Les hémoglobines tronquées de Agrobacterium tumefaciens C58

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• Figure 1.1. Représentation de la structure de la Mb de cachalot. A) Les hélices A à H forment le repliement globine B) Représentation des poches proximales et distales de l’hème définies par les hélices E et F. (Pesce et al. 2002)
• Figure 1.2. Structure de l’hème de type bqui est également nommé protoporphyrine IX.
• Figure 1.3. Schéma des états de coordination du Fer de l’hème. A)Pentacoordonné (5C), le site de fixation distal est libre d’accès aux ligands,B) Hexacoordonné (6C), le site de fixation distal est occupé par le résidu histidine provenant de la poche distale comme chez la neuroglobine, mais peut également être un autre résidu.
• Figure 1.4. Structure de la Mb de cachalot incluant les cavités occupées par les molécules de xénon(rouge). Les cavités Xe1 et Xe2 sont retrouvées près l’une de l’autre du côté proximal de l’hème, Xe3 est près de la surface de la protéine et loin de l’atome de Fer et Xe4 est du côté distal de l’hème. (Brunori et al. 2001).
• Figure 1.5. Superposition des structures de l’Hbtr de C. eugametos (en rouge) et de la Mb de cachalot (en vert).Les deux structures ont en commun moins de 60 C_αconcentrés du côté distal de l’hème. La nomenclature des hélices est basée sur la structure de la Mb. (Wittenberg et al. 2002).
• Figure 1.6. Diverses représentations du réseau de pont hydrogène stabilisant les ligands. Hbtrs de A) P. caudatum , PHb, B) C. eugametos , CHb, C) M. tuberculosis , HbN, D) M. tuberculosis , HbO. (Pesce et al. 2000, Milani et al. 2003 et Wittenberg et al. 2002).
• Figure 1.7. Superposition des structures des Hbtrs de M. tuberculosis , HbO (orange/rouge) et HbN (vert/bleu). Le réseau de cavités est très différent entre les deux Hbtrs. La nomenclature des hélices est basée sur la structure de HbO. (Milani et al. 2003).
• Figure 1.8. Exemples de tumeurs produites par A. tumefaciens chez A) pommier B) pêcher C) tomates D) carottes coupées. (http://www.agf.gov.bc.ca/cropprot/tfipm/crowngall.htm, http://www.ipm.ucdavis.edu/PMG/r602101211.html, http://helios.bto.ed.ac.uk/bto/microbes/crown.htm)
• Figure 1.9. Schéma résumant le système de défensedes plantes. L’interaction incompatible entre un pathogène et une plante engendre une réponse de défense. La résistance à la maladie par différents intermédiaires. (Figure adaptée de Dangl 1998)
• Figure 1.10. Activation de la sGC.(Ballou et al. 2002).
• Figure 1.11. Ligands de l’hème de CooA selon l’état d’oxydoréduction du Fer.(Thorsteinssonet al. 2001).
• Figure 2.1. Schéma des principales étapes de la construction du vecteur suicide pSK-∆ AtuHb2 /SacB/kan. A) vecteur de départ pSK^-/SacB/kan digéré partiellement avec l’enzyme de restriction EcoRI . B) ligature entre le vecteur et le fragment d’ADN génomique AtuHb2 de 2181 pb. C) digestion au site BclI et NarI pour inactiver le gène AtuHb2 . D) remplissage des extrémités et recircularisation du vecteur. E) vecteur suicide pSK-/∆ AtuHb2/ SacB/kan.
• Figure 2.2. Schéma des principales étapes de la construction du vecteur suicide pSK-∆ AtuHb3 /SacB/kan.A) vecteur de départ pSK^- /SacB/kan digéré partiellement avec l’enzyme de restriction EcoRI . B) ligature entre le vecteur et le fragment d’ADN génomique AtuHb3 de 1813 pb. C) digestion du site SalI pour inactiver le gène AtuHb3. D) remplissage des extrémités SalI et recircularisation du vecteur. E) vecteur suicide pSK^- /∆ AtuHb3/ SacB/kan.
• Figure 2.3.Dénombrement des bactéries viables dans les tumeurs .
• Figure 2.4. Montage de la cuvette de Graham et du système pour équilibrer avec le NO(g).
• Figure 3.1 Organisation génomique de AtuHb2 et AtuHb3 . A) Fragment de 5800 pb comprenant le gène AtuHb2 . B) Agrandissement de la région entre AtuHb2 et AGR_C_4318 . C) Fragment de 6700 pb comprenant le gène AtuHb3 .
• Figure 3.2 Immunodétection de la protéine AtuHb2 dans des extraits de protéines cytoplasmiques d’ A. tumefaciens .(A) Analyse Western du sérum préimmun de lapin (dilution 1 :500). 100 ng (puits 1) et 10 ng (puits 2) de protéine. (B) Analyse Western des protéines solubles provenant d’une culture d’ A. tumefaciens (sérum dilué à 1 :1000). 5 ng de AtuHb2 pure (puits 1), 10 µg d’extrait en phase stationnaire (puits 2), 10 µg d’extrait en phase exponentielle (puits 3), 10 µg d’extrait protéique de la souche ∆ AtuHb2 en phase exponentielle (puits 4). (C) Gel non-transféré coloré au bleu de Coomassie (0,5%). 10 µg d’extrait protéique en phase stationnaire (puits 1), 10 µg d’extrait protéique en phase exponentielle (puits 2), 10 µg d’extrait protéique de la souche ∆ AtuHb2 en phase exponentielle (puits 3). La position des standards de poids moléculaire est indiquée à droite.
• Figure 3.3. Organisation génique et sites de restriction des vecteurs suicides.(A) pSK^-∆ AtuHb2 /SacB/Kan et (B) pSK^- ∆ AtuHb3 /SacB/Kan.
• Figure 3.4. Analyse PCR des clones obtenus suite au deuxième événement de recombinaison pour l’inactivation de AtuHb2 . Un amplicon de 418 pb représente l’amplification du gène AtuHb2 sauvage (puits 4, 8, 9,10 et 13) et un amplicon de 250 pb celui du gène inactivé (puits 11 et 12). Les clones obtenus après la première sélection ont deux amplicons représentant le gène sauvage et inactivé (puits 5, 6 et 7). (1,5 % agarose)
• Figure 3.5. Autoradiogramme de l’inactivation du gène AtuHb2 . L’hybridation avec le fragment d’ADN génomique AtuHb2 digéré avec l’enzyme de restriction EcoRV révèle une seule bande de 6387 pb chez les clones mutants (puits 6 et 8) et deux fragments de 2401 et de 4154 pb chez les clones sauvages (puits 4 et 9), comme attendu par la séquence d’ADN g.nomique. Le clone dont les bandes sont à 2401, 5292 et 7110 pb provient de la première sélection et s’est intégré en 3’ du fragment sauvage (puits 5) tandis que le clone dont les bandes sont à 1182, 4154 et 9465 pb provient de la première sélection, mais s’est intégré en 5’ du fragment sauvage (puits 7). L’hybridation avec le vecteur seul donne un signal seulement chez les clones issus de la première sélection (puits 5 et 7) et confirme que le vecteur a bien été éliminé chez les souches mutantes. Les marqueurs de masse moléculaire sont déposés dans le puits 1, une digestion du vecteur seul est déposée dans le puits 2 et du vecteur suicide dans le puits 3.
• Figure 3.6. Autoradiogramme de l’inactivation du gène AtuHb3 . L’hybridation avec le fragment d’ADN génomique AtuHb3 digéré avec l’enzyme de restriction SalI révèle une seule bande de 6220 pb chez les clones mutants (puits 5, 6, 7, 9 et 10) et deux fragments de 2000 et 4200 pb chez les clones sauvages (puits 3, et 11), comme attendu par la séquence d’ADN génomique. Les clones ayant des bandes à 2000 et 12000 pb proviennent de la première sélection et se sont intégrés en 3’ du fragment sauvage (puits 4 et 8). Les marqueurs de masse moléculaire sont déposés dans les puits 1 et 2.
• Figure 3.7. Test de virulence des différentes souches d’ A. tumefaciens sur des feuilles de K. daigremontiana . A) Photo prise 4 jours après l’inoculation. B) Photo prise 21 jours après l’inoculation. Des tumeurs sont visibles lors des inoculations avec les souches mutantes et la souche sauvage (C58). La souche avirulente (A136) n’a pas induit de tumeur tel qu’attendu.
• Figure 3.8. Gel SDS-PAGE 15 % des différents aliquotes conservés à chaque étape de la purification de AtuHb2coloré au bleu de Coomassie (0,5 %). (Puits 1) marqueurs de masse moléculaire « broad range » de Bio-Rad, (puits 2) surnageant après le bris des cellules (5µg), (puits 3) surnageant du fractionnement 0-25 % (NH₄)₂SO₄(5µg), (puits 4) culot du fractionnement 25-80 % (NH₄)₂SO₄(5µg), (puits 5) après DEAE (5µg), (puits 6) après tamisage (5µg), (puits 7) après tamisage (10µg).
• Figure 3.9 Détermination de la masse moléculaire de AtuHb2. A) Tamisage moléculaire dans le tampon 50 mM MPO₄/50µM EDTA/15 mM NaCl. B) Tamisage moléculaire dans le tampon 50 mM MPO₄/50µM EDTA/300 mM NaCl.
• Figure 3.10. Spectres d’absorption de la forme ferreuse de AtuHb2 (10 µM) et de la forme ferrique après soit oxydation, soit dialyse.A) région de la bande de Soret, B) région du visible, C) dérivée seconde.
• Figure 3.11. Spectres d’absorption de la forme ferreuse de AtuHb2 (12 µM) suite à une exposition à l’air. Le tracé t3 montre qu’une fraction de la protéine est oxygénée, car la région du visible montre des bandes à 547 et 576 nm. A) région de la bande de Soret, B) région du visible. Il est à noter la présence de deux séries de points indiquant la transition entre trois formes.
• Figure 3.12. Spectres d’absorption des complexes CO, ferreux NO, ferrique NO et CN de AtuHb2 (10 µM).A) région de la bande de Soret, B) région du visible.
• Figure 3.13. Spectres d’absorption de AtuHb2 (10 µM) de la forme ferrique après la formation du complexe ferrique NOet après 17,8 heures. A) région de la bande de Soret, B) région du visible, C) dérivée seconde.
• Figure 3.14. Spectres d’absorption de la titration de la forme ferriquede AutHb2 (5 µM). A) région de la bande de Soret et B) région du visible. Il n’y a pas de points isobestiques communs à tous les spectres, indiquant la présence d’au moins un intermédiaire.
• Figure 3.15. Spectres d’absorption de la titration de la forme ferreuse de AtuHb2(5 µM). A) région de la bande de Soret et B) région du visible.
• Figure 3.16. Région des hautes fréquences du spectre de résonance Raman de AtuHb2(laser 413,3 nm). A) forme ferrique, 10 mW, B) forme ferreuse, 5 mW.
• Figure 3.17. Région des hautes fréquences du spectre de résonance Raman du complexe CO de AtuHb2 (laser 413,3 nm).A) 37 mW, B) 1 mW.
• Figure 3.18. Région des hautes fréquences du spectre de résonance Raman du complexe CO de AtuHb2 (laser 441,5 nm).A) 34 mW, B) 7,3 mW.
• Figure 3.19 Région des basses fréquences du spectre de résonance Raman du complexe CO de AtuHb2(laser 441,5 nm). A) 35 mW, B) 7,3 mW, C) Spectre différentiel puissance 35 mW-7,3 mW.
• Figure 3.20. Région des super hautes fréquences du spectre de résonance Raman du complexe CO de AtuHb2(laser 413,3 nm, 3,7 mW). A)¹²C¹⁶O, B)¹³C¹⁸O, C) spectre différentiel¹²C¹⁶O-¹³C¹⁸O.
• Figure 3.21. Région des basses fréquences du spectre de résonance Raman du complexe CO de AtuHb2(laser 413,3 nm, 3,7 mW). A)¹²C¹⁶O,B)¹³C¹⁸O, C) spectre différentiel¹²C¹⁶O-¹³C¹⁸O.
• Figure 3.22. Graphique illustrant la corrélation entre la fréquence des modes ν_Fe-COet ν_C-Ode plusieurs protéines hémiques. La droite noire représente la courbe de corrélation chez les protéines hémiques dont le Fer est coordonné à une histidine du côté proximal. La droite bleue représente la courbe de corrélation de protéines hémiques dont le Fer est coordonné à une cystéine du côté proximal. Le signereprésente les protéines de la famille des Mbs et des Hbtrs,de la famille de FixL,de la famille des NOS etde la famille des P450. Le point noir ( ) correspond à AtuHb2 et est situé sur la courbe de corrélation correspondant aux protéines ayant une histidine du côté proximal.
• Figure 4.1 Schéma de la réduction du Fer par le NO. (Fernandez et al. 2004).