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ANNEXE C : Détails de l’analyse anatomique

Table des matières

L’annexe C présente des détails sur la méthode de double coloration et le traitement d’image réalisé en utilisant le logiciel de morphologie mathématique Micromorph 1.3.

La double coloration a été réalisée dans le but de faciliter la différenciation des éléments anatomiques du bois. Les parois cellulaires sont composées de divers polysaccharides et de quelques protéines structurales. Elles peuvent être colorées par des colorants anioniques, comme l’aniline bleue et le vert lumière (fast green), et par des colorants cationiques, comme le bleu alcian (Graham et Joshi 1995). Les substances colorantes peuvent être utilisées pour différencier les structures primaires et secondaires, montrer la présence de lignine dans les parois cellulaires, etc. Le choix du colorant à utiliser dépend de la structure à analyser et du contraste souhaité entre les éléments du bois. Le tableau C.1 montre la substance à colorer et une série de produits recommandés pour réaliser la coloration.

La combinaison de plusieurs colorants est un outil qui facilite l’identification microscopique des différents éléments anatomiques, comme par exemple la coloration quadruple. Cette dernière utilise la safranine O (qui colore les tissus lignifiés et cutinisés en rouge), le vert lumière (qui colore la cellulose des parois cellulaires en vert), le cristal violet (qui colore les grains d’amidon en pourpre) et l’orange G (qui colore les parois cellulaires de jaune à vert) (Lillie 1969). Une des combinaisons les plus utilisées est la double coloration safranine - vert lumière. Avec cette coloration nous pouvons remarquer les fibres rouges et les cellules de parenchyme vertes (dû à l’action de ce colorant avec les polysaccharides). Dans le cas du xylème lignifié, des botanistes utilisent le vert de méthyle combiné à l’acide fuchsine (Lillie 1969).

Des essais préliminaires ont été réalisés pour déterminer le temps de coloration le plus adéquat pour chaque espèce étudiée. Les étapes de double coloration sont présentées ci-dessous (Cloutier 2002) :

  • Blanchiment des coupes

  • Déshydratation

  • Coloration à la safranine (temps a varié selon espèce - Tableau C.2)

  • Déshydratation et lavage des coupes

  • Coloration au vert lumière (temps a varié selon espèce - Tableau C.2)

  • Éclaircissement dans l’essence de girofle

  • Nettoyage au trichloroéthane

  • Montage permanent

La figure C.1 montre le résultat de la méthode de double coloration pour les coupes transversales des sept espèces étudiées.

Compte tenu du nombre important d’images et de la présence de différents éléments anatomiques de formes similaires (formes arrondies des vaisseaux et des cellules des fibres), il est difficile d’effectuer directement une analyse systématique via le logiciel Wincell. Afin de palier à ces difficultés un traitement des images a été opéré. Ce traitement consiste à effectuer une segmentation des images, sur la base de critères objectifs, afin d’isoler les éléments anatomiques étudiés. La segmentation consiste à construire une représentation symbolique de l’image i.e. définir une carte de l’image qui décrit les régions homogènes selon un critère établi a priori (Serra 1998). Le logiciel Micromorph® (CMM/ARMINES/ Transvalor) est un outil puissant, basé sur la morphologie mathématique, qui permet une analyse d’image efficace et contrôlée. La morphologie mathématique est une démarche de type non linéaire, fondée sur la théorie des ensembles, qui du point de vue informatique consiste en une série d’algorithmes et de programmes aboutissant au traitement, à l’analyse d’images et à la modélisation de matériaux. L’objectif du traitement d’image est de retirer un maximum d’information de l’image en évitant des altérations ou une trop grosse perte d’information. Dans ce projet, seul le traitement et une analyse simple de la porosité des images ont été mises en oeuvre avec le logiciel Micromorph®. Par la suite, les images traitées ont fait l’objet de mesures précises et systématiques via le logiciel Wincell.

La démarche de traitement de type non linéaire via l’usage des outils mis à disposition par la morphologie mathématique. Cette méthode est basée sur plusieurs notions que sont les opérations simples sur des ensembles, le filtrage, les hiérarchies, la segmentation, les ensembles aléatoires, la ligne de partage des eaux et autres opérations géodésiques. Il s’agit d’utiliser la théorie des ensembles afin de lier propriétés physiques des objets et textures des structures. La structure fondamentale est le treillis complet dont les transformations premières sont la croissance, la dilatation et l’érosion. Pour la clarté du propos, nous allons présenter brièvement deux des opérations simples qui sont à la base des traitements opérés : l’érosion et la dilatation (Figure C.2).

Erosion:

Soit B un élément structurant et Bx cet élément centré en un pixel x. L’érosion consiste à poser en chaque pixel x d’un objet X, la question : « Bx est-il contenu entièrement dans X? ». L’ensemble des positions x correspondant à une réponse positive forme le nouvel ensemble Y, appelé érodé de X par B. En terme mathématique cet ensemble satisfait l’équation suivante:

Dilatation :

L’opération de dilatation se définit de manière analogue à l’érosion. En prenant le même élément structurant Bx, on pose pour chaque point x la question « Bx touche-t-il l’ensemble X ? ». C’est-à-dire, y-a-t-il une intersection non vide entre Bx et X ? L’ensemble des points de l’image correspondant aux réponses positives forme le nouvel ensemble X des dilatés de X.

Le traitement s’effectue par lot d’images tel que présenté à la section C.2.3. La nature des éléments anatomiques à étudier modifie le type d’opération nécessaire à la segmentation et il serait fastidieux de présenter chacun des programmes ou séquence d’opérations réalisés. Il apparaît plus raisonnable de présenter de façon claire la segmentation de l’un des lots d’images. En l’occurrence, le traitement des images des vaisseaux de l’essence huayruro présente suffisamment de difficultés, avec des éléments de tailles assez variées, pour être un bon cas d’espèce. Une fois cet exemple complété, les spécificités de chacun des lots seront discutés brièvement sous la forme d’un tableau récapitulatif.

Exemple: Segmentation des vaisseaux de l’essence huayruro (Tableau C.4)

Le point de départ consiste en un lot de 40 images en niveau de gris qui seront traitées avec une même séquence d’opération et donc un seul programme. Le but de ce traitement est d’isoler les vaisseaux qui ont une forme plutôt sphérique compte tenu des coupes microscopiques observées. Les opérations sont décrites pour une image mais chacune des images a subi la même séquence de façon automatique (boucle informatique). Voici les principales étapes du programme:

  • Seuillage (fonction imthresh)

Il s’agit de transformer une image à niveau de gris en une image binaire sur laquelle seule la plupart des opérations morphologiques sont possibles. Le résultat est une image en noir et blanc. L’information sur les vaisseaux faisant désormais partie intégrante de l’un des deux ensembles définis. À ce stade l’image des vaisseaux est fortement bruitée et contient de nombreux éléments indésirables.

  • Homogénéisation des ensembles (fonction clohole)

Cette procédure bouche les pores internes des ensembles. Il s’agit d’une application de la géodésie.

  • Ouvertures (fonction open)

Cette opération est l’application d’une érosion et d’une dilatation avec un élément structurant de même taille. Pour cette fonction l’élément structurant est assimilé à un cercle (en réalité un hexagone ou un carré selon la trame choisie). Le but est d’éliminer les éléments sphériques plus petits que la taille de l’élément structurant, de supprimer certaines parties (isthmes, branches et autres éléments approchants) ou de lisser les contours des éléments de l’ensemble. Une première ouverture de petite taille permet d’éliminer le bruit dû aux petits éléments. Une ouverture de plus grande taille permet de conserver des images tampons des éléments ou vaisseaux sphériques assez grands. Ces images tampons sont la base de nos futurs marqueurs.

  • Ouvertures directionnelles (fonction diropen)

L’ouverture directionnelle a pour élément structurant un segment orienté de taille variable. Cette étape permet d’obtenir des images tampons discriminantes qui ne contiennent plus que certains éléments de taille et d’orientation privilégiée choisies. Ce sont d’autres marqueurs des vaisseaux de forme moins sphérique.

  • Création de marqueurs (fonction binultim)

Cette opération consiste en une érosion ultime de l’ensemble d’une image. Le résultat produit une image où chaque élément de l’ensemble est réduit à un point unique (pixel représentant son centre). Afin d’éviter le parasitage lors du marquage, seuls les points centraux des éléments identifiés comme des vaisseaux seront utilisés.

  • Combinaison d’images (fonction imor)

Ce sont des opérations booléennes sur des images binaires. La fonction imor effectue la réunion des ensembles de deux images dans une troisième. Il s’agit de réunir l’ensemble des marqueurs (points centraux des vaisseaux) dans une même image.

  • Reconstruction de l’image des vaisseaux (fonction build)

Cette étape s’effectue par reconstruction binaire à l’aide de marqueur. L’image est reconstituée sur la base de l’image binaire homogénéisée grâce aux marqueurs créés qui représentent uniquement les centres des vaisseaux. L’intérêt provient du fait que l’on récupère les éléments vaisseaux tels qu’ils étaient après le seuillage et l’homogénéisation (l’augmentation des opérations morphologiques conduit à une perte d’information systématique). L’image segmentée conserve donc au maximum l’information de départ concernant les vaisseaux. L’image obtenue est sauvée et après vérification constitue la segmentation attendue.

  • Mesure de la porosité due aux vaisseaux (fonction imvolume)

Cette fonction mesure la somme des valeurs des pixels de l’image. L’ensemble des pixels blancs de valeur 1 représente la surface des vaisseaux sur l’image. Connaissant la dimension de l’image en pixels, on obtient aisément la porosité due aux vaisseaux.

La description détaillée du programme montre la qualité du contrôle du traitement appliqué aux images (Tableau C.5). Les résultats sont présentés par la suite pour l’ensemble des lots. Il est important de noter que certaines images présentent des difficultés particulières (luminosité, qualité et autres défauts). Dans certains cas, assez rares, les images ont été traitées individuellement.

Les Figures C.3 et C.4 montrent des exemples du résultat du traitement d’image pour les différentes espèces étudiées (directions transversale et tangentielle).

© Giana Almeida, 2006