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Chapitre 4 Discussion et conclusion

La complexité des interactions hôte-virus, la persistance et la résistance virale peuvent être associées, du moins en partie, à différentes stratégies développées par certains virus afin d’échapper à l’immunité anti-virale. Parmi ces stratégies, notons la production de protéines virales interagissant avec certaines composantes de l’hôte ayant pour effet d’interférer avec leur fonction biologique ou de les détourner pour leur propre réplication. La susceptibilité du génome du VHC à l’action de Dicer in vitro, mais non in vivo, nous porte à croire que certaines protéines du VHC pourraient interférer avec celle-ci afin d’échapper à la voie de l’iARN.

Dans cette présente étude, nous avons étudié l’interaction potentielle entre Dicer et les protéines non-structurales du VHC. Pour réaliser notre objectif, nous avons criblé une banque d’ADNc du VHC afin d’identifier les protéines/peptides pouvant interagir avec Dicer à l’aide du système du double-hybride chez la levure. L’un des désavantages de ce système est l’auto-activation des gènes rapporteurs, en particulier celui de l’histidine. Pour pallier à ce problème, nous avons eu recours au vecteur de faible expression pGBT9 (Provost et al., 2001). De plus, nous avons utilisé le 3-AT, un inhibiteur compétitif de l’histidine chez la levure, lors de l’essai du gène rapporteur His3. D’autre part, la lignée de levure PJ69-4A présente l’avantage d’avoir les trois gènes rapporteurs combinés sous le contrôle de trois promoteurs GAL4 différents (GAL1-HIS3, GAL2-ADE2 et GAL7-lacZ), réduisant ainsi l’émergence de faux positifs (Chen et al., 1997).

Les différents peptides du VHC pouvant interagir avec Dicer dans le double-hybride (voir figure 8) proviennent aussi bien des protéines structurales (E1 et E2) que des protéines non-structurales (NS3, NS4B et NS5B). Les peptides viraux dérivés de NS3 (DHCV17, 36 et 87) et NS5B (DHCV4 et 94) sont ceux qui interagissent le plus fortement avec Dicer dans ce contexte expérimental. La conformation, la taille et la surface exposée de ces peptides peuvent influencer leur interaction avec Dicer. Par ailleurs, la présence des domaines DA et DLA fusionnés aux protéines étudiées dans les expériences du double-hybride peuvent également influencer ces interactions.

Le peptide DHCV17 fait partie du domaine protéase N-terminal de NS3, tandis que les peptides DHCV87 et DHCV36 chevauchent les domaines protéase et NTPase/hélicase. Cela suggère que cette interaction implique davantage le domaine protéase. Il serait intéressant de tester cette interaction en enlevant le domaine protéasique de NS3 ou de le fusionner avec une autre protéine qui n’interagit pas avec Dicer.

Nous avons également identifié les portions de Dicer qui peuvent lier ces peptides viraux (voir tableau 5). Le domaine N-terminal, présentant une possible fonction hélicase, lie efficacement les peptides DHCV4 et DHCV94 dérivant de la polymérase NS5B. Quant aux domaines central (contenant le domaine PAZ) et C-terminal (contenant les domaines RIIIa, RIIIb et dsRBD) de Dicer, ils sont cruciaux dans l’interaction avec les peptides DHCV87 et DHCV36. Ces observations intriguantes soulevent plusieurs hypothèses évoquant la nature de cette interaction. Cependant, NS3, NS5B ou les peptides viraux n’interagissent pas de façon significative avec le domaine dsRBD de Dicer, excluant une possible modulation de la capacité de Dicer à lier les ARNdb.

Une faible interaction a été observée entre Dicer et les protéines NS3 et NS5B complètes (voir tableau 4). Ceci n’exclut pas l’existence d’une interaction significative dans un autre contexte et pourrait être dû, du moins pour NS5B, à la présence de son domaine hybrophobe en position C-terminal. Ce domaine hydrophobe, ayant pour rôle l’ancrage de NS5B aux membranes de la cellule hôte, pourrait cependant gêner le transport de la protéine de fusion (DA-NS5B) au noyau, site d’activation de la transcription des gènes rapporteurs. En effet, des chercheurs ont réussi à restaurer une interaction entre NS5B et l’α-actinine, une composante cellulaire requise pour la réplication virale, dans le système du double-hybride chez le levure en éliminant les 21 a.a hydrophobes à l’extrémité C-terminal de NS5B, facilitant ainsi la solubilité et le transport nucléaire de celle-ci (Lan et al., 2003). Il serait donc intéressant de refaire l’expérience en retirant ce domaine hydrophobe de la protéine NS5B.

La banque d’ADNc viral dérivé du génome du VHC a été crée de façon aléatoire. Il serait donc important d’examiner plus en détails les portions peptidiques pouvant interagir avec Dicer par des études de délétion et/ou de mutagénèse dirigée.

Dans un deuxième temps, nous avons voulu confirmer les résultats obtenus en double-hybride par l’approche de la coIP. Nous nous sommes concentré sur les protéines non-structurales NS3 et NS5B, puisque ces deux protéines présentent plusieurs peptides montrant une interaction avec Dicer dans les expériences du double-hybride. La coIP in vivo et in vitro représente une alternative de choix aux possibles problèmes de transport nucléaire de NS5B dans le contexte du double-hybride.

Le système de réplicon, exprimant les protéines non-structurales du VHC dans les cellules Huh7, a fourni un outil expérimental intéressant afin d’étudier l’interaction entre Dicer et les protéines du VHC in vivo. Chez ces cellules, nous avons pu détecter une interaction entre Dicer et NS5B par coIP in vivo (voir figure 9). Quant à NS3, aucune interaction n’a été observée dans ce contexte expérimental (voir figure 10). Ceci peut être relié, du moins en partie, à une compartimentation de NS3. Ces expériences ont pu être reproduites à trois reprises.

Grâce au système de transcription/traduction in vitro, nous avons pu produire efficacement Dicer, NS3, NS5B, les peptides DHCV36 et DHCV87 dérivant de NS3 ainsi que DHCV4 et DHCV94 dérivant de NS5B. Les résultats obtenus des coIP in vitro semblaient indiquer une interaction entre les protéines ou peptides viraux et Dicer (voir figures 11-13). Cependant, il a fallu avoir recours à des contrôles supplémentaires afin de tenir compte de l’apparente adsorption de certaines protéines/peptides aux billes. Malgré l’optimisation de nombreux paramètres expérimentaux, le bruit de fond n’a pu être diminué davantage. Toutefois, il est intéressant de constater qu’avec les peptides DHCV4 et DHCV94, l’intensité des bandes immunoprécipitées spécifiquement semblait plus importante. Il serait important de répéter les expériences avec NS3, NS5B ainsi qu’avec les autres peptides viraux avec ces témoins négatifs, tout en changeant certaines conditions (composition des tampons, nature du détergent, blocage des billes, modification du temps d’incubation, lavages, température, etc.) afin de diminuer davantage, voire éliminer, le bruit de fond.

La présente étude pourrait être prometteuse et encourageante pour développer d’avantage l’hypothèse d’une interaction entre le VHC et la voie de l’iARN. Il serait intéressant d’étudier l’impact de cette interaction sur l’activité de Dicer et l’efficacité de la voie de l’iARN. Par ailleurs, la conception de nouveaux systèmes de culture du VHC permettra l’étude in vivo des protéines structurales et non-structurales dans un contexte plus proche de la situation clinique.

Note : Au cours de la rédaction de ce mémoire, une étude analogue à la nôtre et appuyant notre hypothèse a identifié, pour la première fois, une interaction entre Dicer et une protéine virale, soit la protéine Tat du VIH-1. Tat permettrait possiblement au virus d’échapper à l’action de la voie de l’iARN (Bennasser et al., 2005).

© Cherifa Ayari, 2005