Collection Mémoires et thèses électroniques
AccueilÀ proposNous joindre

Chapitre 1 Introduction

Table des matières

Connu sous le nom de « post-transcriptional gene silencing » (PTGS) chez les plantes (Baulcombe, 1996; Hammond et al., 2001a; Ingelbrecht et al., 1994), « quelling » chez les champignons (Cogoni et al., 1994; Romano and Macino, 1992) et interférence à l’ARN (iARN) dans le règne animal (Fire et al., 1998), ce phénomène a été initialement découvert chez la pétunia. En 1990, le généticien Richard Jorgensen a observé ce processus, tout à fait par hasard, lors de l’injection de l’ARN codant pour le gène responsable de la coloration mauve chez la fleur afin d’augmenter la synthèse du pigment (l’anthocyanine). Cette intervention a plutôt eu l’effet inverse, générant des fleurs à pétales blanches. Le phénomène par lequel l’introduction d’un deuxième exemplaire d’un gène dans un génome mène à la répression de l’expression du gène endogène a été nommé co-suppression (Jorgensen et al., 1996; Napoli et al., 1990).

Ce n’est qu’en 1998 que les travaux d’Andrew Fire, Craig Mello et leurs collègues ont mis en évidence ce processus chez le nématode Caenorhabditis elegans (C. elegans), où l’introduction d’ARN double-brin (ARNdb) pouvait réduisait l’expression du gène correspondant de manière ciblée (Fire et al., 1998). Deux ans plus tard, des chercheurs du « Massachussetts Institute of Technology » (MIT) démontraient que de petits ARN interférents d’environ 19 à 21 nucléotides (nt), provenant du clivage de long ARNdb, sont les effecteurs de l’iARN (Zamore et al., 2000).

À ce jour, iARN constitue un mécanisme ancestral très conservé chez les eucaryotes et représente un mode de régulation de l’expression génique. C’est également un processus qui semble jouer un rôle important au niveau des transposons (parasites moléculaires qui accumulent des séquences répétées dans le génome) et des virus à ARN.

De nombreuses percées au niveau de notre compréhension des mécanismes impliqués dans la voie de l’iARN ont été réalisées récemment. Les chercheurs continuent à utiliser différentes approches génétique, biologique, biochimique et moléculaire dans le but d’identifier les différentes composantes de ce processus cellulaire et de déterminer comment celles-ci s’intègrent les unes aux autres pour former une voie métabolique fonctionnelle. L’iARN se présente sous deux aspects, selon l’origine de l’ARN précurseur : une voie endogène où les ARN précurseurs sont transcrits du génome et une voie exogène où les précurseurs ribonucléotidiques sont d’origine synthétique, virale ou autre (voir figure 1).

La voie endogène est initiée au noyau par la transcription d’un ARN non-codant appelé microARN primaire (pri-miARN) par la polymérase à ARN II (Lee et al., 2004). Le pri-miARN forme des structures secondaires en tige-boucle qui sont clivées en précurseur de microARN (pré-miARN) d’environ 70 nt par la ribonucléase III (RNase III) nucléaire Drosha (Lee et al., 2003). Ce dernier est transloqué au cytoplasme par l’Exportine 5 (Bohnsack et al., 2004; Lund et al., 2004; Yi et al., 2003), un transporteur nucléaire dépendant de la Ran-GTP, afin d’être clivé par la RNase III Dicer en un duplex de microARN (miARN) (ARNdb d’environ 21 à 23 pb ayant deux nucléotides non-appariés à chaque extrémité 3’).

Le brin du duplex de miARN dont l’extrémité 5’ présente l’énergie thermodynamique la plus faible sera pris en charge par le complexe effecteur de la voie de l’iARN. Ce brin catalytique servira alors de guide pour cibler l’ARN messager (ARNm) d’une manière spécifique; l’autre brin étant présumément dégradé par des nucléases (Bartel, 2004). Si le brin guide présente une complémentarité parfaite avec l’ARNm, principalement dans la région codante et/ou 5’ non-traduite (NT) chez les plantes, le complexe effecteur clivera l’ARNm cible, menant à sa dégradation. Cette situation est la plus fréquente dans le règne végétal. Chez la drosophile, le complexe médiant le clivage de l’ARNm cible a été nommé « RNA-induced silencing complex » (RISC) (Hammond et al., 2000). D’autre part, si le brin catalytique présente une complémentarité imparfaite avec l’ARNm cible, mais suffisante pour en permettre la reconnaissance principalement dans la région 3’NT, il médiera le blocage de la machinerie traductionnelle. Ce scénario est le plus fréquent dans le règne animal, où le complexe effecteur multiprotéique est alors appelé « miRNA ribonucleoprotein particles » (miRNP) (Hutvagner and Zamore, 2002).

La voie exogène est initiée par la présence d’ARNdb exogènes dans le cytoplasme. Cet ARNdb peut être clivé par la ribonucléase Dicer en « small interfering RNA » (siARN) ou petits ARN interferents, ou incorporé dans un complexe effecteur multiprotéique, une étape cytoplasmique commune aux miARN. Les siARN montrent une structure et un métabolisme analogues aux duplex de miARN; l’un des brins étant sélectionné (brin catalytique) et incorporé dans un complexe RNP. Ce complexe ainsi activé médiera, selon sa complémentarité avec l’ARNm cible, la dégradation du messager ou la répression de sa traduction (Hutvagner and Zamore, 2002).

La composition du miRNP et du RISC varie d’une espèce à l’autre. Chez l’humain, parmi les composantes déjà identifiées, on retrouve la protéine Argonaute (Ago), les hélicases dépendantes de l’ARN Gemin3 et Gemin4 (Meister and Tuschl, 2004), ainsi que la « Fragile X mental retardation protein » (FMRP) (Jin et al., 2004).

Ago est une protéine basique qui existe sous plusieurs formes (Ago1, Ago2, Ago3 et Ago4). Les protéines Ago possèdent un domaine Piwi apparemment impliqué dans l’interaction avec Dicer (Kolb et al., 2005; Tahbaz et al., 2004) et un domaine Piwi/Argonaute/Zwille (PAZ) qui permet la liaison du brin d’ARN catalytique (Kolb et al., 2005). Ceci aurait pour effet de protéger cet ARN contre la dégradation et de l’orienter convenablement dans le complexe effecteur (Carmell et al., 2002). Des évidences structurales et biochimiques suggèrent que la protéine Ago2, une composante essentielle du complexe RISC, exerce une activité endonucléasique permettant de cliver et de dégrader l’ARNm cible (Meister et al., 2004; Rand et al., 2004).

FMRP est une protéine possédant deux domaines Lys-His (KH) et une boîte Arg-Gly-Gly (RGG) caractéristiques de certaines protéines pouvant lier l’ARN. FMRP est localisée principalement au niveau des neurones, où elle joue un rôle important dans le transport des ARNm cibles et le contrôle de leur traduction au niveau des sites post-synaptiques dans les dendrites (Khandjian, 1999). Des travaux chez la drosophile ont montré sa présence dans le complexe RISC, son rôle dans le bon fonctionnement de la voie de l’iARN ainsi que l’importance du domaine KH dans l’interaction entre les composantes du complexe (Ishizuka et al., 2002). Le retard mental résultant de l’absence de la protéine FMRP pourrait être due, entre autres, au dérèglement de la machinerie de la voie de l’iARN (Caudy et al., 2002; Ishizuka et al., 2002).

Outre son rôle dans la régulation post-transcriptionnelle, les composantes de la machinerie de l’iARN jouent également un rôle dans la régulation transcriptionnelle afin d’assurer l’intégrité du génome. Chez la levure Schizosaccharomyces pombe (S. pombe), le processus est requis pour la formation de l’hétérochromatine centromérique ainsi que dans la ségrégation normale des chromosomes (Volpe et al., 2002). Ce mécanisme de régulation transcriptionnelle a aussi été démontré chez les plantes (Wassenegger et al., 1994) et la drosophile (Corbin and Maniatis, 1989; Pal-Bhadra et al., 2002).

Un processus d’amplification médié par une « RNA-dependent RNA polymerase » (RdRP), ou polymérase à ARN dépendante de l’ARN, a été identifié chez les plantes (A. thaliana), les champignons (S. pombe) et le nématode (C. elegans). Ce processus, qui permet une action systémique et plus durable de l’iARN, est absent chez les insectes et les mammifères (Cogoni and Macino, 2000; Hammond et al., 2001b; Sharp, 2001; Sharp and Zamore, 2000).

Dicer est une enzyme qui a été conservée au cours de l’évolution et qui est retrouvée, à ce jour, chez presque tous les organismes eucaryotes. C’est une RNase III de classe III qui présente des homologies avec les RNases III de classe I (E.coli) et de classe II (Drosha chez les mammifères) (Carmell and Hannon, 2004) (voir figure 2). Dicer est composée d’un domaine N-terminal montrant une analogie de séquence avec des hélicases à ARN, d’un « Domain of unknown function » (DUF283) ou domaine de fonction inconnue, d’un domaine PAZ pouvant lier l’ARNdb, de deux domaines RNase III (RIIIa et RIIIb) jouant un rôle important dans le mode de clivage de l’ARNdb et d’un domaine dsRBD pouvant lier l’ARNdb (Provost et al., 2002).

Dicer a la propriété de lier et de cliver les ARNdb, générant ainsi de petits ARNdb d’environ 21 à 23 pb qui montrent un groupement phosphate à l’extrémité 5’, un groupement hydroxyl à l’extrémité 3’ et 2 nt non-appariés à l’extrémité 3’ (Bernstein et al., 2001; Provost et al., 2002; Zhang et al., 2002; Zhang et al., 2004). Elle joue un rôle-clé dans le mécanisme de l’iARN, aussi bien dans la voie endogène que dans la voie exogène, en exécutant le clivage des pré-miARN en miARN matures ou de l’ARNdb en siARN. Pour qu’elle soit fonctionnelle, Dicer doit former un dimère via ses domaines RIII qui produisent ainsi le site catalytique actif pour le clivage de l’ARNdb. Malgré que le mode exact par lequel Dicer clive l’ARNdb ne soit pas encore connu, trois modèles ont été proposés (Carmell and Hannon, 2004):

Dans les trois scénarios, le domaine PAZ central de Dicer pourrait jouer un rôle très important dans l’étape du clivage en reconnaissant spécifiquement les 2 nt non-appariés à l’extrémité 3’ de l’ARNdb générés par Drosha. Le domaine PAZ positionnerait adéquatement les domaines RIIIa et RIIIbx aux sites de clivage, ce qui expliquerait la génération par Dicer de petits ARN d’une longueur déterminée; la structure tridimensionnelle et la disposition des différents domaines en étant les principaux déterminants (Carmell and Hannon, 2004).

Le clonage de la ribonucléase Dicer humaine (218 kDa) a rendu possible la caractérisation de son activité ribonucléasique et de ses propriétés à lier l’ARNdb. Le magnésium, qui n’est pas essentiel pour la liaison de l’ARNdb, est requis pour son activité ribonucléasique. Il a été démontré que le domaine dsRBD localisé dans la portion C-terminale de Dicer pouvait lier l’ARNdb in vitro. Exprimée dans les cellules humaines, Dicer colocalise avec la calreticuline, une protéine résidant au réticulum endoplasmique (RE) (Provost et al., 2002).

Le rôle de Dicer ne se limite pas à l’étape d’initiation de la voie de l’iARN par le clivage des ARN précurseurs. Des travaux ont récemment démontré l’association de Dicer avec le complexe effecteur RISC/miRNP et l’implication de diverses interactions dans le fonctionnement de cette voie. En effet, des interactions directes entre Dicer et les protéines de la famille Argonaute (Ago) (Hammond et al., 2001a) semblent être requises pour le transfert des siARN/miARN aux complexes effecteurs (Hammond et al., 2001a; Sasaki et al., 2003; Sontheimer and Carthew, 2005). Cette liaison, médiée par le domaine Piwi des protéines Ago et les domaines RNases III de Dicer, inhibe l’activité ribonucléasique de cette dernière in vitro (Tahbaz et al., 2004).

Une interaction entre Dicer et la protéine FMRP, dont la signification reste à établir, a également été identifiée dans des cellules murines (Lugli et al., 2005). Chez la drosophile, la protéine R2D2, joue un rôle dans la voie de l’iARN en liant Dicer et les protéines Ago ensemble dans le RISC (Liu et al., 2003).

Par ailleurs, des études très récentes ont évoqué la possibilité que certaines protéines virales pouvaient interagir avec Dicer. Ainsi, la protéine Tat du virus de l’immunodéficience humaine-1 (VIH-1) inhibe Dicer par contact direct (Bennasser et al., 2005), ce qui soutient l’hypothèse que Dicer pourrait être ciblé par certaines protéines virales.

Plus récemment, l’association de la protéine TRBP «Transactivating response RNA-Binding Protein » au complexe Dicer-Ago2 a été rapportée. Cette association est nécessaire à la stabilité et l’activation du complexe effecteur (Chendrimada et al., 2005).

Les microARN (miARN) sont de petits transcrits d’ARN non-codants d’environ 21 à 23 nt qui régulent négativement et spécifiquement l’expression des gènes (Lagos-Quintana et al., 2001; Lau et al., 2001; Lee and Ambros, 2001).

Exprimés chez la plupart des organismes eucaryotes, les gènes de miARN sont transcrits par l’ARN polymérase de classe II en pri-miARN qui présente un cap à l’extrémité 5’ et un segment polyadénylé à l’extrémité 3’ (Lee et al., 2004). Les gènes de miARN sont organisés en tandem pouvant être regroupés en amas ayant le même promoteur polycistronique ou isolés (Ambros, 2004). Chez les mammifères, plusieurs centaines de gènes codants pour des miARN ont été recensés. Représentant environ 1% du génome humain, certains chercheurs prévoient que les miARN peuvent réguler l’expression de plus de 30% des gènes (Bartel, 2004; Lai, 2003)!

Des travaux de l’équipe de Victor Ambros ont permis l’identification des deux premiers miARN, le lin-4 et le lin-7, chez le nématode (Lee and Ambros, 2001; Lee et al., 1993). Ces derniers sont requis pour la transition temporelle des stades larvaires au cours du développement post-embryonnaire du ver en inhibant la traduction des ARNm lin-14, lin-28, lin-41 et lin-57 codant pour des gènes hétérochroniques (Banerjee and Slack, 2002; Lee and Ambros, 2001; Lee et al., 1993; Reinhart et al., 2000; Slack et al., 2000) (voir figure 3). Des études chez C. elegans ont également démontré que lin-4 pouvait se lier à plus de 7 sites dans la région 3’NT de l’ARNm cible lin-14 avec une complémentarité imparfaite, bloquant ainsi sa traduction (Lee et al., 1993; Moss et al., 1997) (voir figure 3b). Lin-4 inhibe la traduction d’un autre ARNm cible, soit lin-28, de façon analogue, suggèrant une pluralité d’ARNm cible pour certains miARN.

Outre leur rôle dans la transition des stades larvaires chez le nématode, les miARN exercent des fonctions biologiques variées d’un organisme à l’autre, et peuvent être impliqués dans le développement, l’hématopoïèse, la différentiation cellulaire, l’apoptose, l’organogénèse et la prolifération cellulaire (Bartel, 2004) (voir tableau 1).

Récemment, une étude a montré la présence d’un miARN codé par la cellule hôte qui est dirigé contre un rétrovirus humain, le « Primate Foamy Virus type1 » (PFV-1) (Lecellier et al., 2005). Ce miARN a pour fonction de contrecarrer la réplication du virus dans les cellules humaines, ce qui suggère que l’iARN peut être impliquée dans la défense antivirale chez les mammifères (Lecellier et al., 2005). À l’opposé, il existe également des miARN codés par le génome de certains virus, tel que le virus Epstein-Barr, qui pourraient être impliqués dans la régulation de la réplication virale et de l’expression de certaines protéines de la cellule hôte (Pfeffer et al., 2004).

Les siARN sont de petits ARN synthétiques d’environ 21 pb parfaitement appariés et destinés à cibler des ARNm spécifiques. Les siARN peuvent également être produits par le clivage de précurseurs d’ARNdb par Dicer in vitro ou in vivo (virus, transposons). Sur le plan fondamental, les siARN et les miARN présentent des caractéristiques moléculaires similaires, mais diffèrent par leur origine, l’appariemment de leurs brins et leur mode d’action sur leur ARNm cible. Ainsi, les siARN visent habituellement un site unique et montrent une complémentarité parfaite avec l’ARNm cible, menant à sa dégradation (He and Hannon, 2004).

Les siARN représentent un outil moléculaire très puissant et de plus en plus utilisé en recherche fondamentale et thérapeutique. Ainsi, il est possible d’investiguer la fonction d’un gène chez les eucaryotes en bloquant spécifiquement et transitoirement l’expression du gène en question, et en observant les conséquences sur le fonctionnement cellulaire. Par ailleurs, l’exploitation de la voie de l’iARN à des fins thérapeutiques s’avère très prometteuse. Des siARN sont en cours de développement chez de nombreuses compagnies de biotechnologie pour cibler de manière spécifique l’expression de gènes pouvant causer des maladies, telles que le cancer, les maladies neurodégénératives et les maladies infectieuses virales (Wall and Shi, 2003). Lorsqu’ils sont introduits dans la cellule de mammifère, les siARN n’activent pas l’immunité non-spécifique, du fait de leur petite taille (Elbashir et al., 2001). L’introduction d’ARNdb d’origine virale ou synthétique, ayant plus de 30 nt de long, active la voie de l’interféron, qui provoque une inhibition généralisée de la traduction menant à l’apoptose (Gil and Esteban, 2000), de même que de la RNase L, qui dégrade de manière non-spécifique les ARNm cellulaires et viraux (Diaz-Guerra et al., 1997; Samuel, 1991).

Très récemment, des études ont montré que le VIH-1 code pour des précurseurs de siARN de même que pour un suppresseur de la voie iARN (Bennasser et al., 2005). Ces observations suggèrent que ce virus, qui pourrait être une cible de la voie de l’iARN, a élaboré un moyen pour échapper à ce mécanisme de défense anti-viral.

L’iARN est le principal mécanisme de défense anti-viral chez les plantes. Cependant, des études récentes ont mis à jour certaines stratégies virales suppressives de la voie iARN. Parmi les stratégies utilisées par certains virus pour échapper à la voie de l’iARN, notons :

Chez les plantes, la première forme de résistance à être identifiée est médiée par la production de protéines virales suppressives, telles que la p21, codée par le « beet western yellow virus », et la p19, codée par le « tomato bushy stunt virus ». Ces deux protéines virales lient les miARN et préviennent leur incorporation dans le RISC, ce qui en font des suppresseurs puissants de l’iARN (Chapman et al., 2004; Vargason et al., 2003; Ye et al., 2003). Une autre forme de résistance est représentée par la protéine virale P1/HC-Pro, codée par le « Turnip mosaic virus », qui pourrait interagir avec R2D2 et prévenir la formation d’un complexe RISC actif (Chapman et al., 2004).

Chez la drosophile, les protéines E3L du virus de vaccinia et NS1 du virus de l’influenza A, B et C, qui sont des protéines pouvant lier l’ARNdb et impliquées dans l’inhibition de la réponse anti-virale médiée par l’interféron, interfèrent avec la voie de l’iARN en liant le pré-miARN (Liu et al., 2004).

Chez l’humain, des stratégies de résistance virale ont récemment été découvertes. Dans le cas de l’adénovirus, celui-ci produit l’ARN non-codant VA1 d’environ 160 nt formant des structures secondaires. Ce dernier est capable de compétitionner avec les pré-miARN pour une quantité limitée du transporteur nucléaire Exportine 5 en plus d’inactiver Dicer par une interaction directe (Lu and Cullen, 2004). En ce qui a trait au virus Epstein-Barr, il produit des transcrits de pri-miARN et exploite la machinerie de l’iARN pour la biosynthèse de miARN qui pourraient être requis pour la réplication du virus (Pfeffer et al., 2004).

Enfin, l’exemple le plus récent est celui du VIH-1. Le génome de ce virus code pour des précurseurs de siARN dirigés contre ses propres ARNm afin de réguler sa réplication. D’autre part, le VIH-1 est capable d’échapper à l’action de l’iARN en exprimant la protéine Tat qui inhibe directement l’activité catalytique de Dicer (Bennasser et al., 2005; Contreras et al., 2005). Ces observations illustrent la complexité et la dynamique des interactions hôte-virus, dans lesquelles la voie de l’iARN semble jouer un rôle important.

Le virus de l’hépatite C (VHC) a été identifié en 1989 par Choo et al. par des méthodes de biologie moléculaire. Connu comme étant le principal agent étiologique des hépatites « non A, non B », ce virus a été classé au sein de la famille des flaviviridae et est le seul représentant du genre hépacivirus (Choo et al., 1990; Kuo et al., 1989).

Le VHC constitue un problème de santé publique majeur à travers le monde, en particulier dans les pays en développement, affectant au moins 170 millions de personnes, soit 3% de la population mondiale, et entraînant une morbidité et une mortalité considérable (Global surveillance and control of hepatitis C, 1999). Le virus se transmet principalement par voie parentérale (transfusion sanguine, aiguilles souillée) (Zou et al., 2003) et, à une fréquence plus faible, par voies sexuelle et périnatale (Batallan et al., 2003; Wejstal, 1999). À cause du taux d’erreurs relativement élevé commis par la polymérase à ARN du VHC, le génome viral présente une variabilité génomique importante, d’où l’apparition de 6 génotypes et de nombreux sous-types (Robertson et al., 1998).

L’hépatite C peut évoluer vers la cirrhose et le carcinome hépatocellulaire, nécessitant inexorablement une transplantation du foie (Alter and Seeff, 2000). En dépit des avancées thérapeutiques, le seul remède pour traiter les patients infectés par l’hépatite C est une combinaison de ribavirine et d’interféron alpha (IFNα), dont l’efficacité varie selon le génotype et qui représente une thérapie très coûteuse. Aucun vaccin n’est présentement disponible (Moradpour and Blum, 1999). Il y a donc un criant besoin d’explorer d’autres alternatives et moyens pour combattre ce virus.

Le VHC est un virus enveloppé à capside icosaédrique hébergeant un ARN monocaténaire linéaire de polarité positive d’environ 9,6 kb. Son génome comprend trois régions distinctes de l’extrémité 5’ à l’extrémité 3’, soit la région 5’NT, la région codante et la région 3’NT.

La région 5’NT comporte 341 nt et des domaines hautement conservés riches en structures secondaires complexes formant le « internal ribosome entry site » (IRES) ou site interne d’entrée du ribosome (Friebe et al., 2001). Ce dernier fait d’ailleurs l’objet de la section 1.3.3.

La région codante varie entre 9024 et 9111 nt de long, et présente un cadre de lecture ouvert codant pour une polyprotéine d’environ 3033 acides aminés (aa). Lors de sa maturation post-transcriptionnelle, la polyprotéine est scindée par des protéases cellulaires et virales pour donner naissance aux protéines structurales (C-E1-E2-p7) et non-structurales (NS2-NS3-NS4A-NS4B-NS5A-NS5B) du virus (Bartenschlager and Lohmann, 2000) (voir figure 4). La protéine C sert essentiellement à la formation de la capside par polymérisation et est capable d’interagir avec de nombreux constituants cellulaires. E1-E2 sont les glycoprotéines de l’enveloppe virale. Elles forment un complexe hétérodimériques par des interactions non-covalentes et qui sont principalement impliquées dans la reconnaissance cellulaire. p7 est un polypeptide de 7 kDa présentant plusieurs résidus hydrophobes et ayant une fonction encore inconnue. NS2 est une métalloprotéase qui forme, avec l’extrémité N-terminale de NS3, une protéase auto-catalytique dépendante du zinc qui permet la coupure de la jonction NS2-NS3. NS4A sert comme cofacteur de NS3 pour le clivage de la jonction NS3-NS4A (Reed and Rice, 2000). NS4B présente un rôle plausible dans la réplication virale (Elazar et al., 2004). NS5A ainsi que la glycoprotéine E2 présentent un rôle dans la résistance virale à l’interféron (Gale et al., 1997; Tan and Katze, 2001; Taylor et al., 1999). NS3 et NS5B sont présentées plus en détail dans les sections 1.3.4 et 1.3.5, respectivement.

La région 3’NT de 229 nt comprend une région poly-uridyle impliquée dans l’initiation de la synthèse du brin d’ARN négatif au cours de la réplication virale (Friebe and Bartenschlager, 2002).

NS3 est une protéine multifonctionnelle de 70 kDa pouvant exercer trois activités enzymatiques différentes : une fonction sérine protéase dans son tiers N-terminal permettant le clivage de la jonction NS2-NS3 et des protéines non-structurales situées en amont, et deux activités combinées nucléoside triphosphatase (NTPase)/hélicase localisées dans ses deux-tiers C-terminal et jouant un rôle dans la réplication virale. La localisation de NS3 est essentiellement cytoplasmique (Gwack et al., 1996; Kim et al., 1995; Tomei et al., 1993).

Les protéines structurales et non-structurales du VHC interagissent entre elles et avec certaines composantes de l’hôte afin d’assurer la réplication virale et la résistance du virus à l’immunité cellulaire. Dans le cas de NS3, une étude a démontré que celle-ci interagit avec NS4A et NS5B pour former un complexe requis pour la réplication du virus (Ishido et al., 1998). Des travaux récents suggèrent que NS3 soit impliquée dans la résistance anti-virale via une interaction directe avec certaines protéines de l’hôte. Une étude suggère que le domaine protéasique de NS3 peut interférer avec la présentation antigénique via le complexe majeur d’histocompatibilité de classe I en interagissant avec la « Low Molecular Mass Protein 7 » (LMP7). LMP7 est une composante du protéasome impliqué dans la dégradation du peptide antigénique qui peut être d’origine virale, ce qui rend le virus invisible à la surveillance du système immunitaire (Khu et al., 2004).

Par ailleurs, d’autres études ont rapporté que NS3 pouvait lier directement la protéine kinase « TANK Binding Kinase-1 » (TBK1) et inhiber l’association et l’activation du facteur de transcription « Interferon Regulatory Factor-3 » (IRF-3). Ce dernier est un régulateur-clé de la production de l’interféron de type I via la voie de signalisation médiée par le « Toll-Like Receptor-3 » (TLR-3) (Foy et al., 2003; Otsuka et al., 2005). Le TLR-3 est un récepteur impliqué dans l’immunité innée en fixant l’ARNdb viral. Cette liaison active le facteur IRF-3 et, ultérieurement, toute la cascade de signalisation induisant la production de l’interféron, incluant l’interféron-β, qui est le principal agent anti-viral de l’immunité innée (Akira and Hemmi, 2003).

L’absence d’un système de réplication virale efficace représente l’obstacle majeur à l’étude de la fonction biologique du VHC et à la conception éventuelle de nouvelles molécules thérapeutiques. Le seul modèle animal pouvant être utilisé est le chimpanzé. Pour pallier à ce problème, plusieurs systèmes d’expression des protéines non-structurales virales ont été mis au point dans des cellules de mammifère en culture.

Dans cette présente étude, nous avons eu recours à un système basé sur le réplicon, un ARN subgénomique codant pour les protéines non-structurales (NS2-NS5B) du virus, transfecté dans des cellules Huh-7 (hépatocytes dérivées d’une tumeur hépatique humaine) maintenues en culture. L’utilisation de la néomycine dans le milieu de culture permet de sélectionner les cellules hébergeant le réplicon, qui porte un gène de résistance à la néomycine. Ce système offre un double avantage : (1) les protéines non-structurales virales sont produites en quantité suffisante, et (2) les protéines du VHC peuvent être manipulées et étudiées de façon sécuritaire en l’absence de particules infectieuses (Bartenschlager, 2002; Lohmann et al., 1999; Pietschmann et al., 2002; Rosenberg, 2001).

Récemment, des travaux ont permis le développement d’un nouveau système de culture très performant permettant la production de particules virales infectieuses. Ce système consiste en un réplicon codant pour le génome viral entier et qui présente des mutations adaptatives (JFH-1 génotype 2a) afin d’augmenter l’efficacité de la réplication du VHC (Wakita et al., 2005; Zhong et al., 2005). Ce réplicon a été transfecté dans une lignée cellulaire dérivée des Huh7 et plus performante pour la production de particules virales.

Le traitement actuel de l’hépatite C offre une faible efficacité entraînant plusieurs effets secondaires. La recherche thérapeutique se poursuit afin de développer de nouvelles stratégies plus performantes pour contrer la réplication du VHC chez l’humain. En ce sens, la voie de l’iARN représente une approche thérapeutique intéressante. Ainsi, des siARN synthétiques ont été utilisés avec succès afin d’inhiber spécifiquement l’expression de gènes viraux dans des cellules hépatiques (Huh-7) possédant un réplicon viral. Le recours à des vecteurs d’expression de « short hairpin RNA » (shARN), ou petits ARN en structure d’épingle à cheveux, dirigés spécifiquement contre NS3 et NS5B s’est avéré plus efficace que les siARN pour supprimer la réplication virale et à long terme (Prabhu et al., 2005; Randall et al., 2003; Takigawa et al., 2004). Par ailleurs, d’autres travaux in vivo ont permis le blocage de la synthèse de NS5B en utilisant des siARN et des shARN dirigés contre celle-ci dans un modèle murin d’hépatite mimant l’infection chez l’Homme (McCaffrey et al., 2002).

Deux évidences suggèrent que le VHC pourrait être ciblé par la voie de l’iARN : (1) le VHC produit des intermédiaires d’ARNdb lors de sa réplication; et (2) le génome viral montre des structures d’ARN en tige/boucle dans la région 5’NT susceptibles à l’action de Dicer in vitro (Isabelle Plante, résultats non-publiés). La voie de l’iARN pourrait donc constituer un mécanisme de défense anti-viral contre le VHC. Cependant, les niveaux endogènes de petits ARN provenant du clivage du génome du VHC par Dicer sont sous les limites de détection, suggérant que le VHC puisse échapper et/ou contrecarrer la voie de l’iARN in vivo.

Étant donné que le cycle réplicatif du VHC se déroule au niveau du cytoplasme et que la plupart de ses protéines non-structurales se retrouve, comme Dicer, au niveau du RE, nous avons émis l’hypothèse qu’une ou plusieurs de ces protéines virales puissent interagir et interférer avec la fonction de la ribonucléase Dicer. Le principal objectif de ce travail était donc de détecter et de documenter l’interaction possible entre la ribonucléase Dicer et les protéines non-structurales du VHC.

© Cherifa Ayari, 2005