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Annexe A Préparation des milieux utilisés pour le double-hybride chez la levure

Milieu YPAD liquide (pour 700 ml) :

Bacto-peptone (Difco) 14.0 g

Extrait de levure (Difco) 7.0 g

Adénine hémisulfate (Sigma) 70.0 mg

Compléter avec de l’eau millipore à 650 ml

(Pour milieu solide, ajouter 10.0 g de Bacto-agar (Difco)).

Autoclaver à 121°C pendant 15 min, puis ajouter :

D(+)-glucose (Sigma) 40% stérile 35 ml

Eau millipore stérile 15 ml

Storage à l’obscurité à la température de la pièce.

Milieu SD/-Leu/-Trp (pour 700 ml) :

Base azotée de levures sans aa 4.69 g

Mélange d’aa #1 578 mg

Mélange d’aa #2 224 mg

Mélange d’aa #3 (-Leu/-Trp) 49 mg

Compléter avec de l’eau millipore à 650 ml

Ajuster le pH à 5.6 - 5.7.

Bacto-agar (Difco) 11.7 g

Autoclaver à 121°C pendant 15 min, puis ajouter :

D(+)-glucose 40% stérile 35 ml

Eau millipore stérile 15 ml

Storage à l’obscurité à 4°C.

Milieu SD/-Leu/-Trp/-Ade (pour 700 ml) :

Base azotée de levures sans aa 4.69 g

Mélange d’aa #1 578 mg

Mélange d’aa #2 224 mg

Histidine (Sigma) 17.5 mg

Complèter avec l’eau millipore à 650 ml

Ajuster le pH à 5.6 - 5.7

Bacto-agar (Difco) 11.7 g

Autoclaver à 121°C pendant 15 min, puis ajouter :

D(+)-glucose 40% stérile 35 ml

Eau millipore stérile 15 ml

Storage à l’obscurité à 4°C.

Milieu SD/-Leu/-Trp/-His + 4 mM 3-AT pour (700 ml) :

Base azotée de levure sans aa 4.69 g

Mélange d’aa #1 578 mg

Mélange d’aa #2 224 mg

Adénine hémisulfate (Sigma) 28 mg

Compléter avec de l’eau millipore à 650 ml

Ajuster le pH à 5.6 - 5.7

Bacto-agar (Difco) 11.7 g

Autoclaver à 121°C pendant 15 min, puis ajouter :

D(+)-glucose 40% stérile 35 ml

Eau millipore stérile 15 ml

À T° environ 55°C, ajouter 2.8 ml de 3-AT (1 M)

Storage à l’obscurité à 4°C.

Milieu SD/-Leu/-Trp + X-Gal (pour 700 ml) :

Base azotée de levures sans aa 4.69 g

Mélange d’aa #1 578 mg

Mélange d’aa #2 224 mg

Mélange d’aa #3 (-Leu/-Trp) 49 mg

Compléter avec de l’eau millipore à 650 ml

Ajuster le pH à 5.6 - 5.7.

Bacto-agar (Difco) 11.7 g

Autoclaver à 121°C pendant 15 min, puis ajouter :

Tampon phosphate 0.7 M (pH 7.0) 70 ml

D(+)-glucose 40% stérile 35 ml

À T° environ 55°C, ajouter 1.4 ml de X-Gal (20 mg/ml)

Storage à l’obscurité à 4°C.

Mélange d’aa (Sigma):

3-Amino-1,2,4-Triazole (3-AT) 1 M :

3.3632 g de 3-AT (Sigma) dans 40 ml d’eau millipore.

Stérilisation par filtration et storage à -20°C.

Tampon phosphate 0.7 M, pH 7.0 :

(A) 0.7 M K2HPO4 : 48.77 g dans 400 ml d’eau (basique).

(B) 0.7 M KH2PO4 : 38.105 g dans 400 ml d’eau (acide).

Mélanger (A) et (B) jusqu’à l’obtention d’un pH de 7.0. Stérilisation par filtration et storage à 4°C.

X-Gal (20 mg/ml):

200.0 mg de 5-Bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactoside (Sigma) dans 10.0 ml de diméthylformamide (DMF). Storage à l’obscurité à -20°C.

© Cherifa Ayari, 2005