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Table des matières
Le système du double-hybride chez la levure permet d’identifier une interaction protéine-protéine (X-Y) in vivo par reconstitution d’un activateur de la transcription chimérique (GAL4) chez la levure Saccharomyces cerevisiae (voir figure 6). Le GAL4 est formé d’un domaine de liaison à l’ADN (DLA) et un domaine d’activation (DA) qui, lorsque séparés, ne sont pas capables d’interagir et d’activer la transcription (Chien et al., 1991; Fields and Song, 1989).
Figure 6 : Principe de l’activation des gènes rapporteurs chez la levure PJ69-4A.
La reconstitution fonctionnelle du facteur de transcription GAL4 mène à la transactivation de gènes rapporteurs placés en aval du promoteur.
Expérimentalement, les levures sont transformées simultanément par deux plasmides : l’un code pour la protéine recombinante X fusionnée au DLA de GAL4 (DLA-X) et portant le gène de sélection à la tryptophane TRP1, tandis que l’autre code pour la protéine Y fusionnée au DA (DA-Y) et portant le gène de sélection à la leucine LEU2. Les protéines de fusion exprimées possèdent un signal de localisation nucléaire permettant leur translocation au noyau, où se trouvent les gènes rapporteurs. La première étape consiste à sélectionner les levures transformées simultanément par les deux plasmides en les étalant sur un milieu tryptophane- (Trp-)/leucine- (Leu-) (voir figure 7). La deuxième étape consiste à déceler une éventuelle interaction entre les deux protéines d’intérêt. L’interaction des protéines X et Y permettra la reconstitution du transactivateur GAL4 et la transcription subséquente des gènes rapporteurs Ade2, His3 et lacZ, permettant respectivement la synthèse d’adénine, d’histidine et de la β-galactosidase. L’importance de l’interaction entre les deux protéines peut être estimée par la croissance des colonies sur des milieux déficients en adénine ou en histidine, ou par l’intensité de la coloration bleue sur les milieux contenant le 5-bromo-4-chloro-3-indolyl β-D-galactoside (X-Gal).
Le vecteur GAL4-BD pGBT9 (CLONTECH) portant le gène de sélection TRP1 et les vecteurs GAL4-AD pACT2 (CLONTECH) et pGADT7 (CLONTECH) portant le gène de sélection LEU2 ont été utilisés pour les études de double-hybride (voir annexe C). Une banque de fragments d’ADNc du génome du VHC contenu dans le vecteur pHCV77c (voir annexes E et F) a été générée aléatoirement par l’équipe du Dr Denis Leclerc, puis clonée dans le vecteur pGADT7. Les autres constructions utilisées dans les expériences de double-hybride ont été réalisées par le Dr Patrick Provost. Les vecteurs d’expression de Dicer (no. accession AJ132261) et de ses différents domaines (N-terminal (1-602), central (597-1243), C-terminal (1237-1912) et le domaine dsRBD (1772-1912)), ont été générés par PCR et le clonage des inserts a été effectué dans le cadre de lecture approprié du vecteur pGBT9. Les constructions ont été vérifiées par analyse de restriction. Deux clones de chaque vecteur ont été utilisés en parallèle dans les expériences décrites dans ce mémoire.
Nous avons utilisé la lignée de levure PJ69-4A (génotype : MATa trp1-901 leu2-3,112 ura3-52 his3-200 gal4Δ gal180Δ LYS2::GAL1-HIS3 GAL2-ADE2 met2:: GAL7-lacZ) dans laquelle le gène GAL4 est inactivé (James et al., 1996). Les levures, conservées à -80°C, sont décongelées, ensemencées sur un milieu solide « Yeast extract/Peptone/Dextrose » contenant de l’adénine (YPAD) et incubées à 30°C pendant 3 à 4 jours.
La transformation des levures avec les plasmides d’intérêt était effectuée selon le protocole PEG/LiAc (Gietz et al., 1995). Brièvement, deux à trois colonies étaient inoculées dans 50 ml de milieu YPAD liquide, incubées à 30°C sous agitation et ultérieurement diluées afin d’obtenir une densité optique à 600 nm (D.O.600) en phase exponentielle d’environ 2.56. Les levures étaient ensuite lavées à l’eau stérile et récupérées par centrifugation. Le culot de cellules était d’abord resuspendu dans 1 ml de LiAc 100 mM, puis 50 μl de la suspension étaient distribués dans chaque tube. Après centrifugation de la suspension, 349 μl de la solution de transformation (240 μl PEG 50%, 36 μl LiAc 1.0 M, 25 μl d’ADN de sperme de saumon 2.0 mg/ml préalablement bouilli pendant 5 min et 48 μl d’eau stérile) et 1 μl de chaque vecteur (0,1 μg/μl) était ajouté au culot. Après la resuspension des cellules et une incubation à 30°C pendant 30 min, les levures étaient soumises à un choc thermique par incubation à 42°C pour 30 min. Après centrifugation à 2500 RPM pendant 1 min, le culot était resuspendu très délicatement dans 1 ml d’eau stérile.
Les levures ainsi transformées étaient étalées sur un milieu Trp-/Leu- « Synthetic Dropout (SD) » (milieu contenant tous les acides aminés (aa) essentiels pour la croissance des levures en absence de l’aa utilisé pour la sélection) et incubées à 30°C pendant environ 6 jours. Pour l’essai des gènes rapporteurs, les levures étaient repiquées, étalées sur les milieux (SD)/Leu-/Trp-/Ade-, (SD)/Leu-/Trp-/His- + 4 mM 3-amino-1,2,4-triazole (3-AT) (Sigma) et (SD)/Leu-/Trp- + 0.04 mg/ml 5-bromo-4-chloro-3-indolyl β-D-galactoside (X-Gal) (Sigma) et incubées à 30°C (voir annexe A). La première lecture des résultats a été faite après 3 jours et la deuxième après 6 jours en se référant toujours aux témoins positifs et négatifs.
La lignée cellulaire Huh-7, portant un réplicon codant pour les protéines non-structurales de VHC (clone 9-13 gracieusement offert par le Dr Ralf Bartenschlager), a été utilisée en parallèle avec des cellules Huh-7 natives. Les cellules étaient maintenues dans du milieu « Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium » (DMEM, Gibco) complémenté avec 10% de sérum de bœuf fœtal (Hyclone), un mélange de pénicilline, streptavidine et glutamine (PSG) 1X et d’un mélange d’acides aminés non-essentiels 1X. Les cellules contenant le réplicon étaient sélectionnées par l’ajout de 1 μg/ml de G418 (Sigma) au milieu. Les cellules étaient cultivées à 37°C en présence de 5% de CO2, et diluées 1/3 à tout les 3-4 jours.
Lors des expériences de coimmunoprécipitation in vivo, 107 cellules étaient lavées 2 fois avec du « Phosphate Buffered Saline » (PBS) froid et décollées délicatement du pétri à l’aide d’un gratoire. La suspension cellulaire était ensuite centrifugée à 2500 RPM pendant 1 min, le surnageant enlevé et le culot de cellules mis sur glace. Par la suite, les cellules étaient resuspendues dans 1 ml de tampon de lyse froid (50 mM Tris•HCl pH 8.0, 150 mM NaCl, 1X d’un cocktail d’inhibiteurs de protéases complet (Roche), 1 mM de PMSF, 1% Triton X-100) et incubées sur glace pendant 15 min. Le lysat cellulaire était ensuite centrifugé à 13000 RPM pendant 3 min, et la concentration de protéines du surnageant était mesurée selon la méthode colorimétrique de Bradford en employant le réactif « Protein Assay Dye Reagent » de Bio-Rad. Un milligramme de protéine était utilisé pour chaque immunoprécipitation (IP). Vingt μl du premier anticorps (IgG de lapin) dirigé contre la forme humaine de Dicer étaient ajoutés et incubés pendant deux heures à 4°C sous rotation continue. Ensuite, 20 μl de billes protéine G-agarose (Roche), prélavées 4 fois avec du PBS, étaient ajoutés. Après une heure d’incubation, les billes étaient lavées 3 fois avec 1 ml de PBS froid, en récupérant à chaque fois les billes par centrifugation à 2500 RPM pendant 1 min. Au terme de ces lavages, les billes étaient resuspendues dans 50 μl de tampon « sample buffer » (SB) 1X, bouillies et mises sur glace durant 5 min. Les billes étaient ensuite centrifugées à 2500 RPM pendant 1 min et le surnageant était prélevé et analysé.
Les protéines étaient séparées selon leur poids moléculaire par électrophorèse sur gel de polyacrylamide 10% en présence de « Sodium dodecyl sulfate » (SDS) et analysées par immunobuvardage (voir annexe B). Les protéines étaient transférées sur une membrane de polyvinylidene difluoride (PVDF) (Amersham) à 400 mA constant pendant 12-16 h. La membrane était bloquée dans une solution de « Tris Buffered Saline » (TBS) contenant 5% de lait en poudre pendant 1 h sous agitation. La membrane était ensuite lavée 3 fois avec du TBS-Tween 0.1% et incubée pendant 1 h avec le premier anticorps sous agitation à la température de la pièce. Les anticorps primaires utilisés à cette fin étaient : anticorps monoclonal 1B6 (IgG murin) dirigé contre NS3 (Wolk et al., 2000), l’anticorps monoclonal 5B-12B7 (IgG murin) dirigé contre NS5B (Moradpour et al., 2002) et l’anticorps polyclonal de lapin dirigé contre Dicer (Provost et al., 2002). Les anticorps étaient dilués à 1:1000 dans du TBS-T contenant 1% lait en poudre. Finalement, les bandes étaient visualisées par chemiluminescence (ECL) et la membrane exposée à un film XAR (Kodak).
Le vecteur d’expression chez les mammifères pcDNA3.1(+) (Invitrogen) possédant le promoteur T7 a été modifié afin de pouvoir y insérer les ADNc d’intérêt et exprimer des protéines portant l’épitope Flag (Asp-Tyr-Lys-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys) (voir annexe D). Les amorces utilisées pour la production du vecteur pcDNA3.1-5’Flag sont : l’amorce sens 5’-TCGAGGACTACAAGGACGACGATGACAAGTGAGGGCC-3’et l’amorce anti-sens 5’-GGCCCTCACTTGTCATCGTCGTCCTTGTAGTCCTCGA-3’. Ces amorces ont été appariées et insérées dans les sites de restriction XhoI/ApaI. Pour le vecteur pcDNA3.1-3’Flag, l’amorce sens est 5’-CTAGCCCACCATGGACTACAAGGACGACGATGACAAGAAGCTT-3’ et l’amorce anti-sens 5’-AGCTTCTTGTCATCGTCGTCCTTGTAGTCCATGGTGGGCTAG-3’ ont été appariés et insérés dans les sites de restriction NheI/HindIII (voir Annexe C).
Ces deux vecteurs ont accueilli l’ADNc codant pour les protéines NS3 et NS5B, de même que celui codant pour des fragments dérivant de ces protéines, soit DHCV36 (NS3, nt 3991-4522), DHCV87 (NS3, nt 3749-4432), DHCV4 (NS5B, nt 8557-8823) et DHCV94 (NS5B, nt 8617-8857) (voir tableau 2). Les séquences indiquées étaient amplifiées par « Polymerase Chain Reaction » (PCR) extraites sur gel d’agarose à l’aide du « Gel Extraction Kit » (Qiagen) puis insérées dans le vecteur d’expression.
Le système d’extrait de réticulocytes de lapin « TNT Coupled Transcription/Translation » (Promega) a été utilisé pour générer in vitro la protéine Dicer, les protéines virales NS3, NS5B de même que les fragments de protéines DHCV87, DHCV36, DHCV4, DHCV94 fusionnées à l’épitope Flag. Brièvement, le mélange réactionnel comportait 25 μl d’extrait de réticulocytes, 1 μl de tampon de réaction, 2 μg d’ADN, 40 U/μl d’inhibiteur de ribonucléases, 2 μl de l’ARN polymérase le T7, 1 mM d’un mélange d’acides aminés sans méthionine, 20 μCi de méthionine marquée au 35S (Amersham Bioscience) et 16 μl d’eau. Le mélange réactionnel était incubé à 30°C pendant 90 min. Les tubes étaient ensuite transférés sur glace afin d’empêcher la dénaturation et la dégradation des protéines.
Les protéines générées par transcription/traduction in vitro et marquées à la méthionine 35S ont été utilisées pour les expériences de coimmunoprécipitation in vitro. Brièvement, 10 μl de billes protéine G-agarose (Roche) prélavées 4 fois avec du PBS étaient préincubées pendant 2 h avec 35 μg d’anticorps monoclonal anti-Flag M2 (Sigma). Après un lavage à l’aide de 1 ml de PBS froid, 15 μl de Dicer et 15 μl de protéine ou peptide viral étaient ajoutés et incubés pendant 1 h additionnelle. Par la suite, les billes étaient lavées 4 fois avec 1 ml de PBS pendant 5 min sous rotation à 4°C, et récupérées par centrifugation à 2500 RPM. À la fin, 30 μl de tampon SB 1X était ajouté, les protéines bouillies et analysées par électrophorèse sur gel SDS-PAGE 10%, tel que décrit dans la section 2.2. Le gel était séché à 80°C pendant 1 h et les bandes révélées par autoradiographie.
© Cherifa Ayari, 2005
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