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Table des matières
Afin d’identifier les protéines du VHC pouvant interagir avec Dicer, nous avons criblé une banque d’ADNc du VHC en utilisant la forme humaine de la ribonucléase Dicer comme appât dans le système du double-hybride chez la levure. Suite à la cotransformation des levures avec le vecteur exprimant le domaine DLA du GAL4 fusionné à Dicer et le vecteur exprimant le domaine DA fusionné à une librairie d’inserts provenant du génome du VHC, les transformants étaient sélectionnés sur un milieu SD/Trp-/Leu-/Ade-. Les colonies poussant sur ce milieu ont ensuite été étalées sur d’autres milieux afin de vérifier et de confirmer l’activation des gènes rapporteurs Ade2, His3 et LacZ. À cette fin, des témoins positifs et négatifs appropriés étaient utilisés dans le but de comparer les résultats et de les interpréter adéquatement (voir tableau 3). Les témoins positifs comportent des protéines présentant des interactions déjà documentées, telles que la « coactosin-like protein » (CLP)-5-lipoxygénase (5LO), la SNF1-SNF4 et la 5LO-dsRBD Dicer. En ce qui concerne les témoins négatifs, l’utilisation de différentes combinaisons impliquant des vecteurs vides ou des protéines aléatoires a été préconisée.
Tableau 3 : Les témoins positifs et négatifs utilisés dans les expériences de double-hybride chez la levure. Légende : ++++, très forte interaction; +++, forte interaction; ++, interaction; -, absence d’interaction. CLP, « coactosin-like protein »; 5LO, 5-lipoxygénase.
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Sur un total de 3.08 x 105 transformants, plus de 25 clones viraux (DHCV) indépendants présentant une interaction avec la protéine Dicer complète ont pu être identifiés (Isabelle Plante, résultats non-publiés). À partir des clones DHCV, l’ADN plasmidique était extrait et l’identification des peptides viraux codés par les inserts de la librairie d’ADNc par réaction de séquençage a été effectuée (Isabelle Plante, résultats non-publiés).
Les résultats obtenus sont résumés à la figure 8. Les peptides viraux identifiés proviennent des protéines structurales E1 (clones DHCV79 et 118) et E2 (clone DHCV77), et des protéines non-structurales NS3 (clones DHCV17, 87, 89, 36, 43, 50, 54 et 68), NS4B (clones DHCV2 et 10) et NS5B (clones DHCV104, 4, 14, 20, 21, 44, 71, 75, 5 et 94). On a également identifié 2 clones (DHCV1 et 25) dont les inserts montraient une orientation inversée (voir figure 8).
Figure 8 : Identification des différents peptides du VHC (clones DHCV) pouvant interagir avec Dicer.
On remarque que la majorité des clones identifiés représentent des peptides dérivés des protéines non-structurales NS3 (8 clones) et NS5B (10 clones). Il est intéressant de constater que deux clones, en particulier, ont été identifiés plusieurs fois. Ceci démontre la saturation du criblage de la librairie d’ADNc du VHC et reflète la reproductibilité des résultats obtenus.
Ces observations nous ont incité à se pencher de plus près sur les protéines non-structurales NS3 et NS5B. L’ADNc codant pour ces dernières a été amplifié et cloné dans le vecteur pACT2 afin de produire une protéine fusionnée avec le DA du GAL4. Nous avons ensuite validé les résultats présentés à la figure 8 et procédé à nouveau au double-hybride chez la levure en y incorporant, cette fois, NS3 et NS5B. Un représentant de chaque clone DHCV pouvant interagir avec la protéine Dicter complète (clones DHCV79, 77, 17, 87, 36, 10, 104, 4 et 94) a été analysé (voir tableau 4). Ces expériences sont nécessaires afin de s’assurer que les interactions observées sont bien reliées aux plasmides qui ont été isolés et aux inserts séquencés.
Les résultats compilés dans le tableau 4 montrent que les peptides DHCV79 (E1), DHCV17, DHCV87, DHCV36 (NS3) et DHCV4 (NS5B) présentent une interaction avec Dicer, alors que le peptide DHCV94 (NS5B) présente l’interaction la plus forte dans ce contexte expérimental. Cependant, les protéines NS3 et NS5B complètes ne montrent qu’une très faible interaction avec Dicer.
Tableau 4 : Interaction entre Dicer et différents peptides dérivés du VHC par le système du double-hybride chez la levure. Légende : +++, forte interaction; ++ interaction; +, faible interaction; +/-, très faible interaction; -, absence d’interaction.
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Nous avons ensuite déterminé l’implication des différents domaines de Dicer, soit le domaine N-terminal (nt 1-602), le domaine central (nt 597-1243), le domaine C-terminal (nt 1237-1912) et le domaine dsRBD (nt 1772-1912) dans l’interaction avec NS3, NS5B et les différents peptides viraux. Tel que démontré au tableau 5, le domaine N-terminal de Dicer interagit fortement avec les peptides DHCV4 et DHCV94 dérivés de NS5B. Quant aux domaines central et C-terminal, ils interagissent plus particulièrement avec les peptides viraux DHCV87 et DHCV36 dérivés de NS3. Le domaine dsRBD n’interagit pas de façon significative avec NS3, NS5B ou les peptides viraux. Les protéines NS3 et NS5B complètes n’ont montré aucune interaction avec les différents domaines de Dicer.
Le système du double-hybride chez la levure nous a permis de détecter des interactions significatives entre Dicer et certains peptides du VHC. Cependant, les protéines NS3 et NS5B complètes ne lient Dicer que très faiblement. Cela pourrait être relié à une limitation expérimentale. De fait, il est possible que NS3 et/ou NS5B adoptent leur conformation native lorsqu’exprimées avec les autres protéines du VHC dans des cellules humaines en culture.
La coimmunoprécipitation représente la méthode de choix pour valider les interactions potentielles entre protéines in vivo. L’étape suivante de mon projet consistait donc à étudier l’interaction entre Dicer et les protéines non-structurales NS3 et NS5B in vivo en utilisant la lignée cellulaire Huh7 hébergeant un réplicon. Ce dernier exprime de façon stable les protéines non-structurales du VHC.
Dans un premier temps, les cellules étaient lysées à l’aide d’un tampon de lyse contenant des inhibiteurs de protéases (1X) et du PMSF (1 mM) afin de limiter la dénaturation et la dégradation des protéines. Les lysats étaient ensuite incubés avec l’anticorps anti-Dicer, préfixé à des billes protéine G-agarose et servant à immunoprécipiter la protéine Dicer endogène. Les protéines cellulaires recueillies grâce à l’anti-Dicer étaient séparées par électrophorèse sur gel SDS-PAGE 10% et analysées par immunobuvardage (IB).
Tel qu’illustré à la figure 9, la protéine Dicer a pu être immunoprécipitée par l’anticorps anti-Dicer (puit 2), alors qu’aucun signal n’a été détecté dans les IP réalisées avec les billes vides seulement (puit 3). Lorsque la membrane a été révélée avec l’anticorps anti-NS5B, une bande de poids moléculaire correspondant à NS5B était détectée dans les IPs de Dicer. Une bande d’intensité plus faible apparaît également avec les billes vides seulement. Malgré que cette dernière observation suggère que NS5B interagit avec les billes de façon non-spécifique, nous ne pouvons exclure, à ce stade-ci, que NS5B interagit bel et bien avec Dicer.
Figure 9 : Étude de coimmunoprécipitation in vivo entre Dicer et NS5B.
1, lysat total (LT); 2, IP de Dicer à l’aide de l’anticorps anti-Dicer; 3, IP contrôle réalisée en absence de l’anticorps anti-Dicer; -, puit vide.
Utilisant une approche similaire, nous n’avons pas pu démontrer une interaction entre Dicer et NS3 (voir figure 10), où la bande de NS3 n’est pas plus intense dans les IP Dicer (puit 2) versus les billes vides seulement (puit 3). Ces résultats suggèrent que Dicer lie NS5B, mais non NS3, in vivo.
Considérant la possibilité que les niveaux de NS3 coimmunoprécipitée soient trop près des limites de détection dans les expériences d’immunobuvardage précédentes, nous avons opté pour une technique plus sensible utilisant des protéines marquées à la méthionine 35S.
Nous avons donc réalisé des expériences de coimmunoprécipitation in vitro entre Dicer et NS3, NS5B ou les peptides viraux dérivés de NS3 (DHCV36 et DHCV87) et de NS5B (DHCV4 et DHCV94). Ces peptides viraux ont été sélectionnés étant donné leur interaction avec Dicer dans le système du double-hybride chez la levure (voir tableaux 4 et 5).
Dans un premier temps, la protéine Dicer intacte de même que NS3, NS5B et les peptides viraux fusionnés à l’épitope Flag, étaient produits par des réactions de transcription/traduction in vitro. Toutes les protéines étaient marquées à la méthionine 35S. Par la suite, une IP a été réalisée in vitro. Brièvement, les protéines marquées étaient incubées avec le premier anticorps dirigé contre l’épitope Flag préfixé aux billes protéine G-agarose. Les protéines collectées grâce à l’anticorps anti-Flag étaient ensuite séparées par électrophorèse sur gel SDS-PAGE 10%, et révélées par autoradiographie.
Tel qu’illustré aux figures 11, 12 et 13, les protéines Flag-NS3 (70 kDa), Flag-NS5B (68 kDa) ainsi que les peptides viraux Flag-DHCV36 (20,2 kDa), DHCV87-Flag (25,6 kDa), DHCV4-Flag (9,8 kDa) et Flag-DHCV94 (9,2 kDa) ont pu être immunoprécipité par l’anticorps anti-Flag (voir figures 11-13). Une bande correspondant à Dicer était détectée par autoradiographie, suggérant que Dicer peut interagir avec ces protéines et peptides viraux in vitro.
Figure 11 : Étude de coimmunoprécipitation in vitro entre Dicer/NS3 et Dicer/NS5B.
1, 2, 4 et 5, les protéines Dicer, Flag-NS3 et Flag-NS5B produites par transcription/traduction (TT) in vitro; 3 et 6, IP de Flag-NS3 et Flag-NS5B, incubés en présence de Dicer, à l’aide de l’anticorps anti-Flag; -, puit vide. Les protéines marquées au 35S étaient détectées par autoradiographie.
Figure 12 : Étude de coimmunoprécipitation in vitro entre Dicer/DHCV36 et Dicer/DHCV87.
1, 2, 4 et 5, les protéines Dicer, Flag-DHCV36 et DHCV87-Flag produites par transcription/traduction (TT) in vitro; 3 et 6, IP des peptides Flag-DHCV36 et DHV87-Flag, incubés en présence de Dicer, à l’aide de l’anticorps anti-Flag; -, puit vide. Les protéines marquées au 35S étaient détectées par autoradiographie.
Figure 13 : Étude de coimmunoprécipitation in vitro entre Dicer/DHCV4 et Dicer/DHCV94.
1, 2, 4 et 5, les protéines Dicer, DHCV4-Flag et Flag-DHCV94 produites par transcription/traduction (TT) in vitro; 3 et 6, IP des peptides DHCV4-Flag et Flag-DHCV94, incubés en présence de Dicer, à l’aide de l’anticorps anti-Flag; -, puit vide. Les protéines marquées au 35S étaient détectées par autoradiographie.
Nous avons ensuite utilisé des billes protéine G-agarose vides afin de documenter l’adsorption non-spécifique des protéines à celles-ci dans le cadre d’expérience de coIP in vitro. Nous avons également effectué des IPs à l’aide d’IgG non-spécifiques de souris.
Les résultats indiquent la présence d’une certaine quantité de protéines qui se fixent sur les billes de manière non-spécifique (voir figure 14, puits 4 et 5 et figure 15, puits 4 et 5). Cependant, l’intensité des bandes correspondant à Dicer avec DHCV4 et DHCV94 immunoprécipités par l’anticorps anti-Flag est légèrement supérieure à celle des témoins négatifs (voir figure 14 puit 3 vs puits 4 et 5, et figure 15 puit 3 vs puits 4 et 5). Ces observations laissent entrevoir la possibilité que Dicer puisse interagir avec les peptides viraux DHCV4 et DHCV94 in vitro.
Figure 14 : Étude de coimmunoprécipitation in vitro entre Dicer et DHCV4.
1 et 2, les protéines Dicer et DHCV4-Flag produits par transcription/traduction (TT) in vitro. 3, IP de DHCV4-Flag, incubé en présence de Dicer, à l’aide de l’anticorps anti-Flag; 4, IP contrôle réalisée en absence d’anticorps; 5, IP contrôle réalisée à l’aide d’IgG de souris; -, puit vide. Les protéines marquées au 35S étaient détectées par autoradiographie.
Figure 15 : Étude de coimmunoprécipitation in vitro entre Dicer et DHCV94.
1 et 2, les protéines Dicer et Flag-DHCV94 produites par transcription/traduction (TT) in vitro. 3, IP de Flag-DHCV94, incubé en présence de Dicer, à l’aide de l’anticorps anti-Flag; 4, IP contrôle réalisée en absence d’anticorps; 5, IP contrôle réalisée à l’aide d’IgG de souris; -, puit vide. Les protéines marquées au 35S étaient détectées par autoradiographie.
© Cherifa Ayari, 2005
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| Chapitre 2 Matériels et méthodes |  | Chapitre 4 Discussion et conclusion |
