co-récepteurs, il a été observé, chez environ 13% de la population du nord de l’Europe qu’une forme mutée de CCR5 apporte une résistance à l’infection par le VIH. En effet, certaines personnes expriment une variante du CCR5, portant une délétion de 32 pb (CCR5Δ32). Cette délétion bloque l’expression de surface du récepteur CCR5 et entraîne une inhibition efficace de la réplication virale (104). De plus, certains humains, homozygotes pour ce gène, se sont révélés particulièrement résistants à l’infection par le VIH (120, 160, 250). D’autres récepteurs ont également été découverts au cours des dernières années, dont le galactosylcéramide (GalCer). Cette protéine est principalement exprimée chez les cellules épithéliales du colon et certaines cellules du cerveau. Le GalCer a la propriété de remplacer le CD4 lors de l’entrée. Dans ces conditions particulières, la présence d’un co-récepteur demeure, par contre, nécessaire (23). Par ailleurs, des protéoglycans, les sulfates d’héparane (HSPG) qui sont exprimés sur plusieurs types cellulaires, ont un rôle important comme facteur d’attachement du VIH (183, 240). En effet, les HSPG ont une structure en chaîne de poly-anions sulfatés qui interagit avec les résidus basiques de la boucle V3 de la gp120 (183, 190, 240). Ainsi, l’attachement d’un virus à sa cellule-cible est facilité par la présence de HSPG. Cette protéine est importante à considérer lorsque l’attachement devient une étape limitante à l’infection virale i.e. lorsque la cellule-cible exprime un faible niveau de CD4 ou lorsque les virions possèdent des niveaux sous-optimaux en gp120.

L’attachement du VIH peut parfois procéder indépendamment du récepteur CD4. En effet, l’affinité de la gp120 pour le CD4 est d’environ 1 000 fois plus faible en conditions physiologiques qu’en culture cellulaire (74, 184, 251). Pourtant, la grande majorité des études d’attachement ont été réalisées à partir d’isolats de laboratoire (i.e. TCLA (T-cell-line adapted). Ces conditions surestiment donc l’importance du CD4 (287).

Le processus d’entrée du VIH débute par une première interaction entre la gp120 du virus et le CD4 de la cellule-hôte (Figure 4A). La gp120 est ensuite modifiée afin de permettre son interaction avec le co-récepteur (Figure 4B). Ce lien permet le déploiement du peptide de fusion (FP) et de deux régions en hélice (HR1 et HR2) de la gp41 (Figure 4C). Le peptide FP est principalement composé de résidus hydrophobes. Sa composition riche en glycine lui permet de pénétrer efficacement la membrane cellulaire (53, 127, 232). Une fois le FP inséré dans la membrane, les régions HR1 et HR2 changent de conformation et conduient à la formation d’une structure à six hélices (Figure 4D). Cette structure crée un canal dans la membrane cellulaire permettant l’injection de la capside virale dans le cytosol (53, 127). Notons que la formation de pores de fusion nécessite le recrutement d’une quantité suffisante de CD4 et de co-récepteurs (revue dans (44)).

Le seul déterminant protéique essentiel au bourgeonnement du VIH est la poly-protéine Gag. L’expression de cette protéine chez la majorité des eucaryotes supérieurs permet la production de particules ressemblant à des virions immatures portant le nom de VLP (Figure 2B) (94, 118). La protéine Gag dirige les étapes d’assemblage et permet de concentrer les précurseurs viraux au site de bourgeonnement (78, 82, 198, 199, 252, 270). Trois régions de Gag ont été identifiées et sont essentielles à l’assemblage du VIH : la région de fixation à la membrane (M), la région d’interaction (I) et, la région tardive (L) (Figure 5) (211).

Le domaine M en N-terminal contient un signal « bipartite » de fixation à la membrane, une région myristoylée et un regroupement d’a.a. basiques (aux positions 12 à 34 de GagMA). La simple modification de la Gly en N-terminale de ce domaine (site de la fonction myristoyle) est suffisante pour bloquer la fixation de Gag à la membrane plasmique (28, 94, 101). Cette modification entraîne, entre autre, une baisse significative de la production virale. Par ailleurs, l’insertion de mutations dans la région basique en N-terminale du domaine M relocalise Gag au niveau de membranes intracellulaires lors de l’assemblage (308). Ces mutations sont létales pour le virus (187, 212, 265). Le domaine M du VIH est donc impliqué dans la localisation de Gag à la membrane plasmique afin d’en délimiter le site d’assemblage.

Des différences significatives de l’affinité d’attachement à la membrane ont été observées entre la protéine mature MA et le domaine MA de la polyprotéine Gag (GagMA). L’affinité à la membrane de la MA est plus élevée que GagMA (206, 269, 313). Ces différences s’explique par le modèle myristoyl switch. Puisque le précurseur immature Gag est principalement impliqué dans le regroupement des composantes virales à la membrane. Cette protéine agit comme plateforme d’assemblage. La matrice virale, obtenue par le clivage de Gag en ses sous-unités, est chargée d’une tout autre fonction. En effet, cette protéine est chargée du maintien de l’intégrité membranaire du virus. Il n’est donc pas surprenant d’observer différentes affinités lipidiques entre ces protéines (115, 313).

La région tardive L est localisée dans la séquence codant pour Gagp6. La délétion de la région tardive L permet la production de particules virales immatures attachées à la cellule-hôte. Cette région est donc impliquée dans le relâchement des virions de la cellule infectée (100). La séquence PTAP, présente dans la partie N-terminale de Gagp6, a été identifiée comme un médiateur important du bourgeonnement (119). Des motifs similaires à PTAP ont été retrouvés chez d’autres virus : RSV, VSV, MLV, MPMV et EIAV (110, 172, 228, 298, 302, 304, 310). La délétion du motif PTAP chez ces virus conduit à la formation de virus similaires à ceux observés par la délétion du même motif chez le VIH. Il a été également démontré que ces motifs sont interchangeables d’un rétrovirus à un autre (155, 211, 309).

Le bourgeonnement du VIH de la cellule-hôte nécessite la machinerie d’ubiquitination. En effet, environ 2-5% des précurseurs Gag, retrouvés au site de bourgeonnement, sont mono-ubiquitinés à leur région p6 (203). Il a été démontré que la protéine Tsg101 interagit directement avec le motif PTAP du VIH préalablement présenté (290). Cette protéine cellulaire possède, à priori, les activités enzymatiques d’ubiquitination, de transcription, de mitose cellulaire et de tri des vésicules (226, 290). Le rôle de Tsg101 sur le cycle viral du VIH est de contrôler la machinerie vésiculaire de la cellule (les endosomes) dans leur bourgeonnement. Ce rôle a été démontré par l’utilisation de petits ARNs interférants bloquant le bourgeonnement du VIH (89). Il semble donc plausible que la protéine Tsg101 soit responsable de l’organisation du bourgeonnement du VIH par un mécanisme qui implique la mono-ubiquitination.

Pendant plusieurs années, l’assemblage des rétrovirus de type C et des lentivirus a été localisé à la membrane plasmique. Alors que l’assemblage des rétrovirus de type B et D a longuement été considéré comme prenant place dans des vésicules du cytosol (92). Certaines études biochimiques ont d’ailleurs permis l’identification de larges complexes dans le cytosol des cellules infectées par le VIH, dont certains étaient résistants aux détergents (voir plus la section Transport de Gag à la membrane plasmique) (153, 154, 206). Ces résultats semblent démontrer que l’assemblage des précurseurs Gag et Gag/Pol du VIH s’effectue dans le cytosol avant d’être redirigée à la membrane plasmique. D’autres études ont démontré l’existence de différences entre le bourgeonnement du VIH de lymphocytes T et le bourgeonnement de macrophages. La sortie des virions des lymphocytes T prendrait place principalement à la membrane plasmique alors que la sortie des virions des macrophages prendrait plutôt place au niveau des endosomes (217, 230).

Peu d’études ont porté sur les mécanismes de transports des précurseurs Gag et Gag/Pol vers la membrane plasmique. Cependant, parmi ces études, le système vésiculaire a régulièrement été considéré comme un médiateur important au transport des précurseurs Gag. Par contre, des virus produits en présence d’inhibiteurs du transport vésiculaire (Brefeldine A et monensine) n’ont présenté qu’une déficience en gp120 et gp41 sans altération du transport de Gag ni de la production virale (54, 207, 208).

Le cytosquelette d’actine a également été considéré comme un candidat d’intérêt dans le transport de Gag à la membrane plasmique. En effet, il a été démontré que le traitement de cellules infectées à la cytochalasine D (inhibiteur de la synthèse des polymères d’actine) provoque une diminution de la production virale (revue dans (50)). Le traitement de cellules infectées à la colchicine (inhibiteur des microtubules) conduit à la formation de larges pseudopodes concentrés en F-actine favorisant un bourgeonnement unidirectionnel des particules virales (216). Notons que l’actine ainsi que plusieurs protéines, interagissant avec cette dernière, ont été retrouvés à l’intérieur de particules de VIH isolées (204, 205). Il demeure donc probable que le cytosquelette d’actine ait un rôle à jouer dans le transport des précurseurs immatures Gag et Gag/Pol du VIH (158, 235, 295).

Les précurseurs Gag et Gag/Pol possèdent la propriété de s’assembler au niveau de régions riches en cholestérol et en sphingolipides durant l’assemblage (194, 197). Ces régions portent aujourd’hui le nom de radeaux lipidiques. Les précurseurs immatures Gag, lors de leur multimérisation, orchestrent le regroupement des radeaux lipidiques en macrodomaines portant le nom de barges (Figure 6) (157). Ces domaines sont également connus pour être résistants aux traitements par les détergents. La référence de traitement consiste en une solubilisation des particules dans le Triton X-100 1% à 4°C. La fraction soluble est dite sensible aux détergents alors que la fraction insoluble est dite résistante (262). Les radeaux lipidiques sont impliqués chez la cellule dans la transduction de signaux, le transport membranaire et la réorganisation des protéines de surfaces (protein trafficking) (124). La région M de Gag, préalablement présentée, possède un groupement fonctionnel myristoyle en N-terminale qui cible ces radeaux lipidiques (178). Les protéines Env et Nef sont également localisées dans les radeaux lipidiques en cours de bourgeonnement (222). Ces études proposent que les radeaux lipidiques servent de plateformes naturelles au recrutement et à l’assemblage des protéines du VIH.

La glycoprotéine de l’enveloppe (gp160) est produite au niveau du réticulum endoplasmique (RE). Elle est maintenue aux membranes de ce dernier par un domaine hydrophobe. La gp160 circule du RE jusqu’au Golgi sous la forme d’un trimère afin d’entreprendre une étape de maturation. La maturation de la gp160 est réalisée par une protéase cellulaire de type furine. Son clivage permet la formation des deux glycoprotéines de l’enveloppe la gp41 et la gp120 (105). Notons que cette étape de maturation est essentielle à l’attachement et à la fusion du virus (81, 173). Une interaction non-covalente entre la gp41 et la gp120 permet leur transport en tandem jusqu’à la membrane plasmique au site d’assemblage. La présence d’un signal d’endocytose au niveau de la gp41 provoque la rapide internalisation du complexe gp120/gp41. Seule la fixation de Gag à la gp41 bloque cette internalisation en masquant le signal d’endocytose (61).

Le mécanisme d’acquisition de l’Env par le VIH n’est pas entièrement connu. Plusieurs observations suggèrent que l’incorporation de l’Env est dirigée par Gag. En effet, des virus immatures, produits par la délétion de la protéase virale, possèdent toujours la propriété d’incorporer les protéines de l’Env. Chez de tels virus, Gag est la seule protéine structurale pouvant offrir une interaction avec l’Env. Gag serait un candidat important dans l’acquisition de l’Env. Afin d’évaluer le rôle joué par Gag dans l’acquisition de l’Env, des mutations ponctuelles ont été conçues au niveau de la région MA et ont permis d’identifier certains résidus impliqués dans le recrutement de l’Env (59, 79, 80, 307). D’autres études ont démontré l’existence d’une interaction directe entre GagMA et la gp41 (48, 301). Par ailleurs, puisque l’Env possède une affinité élevée pour les radeaux lipidiques, le transport de ces protéines virales pourrait être le fruit d’une interaction direct avec ces domaines lipidiques (194, 222). Une interaction Gag/Env a également été identifiée à une étape précoce du cycle viral. En effet, un lien Gag/Env prend place au niveau du cytosol afin d’éviter toute interaction intra-cytoplasmique entre la gp120 et le CD4 (301).

Au cours de l’assemblage les précurseurs immatures Gag et Gag/Pol se lient au niveau du cytosol dans un ratio 10 : 1 respectivement. La localisation de ces précurseurs immatures au niveau de la membrane plasmique conduit à la formation du site de bourgeonnement. La maturation débute durant le bourgeonnement et se termine une fois la particule virale formée. Cette étape est essentielle à l’infectivité virale (49, 133). Le précurseur Gag/Pol possède une sous-unité inactive de la protéase virale correspondant à la région Gag/PolPr. L’étape de maturation débute lorsque plusieurs domaines Gag/PolPr s’autoclivent en un repliement et une dimérisation (161, 162). L’autoclivage permet la production d’une protéase mature (Pr) sous forme de dimère qui aura comme principaux substrats Gag et Gag/Pol. La protéase a plusieurs sites de clivage sur un même précurseur Gag et chacun de ces clivages est réalisés dans un ordre finement régulé. Les fragments ainsi produits sont de différents ordres : primaires, secondaires et tertiaires. Les sites de clivages diffèrent beaucoup sur leur base en a.a., mais chacun de ces sites doit comprendre un minimum de 7 a.a.. L’ordre général de clivage entrepris par la protéase virale est le suivant : Gagp2/GagNC > GagNC/Gagp6 > GagMA/GagCA > GagCA/Gagp2 (Figure 7) (220, 283). La formation de la capside en cône et la condensation de l’ARN par la NC du virus sont les dernières étapes atteintes au cours de la maturation par le clivage de GagCA/Gagp2 (Figure 7). Cette dernière étape en plus de rendre le virus mature est également essentielle à l’infectivité de la particule virale.

Tel que préalablement présenté, la protéase virale est activée lors de l’assemblage et agit au cours du bourgeonnement. Or, certaines études visant la caractérisation de la protéase virale ont révélé que la protéase est activée tôt au cours du cycle viral et conduit à la formation de certains précurseurs immatures. Il est donc envisageable que certains de ces précurseurs soient impliqués structurellement dans le cycle du VIH.

Le VIH-1 est l’agent étiologique du SIDA et conduit à une destruction massive des lymphocytes T CD4+. Depuis 1981, plusieurs efforts ont été investis afin d’identifier le mécanisme par lequel ce virus provoque le syndrome d’immunodéficience. De ces efforts, deux hypothèses ont été retenues. La première propose que l’infection et la destruction des cellules T CD4+ par le VIH conduisent à la ruine du système immunitaire. Alors que la seconde hypothèse propose plutôt que la destruction des cellules T CD4+ ainsi que l’atteinte des cellules avoisinantes par leur activation démesurée provoquent la perte du système immunitaire. Dans les prochains paragraphes, les principaux éléments de la pathogenèse du VIH seront discutés afin de mieux comprendre l’évolution de l’infection et l’apparition des symptômes tous les deux associés à la défaillance du système immunitaire et éventuellement à la mort du patient.

Les principales cellules-cibles du VIH sont les lymphocytes T CD4+ et les monocytes/macrophages. D’autres cellules de même origine que les monocytes/macrophages sont également infectées. En effet, parmi ces candidats, on compte les cellules folliculaires dendritiques (267, 299) qui sont présentes dans les centres germinatifs des ganglions et les cellules de Langerhans (135). La réplication virale est dépendante du type de cellules infectées. Dans certains types cellulaires, l’infection par le VIH peut conduire à une phase de latence tandis que chez d’autres types cellulaires, l’intégration conduit à l’expression transcriptionnelle des gènes viraux et à une réplication virale productive. La réplication du VIH dans l’organisme a lieu dans de nombreux tissus (ganglions lymphatiques, cerveau, muscles, etc.) et/ou liquides biologiques (sang, liquide broncho-alvéolaire), dans lesquels on retrouve les cellules-cibles du VIH. Les organes lymphoïdes qui sont le siège de la production et de la maturation des cellules du système immunitaire, sont également atteints dès les stades précoces de l’infection (29). La voie empruntée par le VIH pour passer des muqueuses aux organes lymphoïdes secondaires n’est pas encore connue. Cependant, les cellules que l’on croit impliquées dans ce processus, pourraient être les cellules dendritiques et/ou épithéliales. En effet ces cellules expriment de nombreux récepteurs capables de lier le VIH (286). Par contre, ces cellules ne supportent pas la réplication virale in vivo, ce qui fait de ces lignées de bons candidats à la dissémination du VIH dans l’organisme.

Le premier inhibiteur antirétroviral approuvé dans le traitement des infections par le VIH a vue le jour en 1996. L’ensemble des inhibiteurs développés ne permettent pas encore de bloquer définitivement l’infection par le VIH. Par ailleurs, leur utilisation pose de nouveaux défis reliés aux effets secondaires et aux résistances induites par ces produits.

Par contre, l’utilisation de ces inhibiteurs a considérablement réduit le nombre de décès. L’opinion publique a également changer face au SIDA, en effet on ne parle plus de fléau, mais plutôt de maladie chronique avec laquelle il est envisageable de vivre (209). Il existe plus de 20 antirétroviraux approuvés et utilisés en traitement, classés dans cinq catégories (Tableau 1). Les protéines virales ciblées par ces inhibiteurs commercialisés sont la transcriptase inverse, la protéase virale et la glycoprotéine de l’enveloppe gp41. On prescrit habituellement au patient une trithérapie basée sur trois antiviraux de mécanismes inhibiteurs différents. Le traitement classique de première ligne consiste en cette combinaison d’inhibiteurs : AZT/3TC/ABC. Il a également été démontré en études cliniques qu’une quatrième thérapie, basée sur l’éfavirenz (EFV), aurait une efficacité supérieure à la trithérapie traditionnelle. En tenant compte du nombre important de patients développant des résistances aux inhibiteurs de première ligne (affectant plus de 30 à 50% des patients sous HAART) (65, 134), le médecin traitant se doit de modifier constamment la combinaison d’inhibiteurs utilisés en thérapie. Plusieurs technologies sont maintenant disponibles afin de permettre l’identification rapide et efficace des résistants viraux. L’avantage de cette approche, de dépistage rapide, est de permettre l’ajustement de la thérapie afin de la rendre la plus efficace possible.

L’utilisation d’un inhibiteur antiviraux conduit généralement à l’apparition de mutations qui rend ces virions résistants à l’action de l’inhibiteur. Il n’est pas rare que ces mutations conduisent à des résistances plus larges affectant l’efficacité des analogues de l’inhibiteur. Ce phénomène porte le nom de résistance croisée et est principalement observé chez les analogues des inhibiteurs nucléosidiques et nucléotidiques de la transcriptase inverse (45, 218).

Afin d’éviter l’apparition de ces résistances croisées et afin d’augmenter l’efficacité des thérapies antirétrovirales, d’autres classes d’inhibiteurs ont vu le jour. En effet, plusieurs antirétroviraux employant des mécanismes d’inhibition variés sont actuellement en phase clinique. On retrouve, parmi ces produits, des inhibiteurs de l’intégrase, de la protéase, de l’entrée et de la fusion virale (137). Et plus récemment, des antagonistes des co-récepteurs ont également été développés (Figure 8) (137). Une partie de mes recherches de doctorat consiste à évaluer l’impact de la présence ou de l’absence de l’ICAM-1 sur l’action du T-20 (un inhibiteur de la fusion virale). Je vais donc vous présenter une description plus détaillée des inhibiteurs de l’entrée et de la fusion du VIH.

Inhibiteurs de l’entrée et de la fusion

L’une des problématiques principales retrouvées dans la pathogenèse du VIH est la formation de réservoirs viraux en cours d’infection. Ces réservoirs rendent le traitement des patients séropositifs difficiles. Pour voir l’apparition de ses réservoirs, il faut inévitablement laisser entrer le virus dans sa cellule-cible. Il pourra s’intégré dans le génome de la cellule-hôte et entré en latence jusqu’à ce que des conditions plus permissives facilites sa réplication. Cibler le VIH avant même qu’il n’est pu pénétrer la cellule comporte plusieurs avantages. L’absence d’intégration, de réplication en sont deux exemples. Le développement d’inhibiteurs de l’entrée et de la fusion du VIH est en plein essort. Une brève description des derniers développements vous sera présentée dans les prochains paragraphes. Un accent particulier sera mis sur les inhibiteurs de fusion puisque l’un des articles de cette thèse traite de ce sujet.

Agents ciblant l’interaction gp120/CD4

Les premières stratégies, dans le développement d’inhibiteurs de l’entrée virale, ont ciblé l’interaction gp120/CD4. L’utilisation d’une protéine recombinante soluble de CD4 (rsCD4) a démontré un potentiel inhibiteur prometteur dans des conditions in vitro (69, 122). Cependant, lors d’une évaluation clinique, l’activité de rsCD4 ne s’est pas avérée aussi efficace qu’in vitro (184, 255). Par ailleurs, une protéine chimère construite à partir du CD4 et de la gamma-globuline a également été testée. Cette protéine a une demi-vie longue, mais son activité inhibitrice est totalement abolie lorsque administrée en présence de zidovudine (AZT) (179).

Toutefois, malgré ces échecs, d’autres inhibiteurs de l’interaction gp120/CD4 sont actuellement en développement tel que le PRO 542. Ce produit semble avoir un certain succès in vitro pour un large spectre de souches virales (284). Des anticorps monoclonaux pourraient également être utilisés afin de bloquer l’entrée de plusieurs sous-types du VIH (186). Cependant leur utilisation peut induire d’importantes immunosuppressions. Des études portant sur l’anticorps monoclonal humanisé, le TNX-355, a démontré une bonne efficacité pour bloquer efficacement la réplication virale. Jusqu’alors, aucune évidence d’immunosuppression n’a été observée pour cet anticorps (137). Un traitement d’environ deux semaines au TNX-355 est suffisant pour baisser la virémie de 1.0 log10 copies d’ARN viral/ml (143). Ainsi, l’interaction gp120/CD4 constitue une cible de prédilection au développement d’agents bloquant l’entrée du VIH.

Agents ciblant l’interaction gp120/co-récepteurs (CCR5 et CXCR4)

D’autres inhibiteurs ont également la propriété de bloquer l’entrée virale. Parmi ces composés, on retrouve le sulfate Dextran et d’autres polyanions. Leur inhibition est principalement attribuée à une interférence de l’interaction gp120/CD4 (137). Il a été démontré que le Dextran a la propriété de fixer la région V3 de la gp120 bloquant l’interaction entre la gp120 et le co-récepteur CXCR4. Cet inhibiteur a donc la propriété de cibler préférentiellement les virus de tropismes X4 et R5X4 (63, 190). Il est donc avantageux d’utiliser ces inhibiteurs en présence de virus ciblant préférentiellement les cellules T.

Par contre, leur action spécifique sur les cellules T peut induire un changement de tropisme de X4 vers R5 dans des conditions in vitro (181). Notons également que ces inhibiteurs sont plus ou moins bien tolérés par l’organisme et que parfois leur utilisation ne semble aucunement affecter la réplication virale (70).

Les inhibiteurs ciblant préférentiellement les co-récepteurs du VIH i.e. CCR5 et CXCR4 sont également fort prometteurs. Voici un exemple de l’importance des co-récepteur sur la réplication virale. Il a été démontré que les personnes homozygotes pour l’allèle CCR5Δ32 (délétion bloquant l’expression de surface de la protéine CCR5) sont résistantes à l’infection par le VIH. Par contre, cette délétion n’affecte en rien l’infectivité des virus de tropisme X4. Ces derniers sont tenus responsables de la perte rapide des cellules T CD4+ initiant l’entrée dans la phase SIDA (141, 236). Par ailleurs, certaines molécules sont connues pour interagir naturellement avec les co-récepteurs. Il s’agit des ligands naturels des co-récepteurs. Parmi ces molécules, on compte le MIP 1-alpha, MIP 1-bêta et RANTES. Ces trois molécules servent de ligand naturel aux co-récepteurs, mais on également la propriété d’inhiber l’entrée des souches virales R5 dans des conditions in vitro.

De plus, des antagonistes synthétiques de CCR5 et de CXCR4 sont en développement clinique. Le CXCR4 est exprimé sur plusieurs types de cellules (plus que pour le CCR5). Cette propriété rend plus délicat l’utilisation d’un antagoniste contre le CXCR4. Le rôle du CXCR4 a été évalué par délétion du gène (« knockout ») chez la souris. L’ensemble des souris déficientes en CXCR4 n’ont pas survécu (192). D’autres antagonistes de co-récepteurs ont été brevetés par une entreprise canadienne et sont actuellement en phase clinique de développement. Parmi ces composés, on retrouve le AMD3100, antagoniste de CXCR4, principalement utilisé pour le traitement des maladies auto-immunes (145). Cette même entreprise a également développé un agent ciblant le récepteur CCR5 portant le nom de TAK-779.

Inhibiteurs de la fusion virale

Au cours des dernières années, une nouvelle classe d’agents antirétroviraux a vu le jour. Ces nouveaux inhibiteurs ciblent la fusion du VIH avec sa cellule-cible. Jusqu’alors, deux courts peptides synthétiques ont été développés afin de cibler certaines structures essentielles à la fusion virale. Ces peptides portent les noms de T-20 et T-1249. Ils miment, tous les deux, une portion de la région HR2 de la gp41 (Figure 9). La région HR2 a la propriété de se fixer à la région HR1 de la gp41 afin de promouvoir la fusion virale. Bloquer l’interaction HR1/HR2 conduit à l’arrêt de la fusion virale.

T-20

Le T-20 est également connu sous les noms d’enfuvirtide et de Fuzeon. Ce peptide de 36 a.a. est dérivé de la région HR2 d’une souche de laboratoire du VIH. Il possède l’activité d’inhibition pour les tropismes X4, R5 et combinés la plus efficace de tous les inhibiteurs jusqu’alors développés (une réduction moyenne de plus de 1,6 log10 copies d’ARN par mm3 après deux injections de 100 mg). Par contre, le T-20 possède une efficacité d’inhibition très variable. En effet, des variations en a.a. au niveau des séquences HR1 ont la propriété de rendre certains virus résistants à l’inhibiteur. Par ailleurs, des variations de l’affinité gp120/co-récepteurs ont également la propriété de faire varier l’efficacité du T-20 entre les différents virus rencontrés (103, 145, 294).

L’administration du T-20 peut être réalisée selon deux voies possibles. Les voies intraveineuses et sous-cutanées conduisent toutes deux à une diminution significative de la charge virale, mais la voie intraveineuse comporte d’importantes complications et est généralement évitée (138). Plusieurs des patients en traitement au T-20 ont vu leur charge virale augmentée suivant l’apparition de mutations (103).

La variabilité de l’efficacité du T-20

Plusieurs études ont démontré que l’efficacité du T-20 à bloquer la fusion du VIH est variable d’une souche virale à une autre (variation d’environ 2.5 log10 de la CI50) (145). Jusqu’alors, seulement deux causes affectant la sensibilité du T-20 ont été identifiées. Premièrement, les virions porteurs de mutations dans la région HR1 (Figure 9) ont démontré une forte résistance à l’inhibiteur (53, 237). Notons que la majorité des mutations retrouvées lors des études cliniques en monothérapies T-20 sont retrouvées dans la région HR1 de la gp41 (292). Un second facteur a été impliqué sur la variabilité d’efficacité du T-20. En effet, certaines modifications de la séquence V3 de la gp120 affectent les propriétés de l’inhibiteur en modulant son affinité pour le co-récepteur (232). Pour expliquer l’implication de l’interaction gp120/co-récepteurs sur la sensibilité du T-20, la cinétique de fusion de ces virus ont été comparée. Suivant cette étude, il a été démontré que la période durant laquelle l’inhibiteur peut agir sur la fusion est incluse entre le contact initial gp120/CD4 et l’engagement de la gp120 avec son co-récepteur (86, 177). Par conséquent, lorsqu’un facteur accentue la vitesse de liaison de la gp120 pour le co-récepteur, la fenêtre d’action du T-20 se trouve affectée. Si l’on additionne la variabilité d’inhibition du T-20 induite par des mutations de la région HR1 à la variabilité d’inhibition induite par l’interaction gp120/co-récepteurs, nous obtenons une variation cumulative d’environ 1,0 log10 (CI50). Or on retrouve plus de 2,5 log10 (IC50) de variabilité à l’efficacité du T-20 pour les souches virales retrouvées en clinique (145). Par conséquent, d’autres facteurs encore non-identifiés peuvent affecter l’action du T-20. Nous allons démontré sous peu comment certaines protéines cellulaires retrouvées en surface du VIH peuvent contribuer à ce phénomène.

En cours d’évolution, le VIH a développé plusieurs mécanismes d’évasion du système immunitaire afin d’éviter sa neutralisation par des anticorps et son élimination définitive de l’organisme. Plusieurs études, réalisées chez les rétrovirus, ont démontré que la proximité entre les composantes d’origines cellulaire et virale au site d’assemblage et de bourgeonnement permet l’incorporation d’un vaste répertoire de protéines de la cellule-hôte dans la membrane virale (revue dans (202, 203, 282)). Cette propriété de la famille des rétrovirus représente un mécanisme d’évasion. En effet, la présence de plusieurs protéines étrangères en surface du VIH permet à ce dernier d’être dissimulé sous des composantes du soi. Par ailleurs, ces protéines étrangères confèrent plusieurs fonctions aux virions qui les portent. Dans les prochains paragraphes, les principales protéines retrouvées acquises par le VIH seront présentées. Par la suite, nous allons discuté des principaux mécanismes pouvant expliquer leur sélection par le VIH, un phénomène répandu chez l’ensemble des tropismes viraux (239).

Pour la majorité des virus enveloppés, généralement très compacts, l’enrichissement en protéines virales au site d’assemblage éloigne la plupart des protéines cellulaires (41, 275). Par contre, cette propriété ne s’applique pas aux rétrovirus. Il s’agit de particules moins denses, chez lesquels plusieurs protéines étrangères participent à la constitution de la membrane virale. Au début des années 90, la détection de protéines étrangères en surface du VIH était employée pour identifier la cellule productrice du virus. En effet, certains marqueurs cellulaires i.e. CD3, CD19, CD14, CD26, CD31, CD36 et Il2-R retrouvés en surface du VIH permet d’identifier la cellule productrice et apporte quelques éléments sur l’état d’activation de cette cellule (2, 150). L’acquisition de protéines étrangères par le VIH suit un processus dépendant de la souche virale et de la lignée cellulaire (34). Cependant, peu d’informations sont disponibles sur les mécanismes employés par le virus dans la sélection de ces protéines. On tente aujourd’hui d’identifier la liste complète en protéines étrangères acquises par le VIH. En 2004, plus de 60 protéines cellulaires ont été identifiées en surface ou à l’intérieur de la particule virale (Tableau 2). La présence de contaminations cellulaires lors des étapes de purification des virions compliquent l’identification de ces composantes étrangères. Il a été démontré que malgré la centrifugation des virions, des microvésicules sont co-purifiées et interfèrent avec la quantification des protéines étrangères. Lorsque ces préparations purifiées sont analysées par microscopie électronique, on dénombre de deux à quatre fois plus de microvésicules que de virions (22, 98). Afin d’éviter la quantification de composantes provenant de débris cellulaires, quelques techniques ont été développées. La méthode la plus directe consiste à identifier les composantes virales et les protéines d’origine cellulaire par microscopie électronique (91, 175, 176). D’autre part, la technique d’immunocapture, plus indirecte, consiste à immunoprécipiter les virus en ciblant la protéine d’intérêt et à quantifier les virions récupérés par immunobuvardage, par ELISA p24 ou encore par la formation de syncytiums lorsqu’incubés en présence de lignées permissives (7, 200). D’autres approches peuvent également être employées afin d’identifier les protéines cellulaires. Par exemple, la neutralisation du VIH par l’utilisation d’anticorps permet, dans certaines circonstances, d’observer la présence d’un constituant étrangé en surface du VIH.

Un des avantages majeurs de répertorier les molécules étrangères acquises par le VIH est la catégorisation. En effet, plusieurs points communs entre les protéines d’origine cellulaire peuvent être identifiés. Par exemple, plusieurs de ces constituants interagissent avec le cytosquelette. Voici une liste complète des protéines retrouvées en surface et à l’intérieur du VIH (Tableau 2).

1 En référence, on retrouve les articles sur l’acquisition de constituants étrangés par le VIH et les articles sur les interactions de ces constituants étrangés avec le cytosquelette.

2 Les lignes de couleur rouge mettent en évidence les antigènes (CD) interagissant avec l’actine ou certaines protéines fixant l’actine (i.e. ERM).

Le processus d’incorporation des molécules de l’hôte par le VIH semble toutefois restrictif pour certaines protéines. La protéine CD45, par exemple, fortement exprimée en surface de la cellule-hôte, n’est pas retrouvée acquise par le VIH (62, 194). Les récepteurs de chimioquines et les co-récepteurs du VIH (CCR5, CXCR4 et CCR3) sont également exclus de l’enveloppe virale (147). Notons que l’efficacité d’incorporation par le virus varie considérablement d’une lignée à une autre. L’expression des protéines de surface varie grandement, ce phénomène pourrait expliquer les fluctuations observées dans l’acquisition des protéines étrangères par le VIH (34).

Quoique la plupart des protéines acquises par le VIH ne sont pas essentielles au cycle réplicatif viral, ces protéines peuvent moduler son infectivité. Notons, entre autre, les protéines suivantes i.e. ICAM-1-2-3, HLA-DR, LFA-1, VLA-4, CD44 modulent tous le cycle du VIH (33, 72, 117, 156). En outre, la présence d’autres protéines, telles que CD55 et CD59, apportent aux virus une protection contre l’action du complément (249). Des évènements de signalisation, induits par les protéines ICAM-3, CD43 et B7.1-2 acquises par le VIH, ont également été observés chez la cellule-cible (8-10, 95). Il a été démontré que ces signalisations cellulaires favorisent le cycle de réplication viral.

Notons que les molécules de l’hôte incorporées par le VIH conservent leur structure tridimensionnelle. En effet, l’activité enzymatique de la protéine cellulaire est généralement conservée une fois cette dernière retrouvée sur le VIH. Prenons l’exemple du CMH-II qui, lorsqu’acquise par le VIH, possède toujours la propriété d’interagir avec une cellule T (243). Cette observation soulève la possibilité qu’un virus porteur du CMH-II puisse présenter un antigène à une cellule T. Cette fonction aurait comme conséquence la production de cytokines ou encore la capacité d’induire l’apoptose. Les protéines cellulaires, acquises par le VIH, les plus étudiées sont : les CMH-I, -II, l’ICAM-1 et le LFA-1. Mes travaux de recherche portent sur la molécule d’adhésion ICAM-1. Une description plus détaillée de cette protéine suivra.

Le CMH-II est retrouvé en surface de tous les virus produits sur les lignées exprimant cette protéine. La concentration en CMH-II à la surface du VIH est la plus élevée lorsque comparée à celle d’autres protéines étrangères (3, 34, 36, 62). On retrouve de 400 à 600 molécules de CMH-II par virion, ce qui représente deux fois la concentration retrouvée en gp120 (estimé à environ 200 mol/virion) (7). Le CMH-II peut être observé à la surface du VIH grâce aux tests d’immunocapture et de neutralisation (201). De plus, le HLA-II a été retrouvé à la surface de virus amplifiés sur des cellules primaires et in vivo en surface de virus libres dans le plasma de patients séropositifs (14, 248). Bien que le HLA-DR n’ait pas été retrouvé sur des virions de patients en primo-infections, la majorité des isolats de virus provenant de patients en phases chroniques possèdent d’importants niveaux de HLA-DR (149). Par ailleurs, il existe plusieurs isoformes du CMH-II retrouvés à la surface du VIH. Le HLA-DR serait le plus fortement incorporé (34, 98, 254). L’acquisition des CMH-II en forte concentration sur différentes lignées cellulaires suggère l’existence d’un mécanisme d’acquisition finement régulé pour cette protéine (voir la section Incorporation des molécules de l’hôte par le VIH-1 – Mécanismes possibles de sélection ou d’exclusion en protéines de l’hôte). Il a été démontré que le HLA-II lorsque incorporé sur le VIH possède toujours la propriété de présenter un antigène dans des conditions in vitro (243). Cette présentation antigénique en absence de signal de co-stimulation pourrait avoir comme conséquence d’induire un signal d’apoptose et de provoquer la lyse de la cellule ciblée. Finalement, il a également été démontré que la présence du HLA-DR en surface du VIH peut augmenter l’infectivité du virus qui le porte (33).

L’ICAM-1 a été observée sur la grande majorité des isolats viraux pour différents tropismes. Cette protéine est acquise par des virions provenant de lignées cellulaires, de cellules primaires et de cultures sur amygdales (14, 25, 34, 36, 76). La présence de l’ICAM-1 à la surface du VIH augmente significativement l’infectivité du virus qui le porte. Il réduit également la sensibilité de ces virus à la neutralisation par des anticorps contre la gp120 (38, 71, 72, 238). Pour mieux comprendre le rôle de l’ICAM-1 sur le potentiel infectieux du VIH, voici une brève description des fonctions physiologiques jouées par cette protéine chez la cellule.

L’ICAM-1 -- une molécule d’adhésion

L’ICAM-1 possède comme ligand naturel la protéine LFA-1. Ces deux protéines sont exprimées par les leucocytes, les fibroblastes, les cellules épithéliales et endothéliales, et leur expression est régulée par des cytokines pro-inflammatoires (170, 244, 260).

L’ICAM-1 est également le ligand naturel de Mac-1. Ce dernier est exprimé chez les monocytes/macrophages. L’ICAM-1 est principalement exprimé en surface des cellules. Par contre, une forme soluble (sICAM-1) est également présente dans le plasma de patients sains (246). Le rôle de l’ICAM-1 dans l’adhésion a été démontré par des techniques de fixation impliquant des cellules fibroblastiques, endothéliales et des lymphocytes T (170, 260). L’interaction ICAM-1/LFA-1 est également impliquée dans le contact de CTLs avec leurs cellules-cibles. En effet, il a été démontré que bloquer l’interaction ICAM-1/LFA-1 conduit à l’incapacité d’une CTL à interagir avec sa cellule-cible (260). Notons que le niveau d’expression de l’ICAM-1 peut être modulé afin de favoriser le recrutement de leucocytes au site inflammatoire. En résumé, les principales fonctions de l’ICAM-1 sont de permettre l’infiltration des leucocytes de la circulation sanguine aux tissues (56, 266), de permettre l’action cytotoxique des CTLs sur une cellule-cible (168, 180) et de promouvoir la présentation antigénique (60, 264, 303). Finalement, le regroupement de molécules ICAM-1 en surface de la cellule induit des événements de signalisation (64, 245).

La protéine membranaire ICAM-1 fait partie de la grande famille des immunoglobulines. Elle possède cinq domaines de type IgSF, une région transmembranaire hydrophobe et une courte queue intra-cytoplasmique (Figure 10A). Le site de fixation pour LFA-1 est localisé dans le domaine 1 (le plus à l’extérieur de la cellule) alors que le site de fixation pour Mac-1 est localisé dans le domaine 3. Notons que l’intensité de l’interaction LFA-1/ICAM-1 peut être augmentée par deux mécanismes. Le premier implique une augmentation de l’affinité par un changement de la conformation du LFA-1, alors que le deuxième implique une augmentation de l’avidité induite par le regroupement de plusieurs molécules de LFA-1 (83, 273). Bien que la constante de dissociation de l’interaction ICAM-1/LFA-1 soit supérieure à 1,0 mM lorsque le LFA-1 est dans un état de basse affinité/avidité, cette constante peut diminuer jusqu’à 0,1 microM lorsque le LFA-1 est dans un état de haute affinité/avidité. Ces deux états d’activation du LFA-1 sont cruciaux pour l’adhésion et le relâchement entre cellules. En effet, l’état de faible affinité/avidité permet la libre circulation des leucocytes. Cependant lorsque ces mêmes leucocytes sont recrutés durant l’extravasation, l’état de haute affinité du LFA-1 pour l’ICAM-1 permet un rapprochement efficace des cellules. Par ailleurs, il a récemment été démontré que la molécule ICAM-1 possède la propriété de former des dimères et des multimères à la surface de la cellule (Figure 10B, C et D) (182, 233). La forme dimérique de l’ICAM-1 offre une plus grande affinité pour ses ligands naturels. Cette propriété vient s’ajouter à celles du LFA-1 offrant de multiples affinités pour l’adhésion entre cellules (182, 233). La régulation de l’interaction ICAM-1/LFA-1 nécessite l’implication du cytosquelette d’actine corticale.

La molécule d’adhésion ICAM-1 a la propriété d’interagir avec le cytosquelette d’actine corticale. Cette interaction avec le cytosquelette vient réguler la force du lien ICAM-1/LFA-1. Le cytosquelette est directement localisé sous la bicouche lipidique de la cellule et utilise parfois comme intermédiaire l’ezrine (13, 37, 112). La chaîne bêta de l’intégrine LFA-1 a également la propriété d’interagir efficacement avec le cytosquelette d’actine (32). La fixation du LFA-1 au cytosquelette prévient la multimérisation des intégrines entre elles, ce lien doit être brisé afin de permettre l’adhésion (109, 289). Pour l’ICAM-1 l’absence d’interaction avec le cytosquelette prévient tous les événements d’adhésion. L’interaction cytosquelette/ICAM-1 se forme au cours de la polarisation de la cellule. Cet événement permet le regroupent de l’ICAM-1 au niveau des pseudopodes qui est le site impliqué dans l’adhésion (112). Le recrutement du LFA-1 en surface de la cellule peut induire un événement de signalisation favorisant l’adhésion. Ce phénomène porte le nom de outside-in (164). En parallèle, une signalisation intra-cellulaire provenant d’autres protéines peut induire l’adhésion par le LFA-1. Ce phénomène porte le nom de inside-out (121).

Plusieurs protéines impliquées dans la signalisation cellulaire, comme les kinases de la famille des src (i.e. Lck, Lyn et Fyn), sont localisées dans les radeaux lipidiques (132, 142). Ces radeaux ont la fonction de répartir les protéines membranaires et de participer à la transduction de signaux (263, 288). Par ailleurs, ces domaines membranaires offrent également une structure concentrée, où certaines protéines peuvent agir entre elles. L’ICAM-1 a la propriété d’interagir avec certains membres de la famille des kinases src (281). Par ailleurs, l’ICAM-1 est localisé dans les radeaux lipidiques (280). La localisation de l’ICAM-1 au niveau des radeaux lipidiques favorise le regroupement des molécules d’adhésion lorsque les radeaux fusionnent entre eux. À l’inverse, lors des situations ne nécessitant pas d’adhésion, les radeaux lipidiques se séparent entraînant avec eux les protéines d’adhésion.

En dehors des fonctions d’adhésion entre cellules, l’ICAM-1 a la propriété d’être un récepteur pour plusieurs pathogènes. En fait, trois familles de pathogènes utilisent l’ICAM-1 comme récepteur d’entrée. Nous retrouvons les Rhinoviridea, les Coxackieviridea de type A et les Plasmodium (falciparum) (17). Ces pathogènes utilisent tous le domaine 1 de l’ICAM-1 pour leur adhésion. D’autre part, l’interaction ICAM-1/LFA-1 est également impliquée dans d’autres pathologies immunes, tel que la sclérose multiple (MS), la thyroïdite et dans le diabète mellitus insulinodépendant (IDDM), qui impliquent tous l’infiltration de lymphocytes autoréactifs (130, 272, 311). Pour ces raisons l’interaction ICAM-1/LFA-1 est considérée comme une cible de choix au contrôle de maladies autoimmunes ainsi que dans le contrôle de certaines infections.

Il existe aujourd’hui plusieurs inhibiteurs de l’interaction ICAM-1/LFA-1. On retrouve des anticorps dirigés contre l’ICAM-1 et contre le LFA-1. Ces anticorps sont régulièrement utilisés en prophylaxie contre le rejet d’organes transplantés (125, 277) et dans la lutte contre le IDDM (12, 189). Ces anticorps auraient également un potentiel dans le traitement de l’arthrite rhumatoïde et du psoriasis. Plusieurs molécules et peptides inhibiteurs sont également en développement. Parmi ces produits, on compte les peptides cycliques qui miment le domaine 1 de l’ICAM-1 ou le domaine I du LFA-1. On retrouve également parmi ces inhibiteurs des composés synthétiques obtenus par peptidomimétisme. D’autres inhibiteurs tel que les lovastatines, BIRT-377 et p-arylthios cinnamides sont tous des molécules chimiques ciblant efficacement le LFA-1 (129, 136, 159).

L’ICAM-1 vs le VIH-1

L’ICAM-1 a été identifié à la surface du VIH pour la première fois en 1994. Notons qu’en dehors du HLA-DR, l’ICAM-1 est la molécule de l’hôte retrouvée en plus forte concentration à la surface des virions. En proportion, la concentration en ICAM-1 avoisine le 1/7 de la concentration en p24 (36). La molécule d’adhésion est retrouvée en surface d’isolats cliniques et d’isolats de laboratoire provenant de cellules primaires et d’amygdales (voir Tableau 2).

Il a été démontré qu’un virus portant l’ICAM-1 à sa surface a une infectivité accrue de 2-10 fois celle d’un virus déficient en ICAM-1. Cette induction de l’infectivité virale passe de 6-95 fois en présence d’un LFA-1 de haute affinité (72, 73). Il s’agit ici de la plus forte augmentation de l’infectivité virale induite par une protéine étrangère. Cette augmentation du pouvoir infectieux par la présence de l’ICAM-1 en surface du VIH est également observée à l’aide de cultures d’amygdales en conditions ex vivo (25). Les protéines virales Tat et gp120 ont la capacité d’induire l’expression de l’ICAM-1 en surface des cellules infectées (55, 234). Ces protéines auraient la capacité de favoriser l’acquisition de l’ICAM-1 en augmentant son accessibilité.

Plusieurs hypothèses ont été suggérées afin d’expliquer le mécanisme d’acquisition de l’ICAM-1 utilisé par le VIH. Cependant, il a été récemment démontré que l’ICAM-1 augmente la cinétique de fusion du virus qui le porte (278). De plus, la présence de l’ICAM-1 en surface du VIH permet au virus d’être relaché dans une plus forte proportion dans le cytosol plutôt que d’être internalisé dans les vésicules (278). Le relargage de virus dans le cytosol est associé à une infection productive alors que l’internalisation dans les vésicules d’endocytose est plutôt associée à un cheminement vers la dégradation. Ainsi, il est plus qu’évident que le VIH tire avantage de la présence de l’ICAM-1, ou autres protéines étrangères, en sa surface. Cependant existerait-t-il un ou plusieurs mécanismes spécifiques à leur acquisition ? Ou plutôt, ces acquisitions ne pourraient-elles pas être que le fruit du hasard ? Voici un bref aperçu des mécanismes d’acquisition des molécules étrangères par le VIH.

Bien que plusieurs études aient démontré que la promiscuité, entre les composantes d’origines cellulaire et virale, permet l’incorporation d’un vaste répertoire de molécules étrangères dans la membrane virale (revue dans (202, 203, 282)), un nombre très restreint d’études s’est intéressé aux mécanismes de sélection et d’exclusion de ces constituants par le VIH.

La membrane du VIH s’adapte à un grand nombre de protéines étrangères et semble parfois peu sélective. Par contre, certains constituants sont préférentiellement sélectionnés. Plusieurs de ces constituants partagent même certaines activités enzymatiques ou interactions protéiques suggérant l’existence de mécanismes de sélection communs. Or quatre grands modèles ont été proposés afin d’expliquer l’acquisition ou l’exclusion de protéines étrangères (article de revue (282)).

On compte plus de 13 protéines membranaires (sur un total de 46 protéines de surface), sélectionnées par le VIH interagissant directement ou indirectement avec le cytosquelette d’actine corticale (Figure 11A et Tableau 2). Le premier modèle propose l’implication du cytosquelette de la cellule infectée dans l’acquisition des constituants cellulaires par le VIH. D’autre part, certaines protéines d’origine cellulaire sont exclues de la surface du VIH. Parmi ces protéines, on compte le CD45, le CXCR4 et le CCR5. Ces protéines partagent certains points en commun. En effet, elles possèdent un domaine cytoplasmique de très haute masse moléculaire pour le CD45 ou elles sont fortement reliées à la membrane cellulaire par de nombreuses régions transmembranaires pour les CXCR4 et CCR5. Il a donc été proposé que l’exclusion de certains constituants étrangés soit provoquée par l’encombrement stérique. En effet, le VIH possède beaucoup d’espace entre la matrice, fixée sous la bicouche lipidique, et la capside, mais certains domaines cytoplasmiques pourraient s’avérer trop grands pour leur acquisition par le VIH. Une étude a d’ailleurs démontré que l’encombrement stérique pouvait jouer un rôle important sur la sélection de protéines par le VIH. En effet, le clivage de la portion intracytoplasmique de la protéine EGFR a permis de démontrer l’importance de la taille du domaine intracytoplasmique dans l’acquisition d’une protéine par le VIH (114). D’autre part, l’attachement à la membrane cellulaire, par de nombreux domaines transmembranaires, pourrait limiter leur capture par le virus lors du bourgeonnement. Ainsi, malgré une grande permissivité membranaire offerte par le VIH, l’acquisition de constituants étrangers demeure limiter par la taille du domaine intracytoplasmique et par le type d’attachement membranaire de la protéine étrangère (Figure 11B).

Il a été préalablement décrit que les protéines structurales du VIH s’assemblent au niveau de la membrane plasmique chez la cellule T ou au niveau des endosomes chez les monocytes/macrophages. Dans ces deux cas, l’assemblage des précurseurs est orchestrée dans des régions riches en cholestérol et en sphingolipides que l’on nomme radeaux lipidiques (Figure 6) (194). Cette voie naturelle de bourgeonnement permet l’acquisition de matériaux étrangers qui y sont également localisée. Notons que la composition de la membrane virale du VIH est également riche en cholestérol et en sphingolipides (102).

Dans la physiologie cellulaire, les radeaux lipidiques ont comme principales fonctions : la transduction de signaux, le transport membranaire et la réorganisation des protéines de surfaces (« trafficking ») (124). Il n’est donc pas surprenant d’y retrouver un grand nombre de protéines spécifiquement associées. De ce fait, un modèle d’acquisition passive par le VIH a été proposé. Dans ce cas, les protéines retrouvées dans les radeaux lipidiques seraient préférentiellement acquises par les particules virales en formation (Figure 11C).

La contiguïté entre les protéines d’origine cellulaire et virale tout au long du cycle de vie du VIH a permis de faciliter la réplication et l’évasion de ce dernier. Une telle promiscuité entre les protéines d’origines cellulaire et virale permet l’instauration d’interactions entre le virus et l’hôte. Par ailleurs, le seul déterminant viral essentiel au bourgeonnement chez la majorité des cellules eucaryotiques est le précurseur Gag. Il est connu pour diriger l’assemblage et permettre la localisation du site de bourgeonnement (voir la section Le cycle réplicatif du VIH-1 – Assemblage, encapsidation et bourgeonnement). D’autre part, les glycoprotéines structurales de l’enveloppe (gp41 et gp120) sont également associées au site de bourgeonnement et interagissent avec le précurseur immature Gag (301). Or, une interaction directe ou indirecte avec l’une de ces protéines structurales du virus permettrait l’acquisition de certains constituants cellulaires. De ce fait, le quatrième et dernier modèle consiste en une sélection positive. Ce modèle propose que certaines interactions directes ou indirectes prennent place entre des protéines cellulaires et des protéines virales afin de promouvoir leur acquisition. Une étude a d’ailleurs proposé l’existence de ce modèle. En effet, l’incorporation de HLA-DR par le VIH serait entreprise par une interaction directe avec certains résidus de la queue intracytoplasmique de la gp41 (225).

Une étude a démontré que la sélection de molécules de l’hôte par le VIH suit un processus passive et non actif (106). Ils ont observé que la grande majorité des protéines d’origine cellulaire sont représentées, en surface du VIH, qu’en proportion inférieure à 1% de Gag. Par contre, cette même étude fait la mention de quelques exceptions. En effet, plusieurs protéines de différents poids moléculaires (i.e. 18, 22, 27, 69, 97 kDa) sont enrichies lorsqu’acquisent par le VIH et ce, dans des concentrations similaires à celle de Gag. Par ailleurs, l’incorporation des molécules de l’hôte est un phénomène dépendant de la lignée cellulaire et du virus. Or les 293T et les BHK-21 ont été utilisées dans cette étude. Il s’agit ici de lignées cellulaires déficientes en plusieurs protéines de l’hôte dont l’ICAM-1 et le HLA-DR. Cette étude apporte plusieurs considérations d’intérêt, mais l’approche expérimentale permet difficilement l’application des résultats en théorie.

Bien que plusieurs hypothèses ont été suggérées afin d’expliquer l’acquisition de protéines étrangères, peu de démonstrations ont été réalisées. D’autres expériences devront être tentées afin de mieux caractériser ces mécanismes. La présente thèse s’incrit parfaitement dans ce sujet.

Il a été démontré que l’incorporation de constituants cellulaires chez les rétrovirus n’est pas un processus hautement spécifique puisque plusieurs protéines provenant de la cellule-hôte ont été retrouvées à l’intérieur ainsi qu’en surface de particules virales matures. Les protéines hôtes retrouvées chez ces rétrovirus sont plutôt bien connues, mais les mécanismes gouvernant leur acquisition demeurent encore inconnus.

Les inhibiteurs de fusion font actuellement l’objet de nombreuses recherches contre l’infection par le VIH. Ce type d’inhibiteurs, contrairement aux autres traitements actuellement utilisés, bloque le VIH-1 avant son entrée dans la cellule. Une action aussi précoce sur le cycle viral représente un avantage thérapeutique évident en évitent, entre autre, l’intégration du génome viral dans l’ADN de l’hôte et permet ainsi de limiter la formation de réservoirs viraux (provirus en latence) (voir la section Traitements antirétroviraux – Inhibiteurs de fusion). Parmi les inhibiteurs de fusion récemment développés, un seul est actuellement approuvé par le FDA et par la communauté européenne, le T-20 (voir la section Traitements antirétroviraux – Inhibiteurs de fusion – T-20). Cependant, l’efficacité du T-20 sur l’infection de cellules périphériques du sang par des isolats viraux de laboratoires et cliniques affiche une variabilité importante (de plus de 2,5 log10 de la CI50). Cette variabilité d’efficacité a également été rencontrée chez les autres inhibiteurs de fusion en développement. L’apparition de mutations uniques dans la région HR1 de la gp41, région ciblée par le T-20 est connu pour apporter les résistances les plus importantes face à l’inhibiteur. La densité et l’affinité des co-récepteurs du VIH (CXCR4 et CCR5) apporteraient aussi une résistance accrue face au T-20. Bien que l’ensemble de ces déterminants cellulaires et viraux modifient l’efficacité du T-20, ils ne peuvent expliquer à eux seuls une variabilité d’efficacité de plus de 2,5 log10 de la CI50. Il est connu que l’ICAM-1 augmente la cinétique d’entrée du VIH-1 lorsqu’il est retrouvé en surface de ce dernier. L’ICAM-1 rend les virus qui le porte plus résistants à la neutralisation par des anticorps dirigés contre la gp120 (voir la section Incorporation des molécules de l’hôte par le VIH-1 – ICAM-1 sur la biologie du VIH-1). Nous avons vérifié si la présence de l’ICAM-1 en surface du VIH-1 module la sensibilité des virions à l’action du T-20 lorsque comparée à des virions qui en sont déficients. Nous avons utilisé des isolats viraux de laboratoires et cliniques de tropismes variés (X4 et R5).

© Yannick Beauséjour, 2005