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CHAPITRE 5 CONCLUSION ET PERSPECTIVES

Une caractérisation détaillée des mécanismes conduisant à l’incorporation de constituants étrangers par le VIH-1 fait actuellement défaut. Une étude réalisée sur le sujet indique bien l’importance du donneur source, de la nature de la cellule infectée et du virus dans la bonne compréhension de ces processus (35). Il a été démontré que le VIH interagit avec plusieurs constituants cellulaires au cours de son cycle viral. Durant son évolution, il est plus que probable que le VIH ait acquis une habileté à sélectionner certains constituants de l’hôte afin d’en facilité son cycle réplicatif. À l’inverse, certaines protéines semblent être exclues de l’enveloppe virale (i.e. le CD45) (62, 194). Par conséquent, l’exclusion de certains constituants cellulaires pourrait également s’avérer avantageux pour le cycle réplicatif du VIH. Ici, le CD45 serait exclu des particules virales afin d’éviter l’insersion d’une protéine de trop haut poids moléculaire. La présence d’une telle protéine pourrait nuire ultérieurement à l’attachement du virus à la cellule cible. Ces phénomènes demeurent très peu compris. Une meilleure compréhension, des mécanismes d’acquisition et d’exclusion de ces constituants étrangés au virus, nous permettra de mieux comprendre la relation hôte/virus et ouvrira des portes pour le développement d’inhibiteurs du cycle viral.

Le premier objectif de cette thèse est d’identifier le ou les mécanisme(s) d’acquisition de la molécule d’adhésion ICAM-1 par le VIH-1. Une étude a démontré l’implication des protéines de l’enveloppe virale du VIH dans l’incorporation du HLA-DR. Dans ce cas, le domaine cytosolique de la gp41 interagit avec le HLA-DR lors de l’assemblage et sont, ensuite, transportés en tandem dans la particule virale (225). Les protéines Env et Gag jouent d’importants rôles lors des étapes d’assemblage et de bourgeonnement (voir la section Le cycle réplicatif du VIH-1 – Assemblage, encapsidation et bourgeonnement) (78, 82, 194, 198, 199, 222, 252, 270). L’Env est demeuré longtemps le candidat idéal pour expliquer l’insertion de constituants étrangers dans la membrane virale. Les deux protéines codées par env sont la gp120 et la gp41, tous les deux sont en étroites liaisons avec le milieu extracellulaire, où de nombreuses interactions peuvent prendre place (Figure 11D). Une étude a également démontré qu’il existe une relation entre le niveau d’expression d’une molécule de surface et la capacité du VIH à l’incorporer (210). Cette relation entre l’expression et l’incorporation de protéines d’origine cellulaire propose que l’acquisition de ces constituants suit un processus passif. Certaines approches expérimentales nous ont permis de statuer sur ce points.

La molécule d’adhésion ICAM-1 est incorporée par le VIH en lien avec son expression de surface cellulaire (3, 210). Lors de la présentation antigénique entre une cellule présentatrice de l’antigène et une cellule T, les molécules de HLA-DR et celles de l’ICAM-1 se rapprochent afin de former une région appelée la synapse immunologique (5, 30). Cette synapse origine de la fusion de radeaux lipidiques et conduit à la formation d’une structure fonctionnelle appelée « barge ». L’ICAM-1 et le HLA-DR sont conjointement regroupés dans ces structures lipidiques. Ces deux protéines sont acquises en forte concentration lors du bourgeonnement par le VIH (194, 197). Le bourgeonnement du VIH a récemment été démontré comme spécifique aux radeaux lipidiques. Il est donc pertinent de ce questionner sur le type d’interaction prenant place entre ces protéines étrangères et le VIH. S’agit-il d’une liaison directe entre une protéine de structure du VIH et la protéine étrangère ou s’agit-il plutôt d’une liaison indirecte suivant la formation d’une barge, donc dépendant de la présence de radeaux lipidiques? Plusieurs expériences ont été réalisées au cours de mon doctorat afin d’éclaircir ce point. En voici un bref aperçu. Les articles suivant ont été rédigés sur ce sujet. Virology (Volume 324, Issue 1, Pages 165-172) et dans la revue Journal of Virology Volume 78 # 21, Pages 11916-25. Ces deux articles sont retrouvés dans la présente thèse aux chapitres 2 et 3 respectivement.

L’incorporation de l’ICAM-1 par le VIH-1 suit un processus indépendant des protéines de l’enveloppe virale.

Afin d’évaluer le rôle de l’enveloppe virale dans l’incorporation de l’ICAM-1, nous avons tout d’abord transfecté les lignées 293T et 293T/Hi-ICAM-1 avec trois constructions pNL4-3 codant pour le génome du VIH. La première de ces constructions code pour la forme sauvage de NL4-3, la seconde construction est déficiente en Env (NL4-3/Env-) et la troisième porte une mutation en position 34 de la matrice (NL4-3/34VE), ce qui rend ces virus pauvres en Env, mais pas déficient (4, 79, 80). Certaines mutations au niveau du domaine MA de Gag diminuent sensiblement le niveau de l’acquisition de l’Env en interrompant l’interaction existante entre Env et Gag (79). Tel est le cas pour la mutation 34VE du plasmide pNL4-3. Ce plasmide, lorsque transfecté, produit des virus faibles en Env (environ 20% de la gp120 normalement observée sur le virus sauvage) (Tableau 3). Le ratio gp120/p24 des virus a été évalué par la technique ELISA contre la gp120 et la p24 (25, 71). Cette approche nous permet d’effectuer une comparaison des niveaux en gp120 tout en standardisant nos échantillons viraux par leur concentration en p24. Notons que l’acquisition de la gp120, pour les clones viraux sauvages et mutés en 34VE, n’est aucunement affectée par la présence ou l’absence de la molécule d’adhésion ICAM-1 (Tableau 3). Il serait bon de noter qu’une compétition aurait pu être observée entre l’ICAM-1 et la gp120. Une compétition aurait pu prendre place suivant l’absence d’interaction entre Gag et Env pour le clone 34VE. De plus, l’utilisation d’un système de transfection impliquant l’expression de niveau élevé en ICAM-1 aurait également pu favoriser une compétition. Ce phénomène aurait affectée à la baisse nos niveaux en gp120 pour les virus porteurs de l’ICAM-1. Une quantification préliminaire des niveaux de gp120 était donc essentielle à réaliser.

L’étape suivante consiste à évaluer la capacité de ces préparations virales à sélectionner l’ICAM-1. Pour arriver à nos fins, nous avons utilisé une technique d’immunoprécipitation, dans laquelle des billes magnétiques recouvertes d’anticorps anti-ICAM-1 sont employées afin de précipiter les virions porteurs de la molécule à l’étude (pour plus de détails, voir (35)). Cette technique nous permet ainsi de quantifier le nombre de virus portant à leur surface au moins une molécule d’intérêt. La mesure obtenue est considérée comme semi-quantitative. Plusieurs raisons nous ont incités à sélectionner ce système. Il permet une détection rapide et efficace des virus porteurs de la molécule étudiée et représente l’approche la plus sensible utilisée jusqu’ici (35). Par ailleurs, ce système permet une quantification exempte de contaminations en microvésicules (22). Ces contaminations sont importantes à considérer dès les premiers résultats puisque leur présence est régulièrement remise en cause dans l’interprétation de nos résultats.

Nos résultats ont démontré que l’acquisition de l’ICAM-1 suit un processus indépendant de l’Env du VIH (Figure 12A). Ces résultats suggèrent que contrairement au HLA-DR (225), l’incorporation de l’ICAM-1 n’est pas un processus nécessitant l’assemblage des protéines de l’enveloppe virale. Dans le cas du HLA-DR, son acquisition par le VIH nécessite une interaction avec la portion intra-cytoplasmique de la gp41.

Pour démontrer plus quantitativement, l’absence de lien entre l’acquisition de l’Env et celle de l’ICAM-1 par le VIH. Nous avons effectué l’analyse de lysats totaux des virions porteurs de l’ICAM-1 par immunobuvardage. Notons qu’une quantification direct des préparations virales par immunobuvardage implique la quantification d’une fraction de microvésicules contaminantes (entre 5 et 6%) (210). Ces résultats ont permis de confirmer que l’acquisition de l’ICAM-1 par le VIH est réalisée en absence de l’enveloppe virale (Figure 12B). Jusqu’alors, les études sur le sujet avaient principalement impliqué l’Env dans la majorité des processus d’acquisition des protéines de surface d’origine cellulaire.

La récupération de l’infectivité virale d’un virus pauvre en Env par l’acquisition de l’ICAM-1.

L’attachement du virus à la cellule-hôte est amorcé par l’interaction entre le CD4 et la gp120. De plus, la formation de pores de fusion nécessite le recrutement d’une quantité suffisante de CD4 et de co-récepteurs (revue dans (44)). Nous avons voulu vérifier si la présence de l’ICAM-1 pouvait remplacer un faible niveau de gp120 sur l’infectivité des particules virales. Pour expliquer cette étude, notons que la gp120 a la propriété de se libérer facilement de la membrane virale, phénomène portant le nom de shedding (revue dans (300)). Par ailleurs, la molécule ICAM-1 a la propriété d’augmenter considérablement l’infectivité virale lorsqu’elle est acquise par une particule virale saine (72, 238). Ainsi, serait-il possible d’observer une augmentation similaire de l’infectivité par l’ajout de l’ICAM-1 sur une particule virale partiellement ou complètement déficiente en Env ? Nous avons le mutant 34VE présentant un ratio gp120/p24 à 20% de la normale et un virus déficient en Env. Pour ces virus, la quantité de Env est insuffisante pour permettre une infectivité quantifiable (Figure 14) (242). La lignée cellulaire la plus sensible avec laquelle nous avons travaillée porte le nom de LuSIV. Cette dernière possède un niveau de LFA-1 similaire aux PBMCs. Nous pouvons activer le LFA-1 par l’utilisation d’acticorps non-bloquant, modifiant la configuration/conformation de cette protéine pour la molécule ICAM-1. L’infection de cellules par une préparation de virions portant à leur surface l’ICAM-1 conduit à une infection d’environ 20 fois plus importante en présence d’un LFA-1 de haute affinité (24, 148). L’infectivité virale de notre variant 34VE en présence ou en absence de l’ICAM-1 se comporte très différemment. En fait, aucun signal d’infectivité en production de p24, ni en compte RLU (par l’utilisation de lignées rapporteurs de luciférase) ne peut être obtenu. Cependant, sous l’action d’un activateur du LFA-1 (MEM-83), le virus 34VE portant à sa surface l’ICAM-1 devient suffisamment infectieux pour permettre une quantification de son infectivité (Figure 14). L’infectivité de ce clone en présence de l’activateur de LFA-1 correspond à une augmentation de quatre fois le niveau de base en absence de l’activateur. L’impact sur l’infectivité des virus portant l’ICAM-1 n’est prévisiblement pas identique entre les préparations de virus sauvages et les préparations de virus partiellement déficients en Env. L’ICAM-1 est une protéine cellulaire jouant un rôle majeur sur l’infectivité du VIH, mais cette protéine ne remplace pas les protéines de l’enveloppe du virus. Cependant, cette expérimentation démontre bien l’importance de la présence de l’ICAM-1 en surface du VIH sur l’infectivité virale dans des conditions, où l’on retrouve un niveau sous-optimal en protéines de l’enveloppe virale.

Nos résultats sont confirmés par d’autres études. Une diminution de l’expression en CD4 sur les cellules cibles du VIH conduit à une réduction de l’infectivité virale globale. Il a été démontré qu’une préparation de virus portant à leur surface l’ICAM-1 permet de pallier à un tel déficit. On récupère ainsi une infectivité virale en augmentant l’efficacité de ces virus à entrer dans des cellules moins permissives (57, 268). Dans un contexte de déficience en Env, nos résultats suggèrent donc que la présence de l’ICAM-1 permet d’augmenter le nombre de contacts ititiaux réussis entre le VIH et la cellule ciblée. Puisque l’attachement du VIH à sa cible cellulaire est considéré comme une étape limitante importante au cycle viral, nos résultats apportent donc une explication sur les stratégies employées par le VIH pour faciliter son entrée.

De prochaines investigations devraient être tentées afin d’identifier plus globalement le rôle d’autres constituants cellulaires sur l’entrée virale. Le but étant d’obtenir la contribution d’un ensemble de protéines d’origine cellulaire affectant l’entrée du VIH sur l’infectivité. En effet, l’incorporation de protéines étrangères est généralement étudiée dans un modèle mettant en évidence la contribution d’un seul candidat. Pourtant, dans des conditions in vivo, le VIH est recouvert de plusieurs constituants provenant de l’hôte. Une telle investigation offrirait la possibilité d’évaluer, par exemple, le rôle du LFA-1 et de l’ICAM-1 sur le VIH lorsque conjointement retrouvé en surface d’un même virus ou au sein d’une même population virale. D’autres questions pourraient également trouvées réponses. Le LFA-1 et l’ICAM-1 peuvent-il interagir entre eux afin de faciliter l’entrée de virus, de base non-infectieux, par un transport assisté inter-virus ? Certains complexes entre protéines étrangères peuvent-ils bloquer l’entrée du VIH en provoquant de l’encombrement stérique ? Il s’agit d’expériences plutôt simples à réaliser et qui permettraient d’approfondir nos connaissances sur la dynamique de l’entrée du VIH.

La variation de l’expression de l’ICAM-1 suivant l’infection par le VIH-1.

On retrouve dans le plasma de la majorité des patients séropositifs une quantité croissante de molécules d’adhésion en circulation (protéines libres) (258) Mentionnons, entre autre, la présence des formes solubles en ICAM-1 et en VCAM-1. De plus, une correspondance a été observée entre les niveaux en ICAM-1 et la progression de l’infection par le VIH (84). L’expression de surface cellulaire (endothéliales et leucocytes) en ICAM-1 est également haussée lors de la progression de l’infection par le VIH (171, 176, 223). D’autres protéines sont également retrouvées régulées à la hausse en cours d’infection par le VIH. Notons les antigènes suivant : la chaîne alpha du LFA-1, le CCR5 et le CD63 (171, 175, 176). Des niveaux élevés en cytokines pro-inflammatoires, telles que TNF-alpha et IL-1bêta, ont également été détectés chez les patients séropositifs. Or, ces deux dernières cytokines contribuent à l’augmentation de l’expression de l’ICAM-1 (146). D’autres protéines auraient également la propriété d’augmenter le niveau d’expression de l’ICAM-1 en surface des cellules endothéliales. En effet, les protéines Tat et gp120, retrouvées à différents stades du cycle viral du VIH, augmentent l’expression de l’ICAM-1 (55, 234). Or, aucune investigation ne s’est jusqu’alors intéressée à comparer, en cours d’infection, le type de protéines cellulaires et leur nombre acquis par le VIH. Notons qu’une étude a démontré l’existence d’un lien directe entre le niveau d’expression de l’ICAM-1 à la surface de la cellule productrice de virions et le nombre de molécules d’adhésion retrouvées en surface de ces derniers (210). Pourrions-nous ainsi développer une technologie nous permettant d’évaluer l’avancer ou la régression de l’infectivité par le VIH suivant l’analyse des protéines retrouvées en surface des virions ? Par exemple, une très forte concentration en ICAM-1 serait considéré comme un stade plus avancé de l’infection par le VIH qu’une quantitée plus faible en cette même protéine. De plus, certaines protéines cellulaires pourraient être considérées comme meilleurs marqueurs selon les considérations techniques et biologiques. Les protéines d’origine cellulaire ont déjà été utilisées afin d’identifier les lignées cellulaires infectées par le VIH. Aujourd’hui, les techniques de purifications et d’analyses sont plus avancées et plus rapides que dans le passé, ce qui donne des arguments en faveur du développement d’une telle approche.

L’incorporation de l’ICAM-1 par le VIH-1 suit un processus dépendent de son interaction avec Pr55Gag.

L’incorporation de l’ICAM-1 par le VIH suit un processus différent de celui emprunté par le HLA-DR et par l’Env. De ce fait, nous avons voulu éclaircir le mécanisme d’acquisition propre à cette protéine en modifiant la structure de cette dernière. Les seules protéines virales en surface du VIH sont la gp120 et la gp41. Or nous avons préalablement démontré que ces deux protéines n’ont aucun rôle à jouer dans la sélection de l’ICAM-1 (16). Par conséquent, nous nous sommes tournés vers les domaines transmembranaire et intra-cytoplasmique de l’ICAM-1 offrant de nombreuses possibilités d’interactions. In vivo, l’ICAM-1 interagit avec certains constituants du cytosquelette d’actine corticale par sa courte portion intra-cytoplasmique (37). Plus précisément, l’ICAM-1 interagit avec l’ezrine qui, à son tour, interagit avec la F-actine (112). Une autre étude indique que l’ICAM-1 interagit avec les radeaux lipidiques (280). Selon cette étude, ces radeaux auraient la propriété de recruter la molécule d’adhésion au site de contact entre deux cellules pour renforcir le lien entre ces partenaires cellulaires. Cependant, il n’existe pas de démonstration d’un lien pouvant exister entre les radeaux lipidiques et le cytosquelette dans le recrutement de l’ICAM-1.

Parallèlement, la voie naturelle de bourgeonnement du VIH prend place au niveau des radeaux lipidiques et explique, entre autre, l’acquisition de certaines protéines cellulaires (i.e. CD55 et CD59) (194). Afin d’éclaircir laquelle de ces hypothèses s’applique à l’ICAM-1 (acquisition par le lien avec le cytosquelette ou acquisition suivant sa localisation dans les radeaux lipidiques), nous avons développé certains variants moléculaires de la protéine. Une forme délétée de sa portion intra-cytoplasmique, afin de former la construction ICAM-1/ΔCyt, et une forme dans laquelle on retrouve une délétion des domaines transmembranaire et intra-cytoplasmique. De ce variant, un groupement fonctionnel glycosylphosphatidylinositol (GPI) a permis la formation de l’ICAM-1/GPI (37). Les protéines portant un domaine GPI sont retrouvées au niveau des radeaux lipidiques (194). Les deux constructions moléculaires de l’ICAM-1 sont représentées à la Figure 15A.

L’objectif premier a été de vérifier si les modifications apportées à la protéine affectent son acquisition par le VIH. Afin d’évaluer le niveau d’incorporation en ICAM-1, nous avons utilisé une technique d’immunoprécipitation avec billes magnétiques tel que préalablement décrite (35).

La délétion de la portion intra-cytoplasmique de l’ICAM-1 a conduit à une chute de la capacité d’incorporation par le VIH (Figure 15C). Ce résultat démontre que la région cytoplasmique de l’ICAM-1 est impliquée dans la sélection de cette protéine par le VIH.

Cette habileté du virus à sélectionner l’ICAM-1 est récupérée suivant sa localisation au niveau des radeaux lipidiques (ICAM-1/GPI). Afin d’approfondir ce résultat, des tests d’infection ont été réalisés avec les populations virales ainsi produites. Cette approche permet une quantification plus juste de l’incorporation de l’ICAM-1 en comparaison à l’immunoprécipitation qui reste une technique semi-quantitative (72, 73). Nous avons ainsi infecté des cellules primaires (PBMCs) avec un virus rapporteur portant ou non à sa surface les différentes constructions moléculaires de l’ICAM-1 (ICAM-1/sauvage, ICAM-1/ΔCyt et ICAM-1/GPI). L’utilisation de cellules du sang périphérique (PBMCs) apporte une représentativité expérimentale plus physiologique que les lignées cellulaires. D’autre part, l’utilisation du clone viral rapporteur facilite la quantification des résultats et apporte une sensibilité accrue des donnés de l’infectivité. Cette série d’investigations a permis de confirmer les résultats préalablement obtenus (Tableau 4). Nous avons ainsi démontré que la portion cytoplasmique de l’ICAM-1 joue un rôle central dans son acquisition par le VIH. Nous avons également confirmé ces résultats par l’immunobuvardage de lysats totaux de nos préparations de virus (Figure 15D).

Une hypothèse secondaire a été soulevée sous la base des résultats obtenus. Nous avons proposé que la molécule d’adhésion ICAM-1 serait relocalisée loin du ou des sites de bourgeonnement par le clivage de son domaine cytoplasmique. Afin de tester cette hypothèse, nous avons effectué une série d’expériences par microscopie confocale. Cette technique a l’avantage d’offrir une suite d’images sur lesquelles des évènements de co-localisation peuvent être appréciés. Nous avons ainsi vérifié s’il y avait co-localisation entre le site de bourgeonnement du VIH et les constructions moléculaires de l’ICAM-1 (116). Les résultats obtenus ont permis d’apprécier des différences importantes entre les constructions de l’ICAM-1/sauvage et de l’ICAM-1/ΔCyt. En effet, plus de 75% de l’ICAM-1/sauvage co-localise avec le site de bourgeonnement du VIH pour seulement 20% de l’ICAM-1/ΔCyt. Cette dernière possède un profil de localisation plutôt diffus (Figure 16). La construction ICAM-1/GPI possède, pour sa part, un profil de localisation similaire à notre forme sauvage. Ce résultat indique l’efficacité de cette construction pour se localiser spécifiquement au site de bourgeonnement du VIH (194). L’hypothèse que nous avions alors soulevée s’est avérée juste; le clivage de la portion cytosolique de l’ICAM-1 conduit à la diffusion de la protéine. Dans ce cas, l’acquisition n’est possible que passivement et semble peu efficace lorsque comparée à l’acquisition de la forme sauvage de l’ICAM-1.

La localisation d’une protéine au site de bourgeonnement est une condition essentielle à son acquisition par le VIH. Le mécanisme employé à cette fin peut être passif ou actif dépendamment d’un lien avec les protéines virales ou de certains constituants privilégiés par le VIH. Certaines études ont tenté de différencier avec précision les mécanismes passifs et actifs d’acquisition des constituants de l’hôtes retrouvés en surface du VIH. Leur principale hypothèse se basait sur le principe suivant : dans un contexte d’acquisition passive, la proportion de protéines retrouvées en surface du VIH devrait être proportionnelle à celle retrouvée en surface de la cellule productrice, alors que dans un context d’acquisition active, la proportion de protéines retrouvées sur le VIH devrait être supérieure à celle de la cellule productrice (106, 107). Par ailleurs, ces études proposent une relation équimoléculaire entre la protéine étrangère acquise et l’un des précurseurs du VIH. Suivant cette logique, ils ont démontré que la majorité des protéines étrangères seraient acquises passivement à moins de 1% du précurseur Gag. Ces deux études ont plusieurs faiblesses. Ils ne considèrent pas le fait que la majorité des protéines de surfaces cellulaires ne soient pas uniformément distribuées et que leur proportion risque d’être fortement modifiée au site de bourgeonnement viral. De plus, ces études ont évité d’impliquer certaines protéines d’intérêt telle que l’ICAM-1, le HLA-DR et le CD55 tous fortement retrouvés acquises par le VIH. Prenons pour exemple les deux protéines les plus étudiées par notre équipe de recherche : l’ICAM-1 et le HLA-DR. La composition en HLA-DR à la surface des préparations virales compterait pour plus de 20% des protéines totales (113), alors que la composition en ICAM-1, présentée sous la forme de ratio molaire p24 : ICAM-1 avoisinerait les 7 : 1 (environ 15% de la composition virale en p24) (36). Suivant la même logique des études préalablement décrites, les niveaux retrouvés en HLA-DR et en ICAM-1 acquis par le VIH permettent de confirmer que ces deux constituants sont incorporés activement par le VIH. Cependant, selon nous, la microscopie confocale permet d’observer plus directement et avec moins de biais une acquisition active.

Afin d’identifier l’existence d’interactions entre l’ICAM-1 et le VIH, nous avons employé une approche basée sur les techniques d’immunocapture et d’immunoprécipitation. Cette approche permet la récupération des virus porteurs de l’ICAM-1 (formes sauvage ou modifiée) par l’utilisation d’anticorps fixés sur une matrice solide, autre que des billes magnétiques – une plaque de 96 puits.

Notons que l’immunocapture en plaque est environ deux fois moins sensibles que l’immunocapture à billes magnétiques. Cependant, la technique en plaque permet une évaluation beaucoup plus rapide d’un nombre important d’échantillons. Par ailleurs, l’ensemble des échantillons sont traités simultanément ce qui réduit considérablement les erreurs de manipulation et par conséquent les écarts types. Cela fait de cette approche, une méthode de choix pour la détection rapide de plusieurs échantillons. Les applications de cette technique sont assez nombreuses. Sur une même matrice solide, nous pouvons analyser jusqu’à cinq échantillons incluant le contrôle isotypique. Cette technique devient donc un outil intéressant pour le dépistage rapide des protéines d’origine cellulaire. D’un point de vue plus fonctionnel, nous pouvons également utiliser cette approche afin d’évaluer certains changements conformationnels de protéines. En effet, les premières étapes de l’entrée du VIH conduisent à des changements conformationnels de la gp120 afin de permettre la fixation de cette dernière aux co-récepteurs du virus. Plusieurs anticorps ont été développés et peuvent fixer la gp120 sous ses différentes conformations. L’utilisation de l’immunocapture en plaque permettrait donc ici d’effectuer un suivit rapide et efficace de tous changements de conformation de la gp120. Il existe également plusieurs anticorps dirigés contre le LFA-1. Cette protéine peut être retrouvée sous une forme active ou inactive. Ici encore, plusieurs anticorps, pouvant être utilisés par notre technique d’immunuprécipitation, ont été conçus pour reconnaître ces changements structuraux.

L’un des résultats importants de notre étude a été l’identification d’une protéine virale liée à l’ICAM-1/sauvage dans des conditions, où cette intéraction ne pouvait être observée pour la forme ICAM-1/GPI. Puisqu’incorporée à un niveau similaire à l’ICAM-1/sauvage l’unique différence entre cette dernière et l’ICAM-1/GPI consiste à leur liaison respective à la cellule. L’ICAM-1/GPI est inséré dans un radeau lipidique, il s’agit donc d’une interaction hydrophobe, alors que l’ICAM-1/sauvage est lié à un constituant cellulaire, le cytosquelette d’actine. Ainsi, nous avons refait l’expérience, mais cette fois en impliquant également la préparation de virus portant à leur surface l’ICAM-1/GPI. Nous avons obtenu le résultat suivant. Dans les conditions où l’ICAM-1/sauvage fixe la p24 ou l’un des précurseurs de Gag, l’ICAM-1/GPI ne participe à aucune interaction avec le virus. Ce résultat suggère fortement en l’existence d’une interaction entre l’ICAM-1/sauvage et le VIH.

Afin d’identifier le partenaire immunoprécipité avec l’ICAM-1/sauvage, l’échantillon a été analysé par immunobuvardage. Une protéine de 55 kDa correspondant à Gag a été obtenue (Figures 17 et 18). Cependant, le signal de co-immunoprécipitation observé est relativement faible et ne permet pas de conclure définitivement en la présence d’une interaction. Gag est presqu’exclusivement retrouvé au niveau de particules virales immatures. Puisque l’ensemble de nos travaux sont réalisés avec des virus matures, nous avons tenté d’augmenter la concentration en Gag en bloquant la maturation virale à l’aide d’un inhibiteur de la protéase virale (114, 210). Cet inhibiteur permet de bloquer l’étape de maturation des précurseurs Gag et Gag/Pol, ce qui augmente leur concentration au sein des particules et ce, sans affecter significativement la production virale. L’expérience a donc été reproduite en utilisant ces préparations de virus immatures (Figure 18B).

Dans ces conditions, la précipitation de la forme sauvage de l’ICAM-1 a permis la récupération d’une quantité plus significative en Gag. Une seconde protéine de 49 kDa a également été récupérée et semble correspondre à l’un des précurseurs de Gag (MA-CA-P2-NC) (Figure 7). Les interactions observées sont stables puisqu’elles ont supporté le traitement au détergent dans des conditions peu permissives (301). Nos résultats suggèrent que le domaine responsable de l’acquisition de l’ICAM-1 soit partagé entre Gag et le produit partiellement clivé p49. La suite logique à notre investigation est donc de déterminer lequel des domaines partagés entre Gag et p49 (MA-CA-p2-NC) est responsable de la sélection de l’ICAM-1. L’une des difficultés de cette approche est de perdre toute production virale en retirant un domaine crucial au virus. Par exemple, le retrait de la NC diminue la production de p24. De plus, la MA est essentielle à la formation de la particule virale, donc le retrait de ce domaine conduit à une perte de la production virale. Ces obstacles pourraient rendre l’investigation plus lourde. Une alternative est d’identifier les résidus responsables de l’acquisition de l’ICAM-1 par le VIH. L’ICAM-1 possède une courte queue cytoplasmique. Par mutation ponctuelle, il serait simple de parcourir cette région en remplaçant à tour de rôle chacun de ses résidus par un acide aminé neutre comme la glycine. Cependant, encore ici une difficulté est à considérer. En effet, l’ICAM-1 ne possède pas de groupement fonctionnel structuré et conservé, sa queue intra-cytoplasmique est plutôt constituée de groupements chargés. Il devient ainsi difficile d’identifier la région mise en cause sachant qu’un ensemble de résidus possiblement éloignés participent à l’interaction. Éventuellement, résoudre ces quelques difficultés permetterait l’identification précise des sites responsables de la sélection de l’ICAM-1.

Il a été démontré au cours des dernières années que l’ICAM-1 et Gag interagissent tous deux avec le cytosquelette d’actine (37, 158, 235, 295). La preuve de l’existence d’une l’interaction entre Gag et les filaments d’actine a été obtenue suivant l’utilisation d’inhibiteurs de la polymérisation de l’actine tel que la cytochalasine D. Le traitement de cellules infectées par le VIH à l’aide de cet inhibiteur conduit à une chute de la production virale (revue dans (50)). Le cytosquelette d’actine permet le déplacement de l’ICAM-1 en surface des cellules productrices. Durant le bourgeonnement du VIH, l’ICAM-1 est recruté à des sites co-localisant avec la gp120. Ces résultats suggèrent que les précurseurs immatures Gag retrouvés en forte concentration aux sites d’assemblage du VIH et nécessitant le cytosquelette recrutent indirectement l’ICAM-1 (voir Incorporation des molécules de l’hôte par le VIH-1 -- Mécanismes plausibles de sélection ou d’exclusion de protéines de l’hôte). Ainsi, notre hypothèse propose la formation d’un complexe « ICAM-1—Actine et (ezrine)—Gag » au site d’assemblage (Figure 19B).

À plusieurs reprises, nous avons tenté d’identifier, par immunobuvardage, la présence d’un tel complexe. La présence d’ezrine et d’actine au sein de particules virales infectieuses a été récemment démontrée (102, 204, 205). Pour nous, il s’agissait d’un élément clé important apportant un élément de réponse sur l’existence d’un complexe « ICAM-1—Ezrine—Actine—Gag ». Cependant, malgré de nombreux essais, nous n’avons jamais pu déceler la présence d’actine, ni d’ezrine chez nos particules infectieuses. Nos protocoles de production et de purification virales diffèrent de ceux utilisés lors des études préalablement présentées. Ces différences pourraient expliquer la présence de certaines contaminations en microvésicules ou en débris non-spécifiques (22). Il demeure ainsi probable que l’acquisition de l’ICAM-1 provienne d’une interaction directe entre la portion cytosolique de cette dernière et le constituant viral Gag. Cependant, l’absence d’autres résultats sur l’existence d’un complexe ne nous permet pas de conclure autrement. D’autres tentatives devrons être réalisées. Par exemple, de nouveaux anticorps plus sensibles pourraient être utilisés dans un protocole d’immunoprécipitation. Nous pourrions, également, effectuer nos productions virales dans les mêmes conditions que celles réalisées par l’équipe préalablement présentée. Sommes toutes, l’hypothèse de l’existence d’un complexe « ICAM-1—Ezrine—Actine—Gag » demeure et de nouvelles investigations devrons être débutées afin de la démontrer.

Notons qu’environ le quart des protéines acquises par le VIH ont été identifiées comme pouvant lier le cytosquelette d’actine (Tableau 2). Parmis ces protéines, six d’entre elles peuvent lier les ERM, dont l’ICAM-1, le CD43, le CD44 et le CD62L (112, 126, 285, 306). Ce type d’observations plus globales proposent que le cytosquelette d’actine est un élément clé à l’acquisition de constituants étrangés par le VIH. Cette hypothèse nous rapporte à l’existence d’un complexe protéique ICAM-1—Ezrine—Actine—Gag. L’ezrine n’est pas un partenaire pour l’ensemble des protéines préalablement énumérées interagissant avec l’actine. Cependant, il a récemment été démontré que l’ezrine a un rôle à jouer sur le cycle viral du VIH. En effet, une étude a démontré l’existence d’une interaction entre l’ezrine et la gp120 (111). Nous pourrions ainsi envisager de cibler le transcrit codant pour l’ezrine afin d’observer l’implication de cette protéine sur l’acquisition de protéines étrangères par le VIH.

Certains résultats préliminaires ont été récemment obtenus. Ces résultats semblent indiquer l’existence d’un lien entre la MA, sous sa structure mature et l’ICAM-1. Ces deux protéines sont localisées dans des régions juxtaposées au niveau de la particule virale (directement sous la membrane lipidique). Il y aurait ainsi recrutement direct ou indirect de l’ICAM-1 par Gag et, suivant la maturation du virus, le lien entre la Ma et l’ICAM-1 serait conservé. Il s’agit d’un modèle hypothétique fort intéressant. Cependant la démonstration d’un lien entre la MA et l’ICAM-1 s’avère des plus complexes. En effet, la MA est sans aucun doute la protéine structurale du virus la plus délicate à modifier. Certains résidus sont responsables de l’assemblage, d’autres sont responsables de la localisation du site de bourgeonnement. En fait, il n’existe aucun modèle moléculaire ne permettant la modification de la matrice du VIH dans des cellules humaines sans en affecter considérablement la production virale.

La grande majorité des expériences réalisées au cours de mon doctorat ont mis en cause la transfection de lignées cellulaires 293T. Quoique ce système soit simple d’utilisation, efficace et reproductible, la production virale sur 293T ne reflète pas toutefois les conditions physiologiques dans lesquelles le VIH se réplique in vivo. Ainsi, il serait profitable de valider nos résultats dans un système plus physiologique qui mettrait en cause des cellules primaires, en l’occurrence des lymphocytes T CD4+ purifiés ou encore des monocytes/macrophages. L’approche suggérée consiste à immunoprécipiter des virus, amplifiés sur des cellules primaires, à l’aide d’anticorps dirigés contre l’ICAM-1. Par la suite, il suffit d’observer la présence ou l’absence de Gag et de MA co-immunoprécipités. L’utilisation d’une protéase virale pourrait être nécessaire afin d’identifier le précurseur Gag pour des raisons préalablement présentées. La difficulté première de cette approche consiste à l’élaboration d’un contrôle approprié. En effet, dans des conditions physiologiques, nous ne pouvons trouver de variants moléculaires liant indépendamment le cytosquelette d’actine et les radeaux lipidiques. Ainsi, il nous faut choisir une protéine interagissant exclusivement avec les radeaux lipidiques et qui est retrouvée incorporée par le VIH. Ce contrôle permet d’évaluer l’efficacité de nos traitements au détergent. Certains marqueurs membranaires sont fréquemment employés dans ce but incluant les protéines GM-1 et CD55.

Finalement, à ma connaissance, aucune étude n’a été réalisée sur les mécanismes d’acquisition de constituants étrangés par le VIH chez les monocytes/macrophages. Il a été récemment démontré qu’il existe de nombreuses différences entre le bourgeonnement du VIH de cellules T et de monocytes/macrophages (217, 230). Par conséquent, ces différences pourraient apporter de précieuses informations sur l’acquisition de protéines de l’hôte par le VIH.

La présence de l’ICAM-1 en surface des virions augmente leur résistance à l’action inhibitrice du T-20

Une classe d’inhibiteurs contre le VIH a récemment vue le jour. Le seul membre de cette classe approuvé pour la thérapie est le T-20, également connu sous le nom de enfuvirtide. Cet inhibiteur a la propriété de bloquer la fusion du VIH avec une grande efficacité (103). Cependant, l’efficacité du T-20 s’avère considérablement variable (ΔCI50 de plus de 2,5 log10) lorsque comparée à celle d’autres inhibiteurs (145). Quelques rares études se sont intéressées à ce phénomène. Deux déterminants de la variabilité d’efficacité du T-20 ont ainsi été découverts. Le premier déterminant provient de la variation de la séquence cible du T-20. En effet, la présence de mutations dans la région HR1 de la gp41 provoque une variation de l’efficacité du T-20 (53, 237, 292). Le second déterminant provient des différences en densités et affinités des co-récepteurs du VIH : CXCR4 et CCR5. Ces variations en co-récepteurs provoquent des changements de la cinétique d’attachement et d’entrée du virus ce qui rend ce dernier plus susceptible ou plus résistant à l’action du T-20 (232). Ces deux déterminants ne peuvent expliquer à eux seuls l’ensemble des variations d’efficacité observées (ΔCI50 de plus de 2,5 log10).

Le deuxième objectif de cette thèse a été d’évaluer le rôle de l’ICAM-1 acquis par le VIH sur l’efficacité du T-20. Voici quelques raisons afin d’expliquer le choix de l’ICAM-1 pour cette étude. 1- L’ICAM-1 est acquis par des souches virales de laboratoire et cliniques pour différents tropismes (14, 25, 34, 36, 76), 2- l’ICAM-1 est la protéine cellulaire qui augmente le plus l’infectivité du virus qui le porte en facilitant l’attachement et l’entrée du virus (72, 73, 278), 3- l’ICAM-1, lorsqu’acquis par le VIH, confère une résistance à la neutralisation par des anticorps dirigés contre la gp120 (71).

La majorité des études réalisées sur les déterminants affectant l’efficacité du T-20 ont impliquées un système peu physiologique. Afin d’améliorer cet aspect expérimental, nous avons décidé d’initier notre projet dans des conditions plus physiologiques. Or, nous avons infecté des cellules PBMCs de donneurs sains, prétraitées ou non au T-20, avec des préparations virales de différents tropismes. Les préparations virales proviennent d’isolats de laboratoire (NL4-3 (X4) et JR-CSF(R5)) et d’isolats cliniques (92HT599 (X4) et 92US657 (R5)). Le choix de ces isolats s’explique par leur efficacité et leur rapidité à infecter des cellules primaires.

Nous avons, tout d’abord, évalué la TCID50 sur les PBMCs pour chaques préparations virales. Déterminer la TCID50 a pour but d’uniformiser l’infectivité de nos préparations virales afin d’entreprendre l’évaluation de la CI50. Cette dernière consiste a quantifié l’infectivité virale par dosage de la p24 en fonction d’une dose croissante d’inhibiteur (sur une échelle logarythmique). Quoiqu’efficace et rapide, cette approche est relativement peu précise et limitée en replicata. Notre contrôle consiste a remplacé l’inhibiteur T-20 par un autre inhibiteur qui lui, cible une étape plus tardive du cycle virale. Pour les besoins de l’expérience, nous avons choisi l’AZT. Nous avons ainsi démontré que la présence de l’ICAM-1 en surface du VIH interfère avec l’action du T-20. Nos résultats démontrent qu’un virus portant l’ICAM-1 est environ deux fois moins sensible à l’action du T-20 qu’un virus qui en est déficient (Figures 20 et Tableau 5). L’expérience a également été réalisée suivant le traitement des PBMCs par un activateur du LFA-1, le MEM-83 (24, 148). Nos résultats ont démontré qu’en présence d’un LFA-1 activé, un virus portant l’ICAM-1 est environ quatre à cinq fois moins sensible à l’action du T-20 qu’un virus qui en est déficient (Figure 22).

La production de virus par transfection de 293T s’avère fort utile et rapide principalement afin de produire des variants de virus ne se différenciant que par la présence ou l’absence d’une seule protéine. Cependant, cette approche nous éloigne un peu de notre objectif premier, soit de travailler dans des conditions les plus physiologiques possibles. Pour se rapprocher de cet objectif, nous avons utilisé deux isolats cliniques de différents tropismes, 92HT599 (X4) et 92US657 (R5). Pour évaluer le rôle de l’ICAM-1 sur l’action du T-20, nous avons incubé nos cellules primaires avec ou sans un anticorps bloquant dirigé contre le LFA-1 (15). Bloquer le LFA-1, nous a permis d’augmenter la sensibilité de nos virions à l’action du T-20 d’environ deux à 5 fois (Tableau 6). Par conséquent, dans des conditions physiologiques, l’ICAM-1 joue un rôle sur la résistance du VIH à l’action du T-20.

L’utilisation d’un anticorps bloquant n’est certainement pas la meilleur approche pour annuler l’effet d’une protéine de surface. Plusieurs de ces protéines risques de ne pas être bloquées. Par ailleurs, le domaine Fc de l’anticorps bloquant le LFA-1 n’est pas inerte et risque de modifier le cours de l’infection. Quoique pour cet aspect de l’expérience, nous avons un contrôle négatif isotypique. Un autre aspect de l’expérience est à considérer. Bloquer directement la protéine retrouvée en surface du VIH est généralement à éviter. C’est la raison pour laquelle nous n’avons pas utilisé d’anticorps bloquant l’ICAM-1. Bloquer le contre-récepteur de l’ICAM-1, soit LFA-1 n’est pas non plus sans conséquence. En effet, le LFA-1 peut fixer les protéines ICAM-1, -2 et -3 à des régions structurales juxtaposées. Donc, bloquer le LFA-1 revient à éliminer les interactions avec ces protéines qui peuvent tous avoir un rôle à jouer sur l’action du T-20. Le LFA-1 lui-même pourrait également avoir une rôle à jouer sur l’action du T-20. Ainsi, les résultats que nous avons obtenus avec les isolats cliniques sont certainement surévalués puisque ne tenant pas compte des autres partenaires de LFA-1 et du LFA-1 lui-même. Cependant, la pertinence de cette découverte n’en est pas pour autant affaiblie, puisqu’il est question de la contribution des protéines étrangères sur l’action du T-20 et que dans ce cas, nous avons déterminé une approche pouvant éliminer l’effet de plusieurs candidats simultanément.

Nous avons, par la suite, essayé de déterminer le mécanisme utilisé par les virus portant à leur surface l’ICAM-1 sur l’action du T-20. Il a été démontré que le T-20 ne peut inhiber la fusion virale qu’entre l’attachement du virus au CD4 et son attachement au co-récepteur (86, 177). Nous avons donc développé une technique permettant d’évaluer la cinétique de fusion dans les conditions les plus physiologiques concevables. Nous avons ajouté de façon progressive sur une échelle de temps une quantité bloquante de T-20 (CI95) à des PBMCs pré-infectées. Nous avons ainsi démontré qu’un virus portant l’ICAM-1 est moins vulnérable à l’action du T-20 lorsqu’ajouté 120 minutes après le début de l’infection (Figure 23). Nos résultats suggèrent que la fixation au co-récepteur du virus portant l’ICAM-1 est plus rapide que celui qui en est déficient. Ce phénomène a pour conséquence une réduction de la fenêtre de temps durant laquelle l’inhibiteur est actif. Une autre étude a récemment confirmer, à l’aide d’un système rapporteur, nos résultats en démontrant qu’un virus portant l’ICAM-1 fusionne plus rapidement qu’un virus qui en est dépourvu (278).

Quelques molécules ont été développées au cours des dernières années afin de cibler et bloquer l’interaction ICAM-1/LFA-1. Parmi ces molécules, le BIRT377 est toujours en étude clinique et présente un avenir prometteur en thérapie (6). Nos résultats démontrent bien que la présence de l’ICAM-1 en surface du VIH confère à ce dernier une résistance au T-20. La même expérimentation qu’effectuer avec les isolats cliniques, pourrait être reproduite avec le BIRT377 en remplacement de l’anticorps MEM-25. Reproduire nos résultats avec le BIRT377 pourrait signifier son utilisation en clinique contre le VIH afin d’augmenter l’efficacité de la thérapie au T-20.

Il existe d’autres protéines de surface du VIH pouvant potentiellement affecter l’efficacité du T-20. Parmi ces protéines, nous retrouvons le HLA-DR, le CD44 et le LFA-1. Ces trois protéines peuvent augmenter l’infectivité du virus qui le porte possiblement par l’accélération de la cinétique d’entrée et/ou de fusion. Il serait donc intéressant d’évaluer le rôle de ces différentes protéines sur l’action du T-20. La contribution des protéines étrangères sur le VIH pourrait bien expliquer la variabilité résiduelle de l’action du T-20 (en dehors de la région HR1 et des co-récepteurs) entre les différents isolats cliniques analysés.

Éventuellement, d’autres inhibiteurs de fusion sont actuellement en développement. Le T-1249 risque d’être le prochain inhibiteur de fusion à être approuvé en thérapie. Encore là, toutes protéines d’origine cellulaire retrouvées en surface du virus et accélérant la cinétique de fusion, risques d’augmenter la résistance de ces virus à l’action d’inhibiteurs de fusion. Il serait toutefois important d’évaluer le rôle de ces constituants étrangers sur l’action de ces nouveaux inhibiteurs et surtout d’observer les variations que ces protéines étrangères peuvent apporter sur ces inhibiteurs.

© Yannick Beauséjour, 2005