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Chapitre 1 : Introduction aux concepts de base

Table des matières

Ce chapitre traitera des différents sujets qui seront abordés dans l’article qui constitue le chapitre 2. Tout d’abord, j’introduirai les notions de base concernant le muscle squelettique, le tissu adipeux et l’artère. Je poursuivrai avec l’introduction de molécules pertinentes à la compréhension des différentes sections. Ensuite, les pathologies reliées au modèle animal que nous avons choisi pour notre projet de recherche seront développées, ainsi que les différents traitements utilisés, en axant plus particulièrement sur les antioxydants. Ce chapitre se terminera par la description des problèmes et buts de l’étude ainsi que par les détails concernant l’approche expérimentale.

Le muscle squelettique est composé de myocytes polynucléés, ou fibres musculaires qui ont une forme allongée et cylindrique favorisant leur contraction provoqué par les filaments d’actine et de myosine [1]. Le corps humain est composé d’environ 600 muscles squelettiques eux-mêmes composés de centaines de milliers de fibres musculaires représentant un peu moins de la moitié de la masse corporelle totale et dont la majorité sont reliés aux os par des tendons [2]. Les fibres musculaires peuvent être divisées en trois groupes selon leur capacité oxydative envers l’utilisation des lipides [1, 3]. Premièrement, les fibres de type I à contraction lente (rouges) sont des fibres dotées d’une haute capacité oxydative, mais d’une faible capacité glycolytique et glycogénolytique [1, 3]. Le soleus est un muscle typiquement de type I. Deuxièmement, les fibres de type IIa sont des fibres à contraction rapide (de roses à rouges) dont la capacité oxydative est intermédiaire et elles chevauchent souvent celle des fibres de type I [1, 3]. Ces fibres possèdent également une haute capacité glycolytique et glycogénolytique. La partie profonde rouge du vastus lateralis proche du fémur, ainsi que la partie rouge du gastrocnémien sont constituées principalement de fibres de type IIa. Troisièmement, les fibres de type IIb sont des fibres glycolytiques à contraction rapide (blanches ou pâles) et à faible capacité respiratoire. Elles utilisent presque qu’exclusivement le glucose ou le glycogène comme carburant [1, 3]. La partie superficielle blanche du vastus lateralis et la portion blanche du gastrocnémien sont principalement constituées de fibres de type IIb. Les fibres rouges à contraction lente (type 1) sont adaptées aux activités d’endurance ou de maintien de la posture, les fibres de type IIa sont plutôt adaptées à la marche et au sprint, tandis que les fibres de type IIb sont adaptées aux mouvements puissants ou intenses de courte durée [1]. Ces fibres se fatiguent rapidement à l’effort. Les muscles squelettiques peuvent être maîtrisés volontairement et ils ont une remarquable faculté d’adaptation, car ils permettent aux mêmes muscles d’effectuer des mouvements en douceur ou d’une grande force [1]. Le muscle squelettique est aussi le principal consommateur de glucose dans l’organisme [4].

La vascularisation du muscle squelettique est essentielle à son fonctionnement. Les artères fournissent aux muscles les nutriments et l’oxygène nécessaires, tandis que les veines débarrassent les muscles des déchets provenant du travail musculaire (acide lactique, dioxyde de carbone) [1]. Dans les muscles squelettiques, le débit sanguin est extrêmement variable, car il est lié au degré d’activité physique [1]. En effet, plus l’activité est intense, plus les capillaires sous-cutanés ou associés à la digestion se contractent pour permettre un plus grand volume sanguin dans les capillaires des muscles squelettiques [1]. De plus, des études ont démontré que les fibres oxydatives (dont principalement le type I) sont très sensibles à l’insuline. L’insuline est essentiellement l’hormone qui facilite l’entrée du glucose dans la cellule musculaire en stimulant la translocation des transporteurs de glucose (GLUT4) contenus dans des vésicules cytoplasmiques vers la membrane plasmique [5]. L’insuline régule aussi la réactivité et le tonus vasculaire dans le muscle squelettique [6]. Les actions glucorégulatrices et vasculaires de l’insuline seront discutées ultérieurement.

Le tissu adipeux (constitué d’adipocytes) est un tissu conjonctif aréolaire (arrangement lâche de ses fibres) modifié en vue du stockage de nutriments [1]. Il est surtout constitué de fibroblastes, de macrophages, de cellules adipeuses et de mastocytes [1]. La majeure partie du volume cellulaire des adipocytes est occupée par une gouttelette lipidique luisante composée presque entièrement de triglycérides (TG) [1]. Le tissu adipeux est aussi très vascularisé témoignant de sa grande activité métabolique [1]. De ce fait, le tissu adipeux est aussi un organe endocrine hautement actif, car il sécrète une panoplie de produits solubles qui ont des actions locales ou distantes (Tableau 1) [7]. Les hormones sécrétées ont des rôles métaboliques importants au niveau de la reproduction, de la fonction cardiovasculaire et de l’immunité [1]. Cette fonction endocrine du tissu adipeux est influencée par la masse grasse totale et sa distribution [8]. En effet, de faibles niveaux de leptine chez un individu ayant une petite masse grasse peuvent inhiber l’ovulation par exemple [8]. Les principales hormones sécrétées par les cellules adipeuses sont la leptine, l’adiponectine (protéine la plus produite), l’angiotensinogène, l’interleukine-6 (IL-6) et l’inhibiteur de l’activation du plasminogène (PAI-1). Les adipokines qui sont des protéines bioactives sécrétées par le tissu adipeux, régulent la sensibilité à l’insuline (Tableau 1) [9].

*Cette liste n’est pas exhaustive.

Tableau inspiré de [10, 11]

En plus de sa fonction endocrine, le tissu adipeux joue un rôle important dans le stockage d’énergie et dans l’isolation thermique et traumatique [1, 8]. En effet, la voie de signalisation de l’insuline joue un rôle important dans le stockage de lipides et dans la régulation de l’homéostasie du glucose [12]. La capacité de stockage du tissu adipeux est pratiquement illimitée. Ce processus peut s’effectuer de deux façons : par l’augmentation de la quantité de lipides emmagasinés dans chaque cellule en favorisant la lipogenèse plutôt que la lipolyse et/ou soit par l’augmentation du nombre de cellules adipeuses par le processus de réplication et de différentiation des pré-adipocytes [8]. De son côté, l’homéostasie du glucose est régulée par la balance entre la synthèse et la dégradation des lipides et l’expression des GLUT4 [12].

Les artères ont comme rôle principal de transporter le sang provenant du cœur vers le réseau de capillaires qui eux, ont un contact étroit avec les cellules et le liquide interstitiel permettant les échanges [1]. La paroi des artères se compose de trois couches ou tuniques entourant un espace central rempli de sang, la lumière. La tunique interne (ou intima) est composée d’un endothélium, d’une membrane basale et d’une limitante élastique interne (tissu élastique). L’endothélium, est cette monocouche de cellules endothéliales qui tapisse la paroi la plus interne des vaisseaux sanguins, elle sert d’interface entre le sang et les cellules musculaires lisses qui composent la média ou tunique moyenne de la paroi vasculaire. Traditionnellement, on croyait que le principal rôle de l’endothelium se limitait à celui d’une simple barrière sélective qui prévient la diffusion de macromolecules du sang vers le milieu interstitiel. Depuis, de nombreux autres rôles et fonctions de l’endothélium sont venus se greffer à celui de simple barrière sélective, et seront discutés à la section 3.1. La tunique moyenne de la paroi vasculaire se compose principalement de cellules musculaires lisses disposées en anneaux, de fibres élastiques et de feuillets d’élastine continus. Les cellules musculaires lisses de la tunique moyenne sont capables de se contracter de façon à générer un tonus vasculaire basal qui peut être modifié par des molécules vasoconstrictrices et vasorelaxantes [13]. La tunique externe (adventice ou externa) est constituée essentiellement de fibres de collagènes lâchement entrelacées et de fibres élastiques [1]. Les fibres de collagène ont pour fonction de protèger les vaisseaux et de les ancrer aux structures environnantes [1].

Il y a deux types d’artères : les artères de conductance (comme l’aorte) et les petites artères de résistance (comme l’artère mésentérique). Les premières ont comme principale fonction de transporter le sang vers les différents lits vasculaires, tandis que les artères de résistance contrôlent la résistance et le débit sanguin grâce à leur activité vasomotrice [13]. La plaque athérosclérotique est souvent retrouvée dans les artères de conductance, tandis que la résistance aux effets vasculaires de l’insuline s’observe plutôt au niveau des artères de résistance.

L’endothélium est constitué d’un épithélium simple (monocouche de cellules) squameux (cellules aplaties) qui forme une barrière mince et un revêtement lisse [1]. Ces caractéristiques sont retrouvées dans les organes ayant une fonction d’absorption, de sécrétion et de filtration, car elles permettent de réduire la friction entre les cellules de l’endothélium et le sang [1, 14]. L’endothélium ne représente pas seulement une couche de cellules inertes, mais bien l’organe endocrine principal multifonctionel du corps humain [15]. Une des premières fonctions de l’endothélium est de servir de barrière active semi-perméable contrôlant le transport des macromolécules, comme l’insuline, vers l’espace interstitiel (Tableau 2) [16]. D’ailleurs, l’endothélium est le premier organe rencontré par l’insuline en circulation, après sa sécrétion par les cellules bêta du pancréas [16]. L’endothélium a aussi pour rôle de contrôler la résistance vasculaire périphérique, le transport de substances transendothéliales, l’adhésion des cellules sanguines et la coagulation (Tableau 2) [15].

Tableau inspiré de [14-16]

Les cellules endothéliales constituant l’endothélium jouent un rôle central dans le maintien de l’homéostasie cardiovasculaire [17]. En fait à ce jour, la régulation du tonus vasculaire est l’une des fonctions les plus étudiées de l’endothélium. Ainsi, en 1980 Furchgott et Zawadzki démontraient pour la première fois dans des préparations d’artères isolées de lapin le rôle essentiel de l’endothélium à la réponse vasorelaxante de l’acétylcholine. Il fut démontré qu’en présence d’un endothélium intact, l’acétylcholine induisait une relaxation dose dépendante, alors qu’en absence d’un endothelium intact, il y avait perte de la vasorelaxation induite par l’acétylcholine. Il a été suggéré qu’une ou plusieurs substances non encore identifiées et libérées par l’endothélium agissaient comme médiateur de la réponse vasorelaxante de l’acétylcholine. Cette substance fut nommée «Endothelium-derived relaxing factor» ou EDRF. Quelques années plus tard, ce facteur a été identifié comme étant du monoxyde d’azote ou NO. Bien que les nitrates sont utilisés dans la pratique médicale, comme agent anti-anginaux pour leur propriété vasodilatatrice, depuis environ une centaine d’année, ce n’est en fait qu’assez récemment que le lien a été établi entre le NO et l’EDRF. La difficulté à caractériser le EDRF vient surtout du fait que le NO est une molécule très instable et possède par conséquent un temps de demi-vie très court, soit de quelques secondes. Par la suite, peu après la caractérisation de l’EDRF, d’autres études sont venues confirmer l’importance de cette découverte, et appuyer le rôle de l’endothélium dans la régulation du tonus vasculaire, et ce via non seulement la production et la libération du NO, mais aussi celles de plusieurs autres substances vasoactives (Tableau 3) vasodilatatrices, telles que la prostacycline (PGI2), la bradykinine et le facteur hyperpolarisant EDHF (substance hyperpolarisante non encore identifiée et libérée par l’endothélium), ou facteurs contractants, comme l’endothéline-1 (ET-1), la thromboxane A2 (TXA2 ), l’angiotensine-II, la prostaglandine F2α (PGF2α , le peroxyde d’hydrogène (H2 O2 ) et les radicaux libres [14, 17-19]. Un équilibre entre la production et libération de substances vasodilatatrices et facteurs vasoconstricteurs assure le maintien de l’homéostasie cardiovasculaire [17].

Grâce aux progrès réalisés en biologie vasculaire, de nombreuses autres fonctions importantes de l’endothélium sont venues s’ajouter à celle d’organe régulateur du tonus vasculaire. Ainsi, il a été démontré que dans des conditions physiologiques normales l’endothélium exerce un contrôle inhibiteur sur la contraction vasculaire, l’adhésion des leucocytes, l’adhésion et l’agrégation des plaquettes, l’hypertrophie vasculaire et la perméabilité vasculaire, pour ne nommer que ces seules fonctions [14, 17, 18]. L’endothélium est donc maintenant perçu comme un véritable organe endocrinien qui intervient directement dans la régulation de plusieurs processus biologiques, lesquels ont un impact certain sur la structure et l’activité vasculaire et donc sur la santé vasculaire.

Tableau inspiré de [14, 17-19]

Les produits de la digestion des hydrates de carbone ou glucides qui sont normalement absorbés au niveau de l’intestin sont le glucose, le fructose et le galactose. Le fructose, lequel est le principal sucre retrouvé dans les fruits, et le galactose sont hydrolysés en glucose par le foie avant de gagner la circulation sanguine. De son côté, le sucrose est un dissaccharide constitué d’une molécule de glucose et de fructose [1]. Pour traverser les membranes cellulaires et accéder à la circulation sanguine, le sucrose doit être dégradé par hydrolyse en ses sucres simples au cours de la digestion [1]. Le glucose est un monosaccharide composé de 6 atomes de carbone (hexose) et d’oxygène, ainsi que de 12 atomes d’hydrogène (C6 H12 O6 ). Cette molécule constitue de loin le principal glucide sanguin, soit celui qui ultimement est délivré et utilisé par les cellules. La glycémie est la mesure de la concentration de glucose dans le sang et elle est généralement exprimée en mmol/l. Le glucose est aussi une source majeure d’énergie utilisée sous la forme d’adénosine 5’-triphosphate (ATP) dans les cellules de mammifères [1]. En effet, le glucose est la principale molécule combustible des voies oxydatives pour la production d’ATP. Le catabolisme complet du glucose débute par sa transformation en glucose-6-phosphate qui permet son entrée dans la glycolyse (Figure 1), puis suite à plusieurs transformations, les différentes molécules passent dans le cycle de Krebs (Figure 2), la chaîne de transport des électrons (Figure 3) et la phosphorylation oxydative (Figure 4) [1]. Pour chaque molécule de glucose qui entre dans ces voies, un maximum de 36 molécules d’ATP sont formées (Figure 5) [1]. Lorsque la concentration sanguine de glucose excède la quantité nécessaire à la synthèse d’ATP, le glucose est converti en glycogène dans les muscles squelettiques, le cœur et le foie ou bien en graisses dans les adipocytes [1].

Le glucose est une molécule polaire hydrophile qui ne peut pénétrer librement à travers la double couche lipidique de la membrane cellulaire. Par conséquent, l’organisme s’est doté d’un système de transport membranaire, lequel assure l’entrée du glucose à l’intérieur des cellules. Il existe deux grandes familles de transporteurs de glucose. La première, les transporteurs de glucose sodium dépendants (ou cotransporteur Na+ /Glucose) sont couplés à la pompe Na+ /K+ -ATPase et médient le transport actif du glucose contre son gradient de concentration [20]. On retrouve ce type de transporteur uniquement au niveau de certaines cellules épithéliales, dont celles de la bordure en brosse du petit intestin, où il joue un rôle important dans l’absorption du glucose du lumen intestinal vers la circulation sanguine, et au niveau des cellules épithéliales des reins, où il assure la réabsorption tubulo-proximale du glucose [20]. La deuxième famille de transporteur du glucose est indépendante du Na+ et, contrairement au système précédent, ce deuxième type de transporteurs est largement exprimé dans presque toutes les cellules, et le transport du glucose à travers la membrane cellulaire s’effectue dans la direction de son gradient de concentration et n’utilise donc pas d’énergie pour ce faire. Ce processus est appelé diffusion facilitée [20]. Les transporteurs de glucose indépendants du sodium (ou GLUT pour «GLUcose Transporter») sont de nature protéique et contiennent de 492 à 524 acides aminés. Ces protéines se composent de 13 segments hydrophiles situés de part et d’autre de la membrane et de 12 segments hydrophobes transmembranaires. Ces derniers forment un pore à travers la membrane cellulaire, permettant le transport du glucose dans le sens de son gradient de concentration et ce, dans une variété de tissus [4, 20, 21]. Il existe différentes isoformes qui se distinguent par leur expression dans différents tissus, par la spécificité de leur substrat et par leurs caractéristiques cinétiques. Pour les fins de ce mémoire, je m’attarderai seulement aux GLUT1 et 4, étant donné que les autres GLUT sont de moindre importance pour mon projet. GLUT1 est l’isoforme qui est la plus omniprésente et elle facilite le transport basal du glucose [4, 21]. Pour ce qui est de GLUT4, il est retrouvé exclusivement dans les tissus insulino-sensibles, dont les muscles squelettiques et cardiaques et le tissu adipeux [4, 21]. Il est le transporteur responsable de l’utilisation du glucose stimulée par l’insuline dans ces tissus [4, 20]. Le GLUT4 est aussi le transporteur le plus important pour l’homéostasie du glucose dans tout le corps [21]. Les GLUT1 et GLUT4 sont les principaux transporteurs retrouvés dans le muscle squelettique.

L’homéostasie du glucose est surtout maintenue par le foie qui lui est capable de changer rapidement son activité de captation du glucose suite à un repas, à celle de production de glucose en état de jeûne. Le muscle squelettique est aussi un important régulateur de l’homéostasie du glucose. De faibles changements dans la concentration plasmatique d’insuline, de glucagon et de glucose indiquent au foie s’il doit favoriser la glycogénèse ou plutôt la gluconéogénèse. D’ailleurs, les niveaux de glucose sanguin sont régulés par trois processus étroitement liés qui sont la production hépatique de glucose (gluconéogénèse), son utilisation par les tissus périphériques et la sécrétion d’insuline par le pancréas [4]. Le muscle squelettique est le principal consommateur de glucose et son transport dans ce tissu est la première étape limitante de son utilisation dans des conditions physiologiques [4]. Le glucose peut s’autoréguler, c’est-à-dire qu’il est capable d’altérer sa propre production et son transport hépatique [22]. La relâche de glucose hépatique est déterminée par le ratio gluconéogenèse/glycogénolyse [22]. La suppression de la gluconéogenèse survient principalement dans des conditions de jeûne prolongé, c’est-à-dire lorsque les réserves hépatiques du glycogène sont faibles ou complètement vides [22]. En condition normale, les réserves de glycogène hépatiques sont suffisantes et l’autorégulation par la suppression de la glycogénolyse est alors privilégiée.

En condition de jeûne, le foie relâche le glucose dans le sang à un taux égal à son utilisation par les tissus périphériques [4]. Environ 65-75% du glucose hépatique basal relâché provient de la glycogénolyse (formation de glucose à partir du glycogène) tandis que les 25-35% restant proviennent de la gluconéogénèse (formation de glucose à partir des acides aminés) qui suit l’état post-absorptif [4]. Si le jeûne est prolongé, la production de glucose hépatique provenant de la gluconéogenèse est augmentée [4]. Par contre, suite à un repas, les concentrations de glucose sanguin augmentent et l’insuline est sécrétée, ce qui mène à l’augmentation de l’utilisation du glucose par les tissus périphériques et à une suppression de la relâche hépatique de glucose [4]. La majorité du glucose (75%) est métabolisée par les muscles squelettiques, tandis que le tissu adipeux en métabolise un pourcentage considérablement plus faible [4].

Les principaux stimulateurs du transport du glucose dans les muscles squelettiques sont l’insuline, le facteur de croissance de l’insuline, les agents mimétiques de l’insuline, la contraction musculaire, l’hypoxie ou le stress cellulaire [4]. En absence de stimuli, des études de microscopie électronique ont révélé que la majorité des transporteurs GLUT4, lequel constitue l’isoforme prédominant dans le muscle squelettique, se retrouve au niveau des structures tubulo-vésiculaires, comme les triades et des endosomes, alors que GLUT4 est pratiquement absent au niveau des membranes plasmiques du muscle squelettique. Cependant, lors d’une stimulation par l’insuline, le nombre de transporteurs de glucose augmente de manière importante via un processus de translocation des protéines de transport GLUT4 contenues dans les vésicules intracellulaires vers la surface membranaire [4] ainsi que vers les tubules transversaux T. L’insuline a donc pour effet de faciliter l’entrée du glucose dans la cellule, en augmentant le nombre de transporteurs de glucose disponible à la surface membranaire et, possiblement aussi, en augmentant l’activité intrinsèque de ces transporteurs [4]. De plus, Roy et ses collaborateurs ont démontré que la contraction musculaire stimule significativement le transport du glucose par l’augmentation de la translocation des GLUT4 à la membrane plasmique et plus particulièrement, dans les tubules transverses T des muscles squelettiques de rat [23]. Cependant, ces mêmes auteurs ont rapporté que la contraction musculaire induisait la translocation de GLUT4 contenues dans des vésicules de réserve intracellulaires différentes de celles stimulées par l’insuline [23].

L’insuline est une hormone produite par les cellules β des ilots de Langerhans du pancréas. Elle est tout d’abord synthétisée à l’intérieur d’une chaîne polypeptidique appelée pro-insuline (Figure 6A), laquelle est transportée à l’intérieur de microvésicules jusqu’à l’appareil de Golgi, où les granules de sécrétion sont formées. Le clivage de la pro-insuline en insuline se fait par des enzymes spécifiques contenues à l’intérieur de ces granules, et ceci s’effectue juste avant l’excrétion d’insuline par les cellules ß. Les granules sont excrétées par exocytose[1]. L’insuline est un petit polypeptide de 51 acides aminés d’environ 6 kDa composé de deux chaînes reliées entre elles par deux ponts disulfures (Figure 6B) [1, 25]. La rupture d’un de ces ponts entraîne la perte d’activité de l’hormone. En circulation, l’insuline est sous la forme d’un monomère [25]. À des concentrations micromolaires, l’insuline se dimérise et en présence de zinc, elle s’associe en hexamère (Figure 6C) [25].

La sécrétion d’insuline est contrôlée par différents substrats comme le glucose, les acides aminés et les acides gras (AG). C’est l’augmentation des niveaux plasmatiques de ces substrats qui stimule la libération d’insuline. Certaines hormones peuvent aussi agir sur la libération d’insuline. Ainsi, le glucagon, l’adrénaline, l’hormone de croissance et les glucocorticoïdes, lesquels à l’opposé de l’insuline ont des actions hyperglycémiantes, réduisent la libération d’insuline. Bien qu’à l’origine on croyait que le rôle de l’insuline se limitait a celui de contrôler le métabolisme du glucose en contrôlant son entrée dans la cellule, il est vite apparu que l’insuline possédait un spectre d’action beaucoup plus vaste. En effet, l’insuline constitue à la fois une hormone anabolique, en stimulant les systèmes de transport et les enzymes impliquées dans l’utilisation et l’entreposage du glucose, des acides aminés et des AG, et une hormone anti-catabolique via les actions inhibitrices qu’elle exerce sur la gluconéogénèse, la glycogénolyse, la lipolyse et le catabolisme des protéines (Figure 7) [26]. Ses actions sont principalement exercées au niveau des muscles squelettiques, du tissu adipeux et du foie. L’insuline exerce des fonctions pléïotropes (ie pouvant agir sur plusieurs cibles et produisant des effets indépendants les uns des autres) sur la croissance cellulaire, le développement et le contrôle de l’apoptose et sur le métabolisme des protéines en augmentant leur synthèse et en inhibant la protéolyse (Figure 7) [26]. De plus, chez l’humain, l’insuline exerce une augmentation de l’activité du système nerveux sympathique causant une augmentation de la relâche de catécholamine et de norépinéphrine. L’augmentation de l’action vasoconstrictrice du système sympathique et la réduction de la résistance vasculaire dans les muscles squelettiques expliqueraient le fait qu’il n’y a pas de changement dans la pression artérielle moyenne chez ces individus [27].

En plus de ses actions glucorégulatrices, il est maintenant bien accepté que l’insuline exerce également des actions vasculaires, lesquelles seraient étroitement liées à son action hypoglycémiante, et possiblement pourraient aussi jouer un rôle déterminant dans le développement et l’établissement de certaines conditions physiopathologiques, telles que l’hypertension, la résistance à l’insuline, l’intolérance au glucose, l’obésité, le diabète de type 2 et l’athérosclérose. En condition normale, l’insuline a des effets hémodynamiques importants qui influencent son action glucorégulatrice. En effet, il est bien admis que l’insuline entraîne une augmentation du débit sanguin total vers les muscles squelettiques en situation physiologique [27]. Par exemple, il a été démontré dans le laboratoire du Dre Hélène Bachelard qu’une infusion d’insuline durant un clamp euglycémique provoque des effets hémodynamiques chez les rats normaux Sprague-Dawley et Wistar se traduisant par une vasodilatation de l’artère rénale et des lits vasculaires des muscles squelettiques, ainsi que par une augmentation du transport du glucose dans les muslcles squelettiques EDL et soleus [28]. Dans le même ordre d’idée, il a été démontré chez le rat insulino-sensible que le recrutement des capillaires et l’augmentation du débit sanguin [29] constituent un phénomène important et qui est étroitement lié à l’action glucorégulatrice de l’insuline. Qui plus est, il a été démontré, lors d’un clamp euglycémique hyperinsulinémique, que les actions hémodynamiques de l’hormone (vasodilation, augmentation de la densité de capillaires fonctionnels) étaient fortement altérées, tout comme son action facilitatrice sur l’entrée du glucose dans la cellule, chez le rat Zucker obèse et insulino-résistant [30]. En fait, l’état de résistance à l’insuline est caractérisé par une réponse à l’insuline diminuée dans les cellules insulino-sensibles. De plus, il a été démontré dans le laboratoire du Dre Hélène Bachelard que chez le rat Sprague-Dawley nourris avec un régime riche en sucrose, il y avait une altération des réponses vasculaires de l’insuline, dont une réduction de la vasodilatation dans les lits vasculaires des muscles squellettiques [31], accompagnée d’une réduction de la sensibilité à l’insuline, telle que déterminée pendant un clamp euglycémique hyperinsulinémique [31]. Dans un autre modèle animal de résistance à l’insuline, soit le rat spontanément hypertendu (SHR), il a été démontré que les actions hémodynamiques et glucorégulatrices de l’insuline étaient également altérées [32]. Chez l’humain résistant à l’insuline, des résultats similaires ont aussi été rapportés à l’effet que l’insuline n’a plus la capacité d’augmenter le débit sanguin total [27].

À ce jour, plusieurs explications ont été proposées afin d’expliquer les changements dans les actions hémodynamiques de l’insuline en présence d’insulino-résistance. Ces explications sont majoritairement en lien avec la molécule vasorelaxante : le NO. Tout d’abord, une diminution de la production de NO et de la réponse des muscles lisses vasculaires au NO semblent expliquer les réductions du débit sanguin et du recrutement des capillaires observées chez le rat Zucker [30]. À ce sujet, plusieurs études, dont les notres, ont suggéré que la diminution de la synthèse de NO peut être causée par une réduction de l’expression et/ou de l’activité de l’enzyme eNOS dans un modèle animal de résistance à l’insuline [31, 33]. Des études chez la souris, dont le gène codant pour la protéine eNOS est inactif, ont été effectuées afin de valider cette affirmation. Par exemple, les équipes respectives des Drs Duplain et Shankar ont démontré dans un modèle animal de résistance à l’insuline (la souris dont le gène codant pour la eNOS est inactif) que le taux d’infusion du glucose durant un clamp euglycémique hyperinsulinémique était significativement inférieur par rapport au taux d’infusion des souris contrôles [34, 35]. De plus, dans ce même modèle animal, l’équipe de Duplain a observé une diminution du débit sanguin vers les membres postérieurs et une réduction du transport du glucose (basal et stimulé par l’insuline) par rapport aux souris contrôles [34]. Selon eux, le NO a des effets sur le transport du glucose qui sont indépendants de ses actions vasculaires [34]. L’influence du NO dans les pathologies de résistance à l’insuline et de dysfonction endothéliale sera discutée plus loin dans la section 9.

L’insuline favorise un grand nombre de réponses métaboliques et mitogéniques passant par un réseau de voies métaboliques hautement coordonnées. L’insuline se lie à un récepteur spécifique de type tyrosine kinase situé à la surface de toutes les cellules et composé de deux sous-unités alpha (~135 kDa) et de deux sous-unités beta (~95 kDa), le tout lié par des ponts disulfures et formant un hétérodimère (Figure 8) [4, 12, 26]. Le récepteur à l’insuline est surtout exprimé dans les cellules du tissu adipeux, des muscles squelettiques et dans le foie [26]. Il est aussi largement exprimé dans d’autres tissus du corps dont le pancréas, le système nerveux central, le rein et les cellules lymphatiques [12]. Dans les cellules vasculaires, l’action de l’insuline est initiée par sa liaison avec la sous-unité alpha extracellulaire de son récepteur [12]. Cette liaison permet un rapprochement des deux sous-unités bêta transmembranaires permettant l’activation du récepteur par son autophosphorylation sur les résidus tyrosines par l’ATP, ce qui à son tour déclanche une suite de phosphorylations de plusieurs substrats intracellulaires et enzymes cytosoliques, comme les substrats du récepteur de l’insuline (IRS-I à IRS-2), Shc, phosphatidilinositol-3 (PI 3) kinase et GRB-2 (growth factor receptor-bound protein 2) [12, 26, 36].

À partir de ce point, il y a deux principales voies de signalisation de l’insuline : la voie de la PI3-kinase et celle de la MAP kinase (Figure 9A et 9B). Tout d’abord, l’enzyme phosphatidilinositol-3 (PI-3) kinase est reconnue comme étant une étape importante dans la voie de signalisation de l’insuline impliquée dans le transport du glucose [4, 38]. Lorsque le récepteur de l’insuline a activé les IRS par une réaction de phosphorylation des résidus tyrosines, les IRS vont à leur tour phosphoryler les résidus tyrosine des domaines SH2 de la PI3 kinase (protéines relais dont les principales sont la PI3 kinase et Grb2) [26]. Une fois phosphorylée, la PI3 kinase catalyse la phosphorylation de lipides membranaires formant ainsi des PI(3,4,5)P3, qui eux permettront l’attachement de la protéine AKT à la membrane plasmique. Ainsi positionnée, la protéine AKT peut être phosphorylée par les PDK1/2, lesquelles entraînent la phosphorylation d’autres protéines relais intracellulaires impliquées dans les effets métaboliques de l’insuline. Par exemple, la phophorylation de la GSK3-beta (favorise la synthèse de glycogène) et la phosphorylation de la PKC atypique impliquée dans la translocation des transporteurs de glucose à partir d’un pool intracellulaire vers la surface membranaire (Figure 9A) [26]. Des études ont démontré l’implication directe de Akt/PKB dans le transport du glucose et la translocation des GLUT1 et GLUT4 à la membrane plasmique [4]. De son côté, la voie de la MAP kinase (Figure 9B) peut être activée par deux voies, soit par la protéine IRS ou par la SHC (à gauche sur la figure 9). Premièrement, les IRS peuvent lier Grb2 permettant d’activer le facteur d’échange nucléotidique SOS qui lui phosphoryle et active la MAP kinase, qui elle va activer la kinase p90rsk impliquée dans la synthèse protéique [26]. Deuxièmement, SHC peut être activé par le récepteur de l’insuline et reconnaître la protéine Grb2 qui active la voie de Ras [26].

Le NO a été découvert vers 1980 par les chercheurs américains Furchgott et Zawadzki [39]. La découverte du NO et de ses rôles en tant que médiateur chimique impliqué dans des processus biochimiques majeurs a abouti, en 1998, au prix Nobel de Médecine pour Furchgott, Ignarro et Murad. En 1992, le journal Science proclame le NO, molécule de l’année. Le NO est un gaz inorganique possédant un électron libre, ce qui lui confère une grande instabilité chimique, caractéristique commune à tous les radicaux libres [40]. C’est une molécule de faible poids moléculaire et très lipophile, ce qui lui permet de diffuser rapidement à travers les parois cellulaires. La demi-vie du NO est de quelques secondes, il est rapidement converti en nitrite et nitrate, lesquels sont des produits stables du métabolisme du NO [41].

Le NO est produit, entre autres, par les cellules endothéliales, les cardiomyocytes, les cellules musculaires, les macrophages, les plaquettes, le foie, le cerveau et le système nerveux périphérique [42]. Le NO est synthétisé à partir de l’acide aminé précurseur L-arginine dans une réaction d’oxydation, laquelle s’effectue en cinq étapes et est catalysée par l’enzyme NO synthase (NOS). Cette réaction complexe exige la présence des co-substrats O2 et NAD(P)H (nicotinamide adénine dinucléotide phosphate réduit) , de même que de nombreux cofacteurs, tels que la FAD (flavine adénine dinucléotide), la FMN (flavine mononucléotide) et la BH4 (tetrahydrobiopterine) (haut de la Figure 10) [4, 17, 43]. Une fois synthétisé, le NO diffuse alors librement à travers les membranes cellulaires. Au niveau des cellules musculaires lisses, le NO se lie à la guanylate cyclase soluble intracytoplasmique qui produit alors de grandes quantités de GMPc (guanosine 5’-monophosphate cyclique), ce qui a pour effet d’induire une vasorelaxation (bas de la Figure 10) [17, 40].

La production continue de NO par l’isoforme endothéliale NOS (eNOS) aide à maintenir un tonus vasculaire physiologique [44, 45]. Cependant, des agonistes comme l’acetylcholine et l’insuline peuvent augmenter la production endothéliale de NO et sont ainsi capables de moduler le tonus vasculaire (côté droit de la Figure 11) [16, 40, 46, 47]. D’autre part, certains agents pharmacologiques sont des donneurs de NO et peuvent ainsi stimuler directement la guanylate cyclase soluble, sans qu’il y ait activation de l’enzyme NOS, et ainsi produire de grandes quantités de GMPc et induire une vasorelaxation indépendante de l’endothéliun (côté gauche de la Figure 11).

En plus de son rôle clé dans la régulation du tonus vasculaire et dans virtuellement tous les processus de relaxation vasculaire du type endothélium-dependant, les études ont très vite démontré que son implication s’étendait à de nombreuses autres fonctions. Notamment, il a été démontré que le NO exerce un contrôle inhibiteur sur la production et libération de plusieurs facteurs endothéliaux vasoconstricteurs, dont l’ET-1. Le NO interfère aussi avec plusieurs évènements clés dans le développement de l’athérosclérose, dont l’adhésion et l’agrégation des plaquettes, l’adhésion des leucocytes et des monocytes à la surface des cellules endothéliales des parois vasculaires et dans l’expression des molécules pro-inflammatoires, telles que «vascular cell adhesion molecule-1» (VCAM-1) et «chemoattractant protéine-1» (MCP-1). Le NO diminue aussi la perméabilité endothéliale et exerce également des effets anti-mitogéniques sur les cellules musculaires lisses vasculaires, en inhibant la croissance et prolifération de ces cellules. De plus, le NO apparait comme un inhibiteur endogène du TNF-α («tumor necrosis factor») et inhibe l’oxydation des LDL [17, 43, 44].

La formation de NO diffère selon l’isoforme NOS activé et provoque des effets différents selon le tissu impliqué. Par exemple, lorsque le NO est produit en grande quantité par l’isoforme iNOS, le NO agit plutôt comme agent cytotoxique et antimicrobien par le biais des macrophages dans le système immunitaire, alors que s’il est produit en quantité plus modérée par l’isoforme nNOS, le NO est plutôt impliqué, entre autres, dans la neurotransmission, la plasticité neuronale, l’alimentation et l’hyperalgie La biodisponibilité du NO est dépendante de son taux de production et d’inactivation qui survient généralement par sa liaison avec des espèces réactives de l’oxygène (ROS) comme l’O2 - [17].

La structure plane de l’enzyme NOS est représentée à la Figure 12. L’enzyme est constituée de deux monomères identiques, lesquels fonctionnellement peuvent être divisés en deux domaines majeurs, le domaine oxydase en N-terminal et le domaine réductase en C-terminal. Le premier domaine comprend les sites de liaison pour le substrat L-arginine, le cofacteur BH4 et le résidu hème, tandis que le second domaine contient les sites de liaison pour les cofacteurs NAD(P)H, FAD et FMN (Figure 12) [43]. Le domaine de liaison de la calmoduline se situe entre ces deux régions et il joue un rôle structural et fonctionnel pour l’enzyme (Figure 12) [43]. Une réaction complexe impliquant un transfert d’électrons du NAD(P)H vers le domaine en N-terminal de l’hème-oxygénase en passant par les flavine FAD et FMN et le domaine en C-terminal de la réductase se produit [43]. La réaction catalytique des NOS consomme 1.5 mole de NAD(P)H et 2 moles d’oxygène par mole de L-citrulline formée [43]. Les enzymes eNOS et nNOS présentes constitutivement dans les cellules sont généralement retrouvées sous la forme de monomère inactif et c’est la dimérisation et l’association avec la calmoduline, la L-arginine et la BH4 qui permet d’activer l’oxygène et d’oxyder la L-arginine pour la libération du NO et de la L-citrulline [40]. L’hème est un cofacteur essentiel pour la dimérisation des 3 isoformes des protéines NOS, tandis que le BH4 n’est pas nécessaire à la dimérisation des enzymes nNOS et eNOS, mais il aide à la stabilisation du dimère [43].

Il existe trois isoformes de NOS incluant la forme neuronale (nNOS), inductible (iNOS) et endothéliale (eNOS). Ces trois isoformes catalysent une réaction d’oxydation menant à la production de L-citrulline et de NO (Figure 10). Ces isoformes ont environ 60% d’homologie en acides aminés et leurs structures primaires sont similaires [48]. Cependant, elles diffèrent les unes des autres par leur dépendance au Ca2+ , leur expression et leur activité [43]. Les rôles physiologiques et pathophysiologiques de chaque isoforme sont aussi distincts. Par contre, ces trois isoformes sont caractérisées par des régions de haute homologie (domaine réductase en carboxy-terminal et un domaine oxygénase en amino-terminal), des structures protéiques semblables, des mécanismes enzymatiques comparables et des sites de fixation aux mêmes cofacteurs (flavines, NAD(P)H, protoporphyrine IX de fer, BH4 et la calmoduline) et au substrat (L-arginine) (Figure 12) [17, 40, 43].

Les protéines NOS peuvent aussi catalyser la production d’O2 - selon la disponibilité des substrats et des cofacteurs [43]. En effet, avant l’assemblage du dimère, les protéines NOS, le NAD(P)H, le FMN, le FAD et la calmoduline sont liés au monomère (Figure 13A) [43]. Ensuite, l’hème se lie au monomère permettant sa liaison avec un autre monomère (Figure 13B). À cette étape, s’il n’y a pas de BH4 ou très peu, le dimère formera de l’O2 - et un peu de NO (Figure 13B et 10C) [43]. Cependant, si le dimère est saturé en BH4 , il y aura seulement production de NO (Figure 13D) [43].

Chez l’humain, le gène codant pour la transcription et la synthèse de la protéine eNOS est situé sur le chromosome 7 et il code pour 1203 acides aminés [40, 49]. La protéine eNOS (2 x 134 kDa) a été, à l’origine, isolée à partir de l’endothélium vasculaire, mais elle est aussi présente dans les cardiomyocytes, les plaquettes, les cellules mésangiales rénales, les cellules osseuses et les neurones de l’hippocampe [40, 45, 48]. L’enzyme eNOS est exprimée de façon constitutive dans les cellules endothéliales et les plaquettes [43] et elle produit des quantités de NO de l’ordre du picomole [45]. Elle est la principale source de NO dans les cellules endothéliales [43].

Le contrôle du tonus vasculaire est un processus hautement sensible, de petits changements dans l’expression et/ou l’activité de la protéine eNOS sont susceptibles d’avoir un impact important sur la fonction vasculaire et plus particulièrement dans l’évolution de certaines conditions pathologiques [Andrew et al. 1999]. L’activité de l’enzyme eNOS peut être régulée par différents facteurs dont, principalement, par des changements dans la concentration intracellulaire de Ca2+ , ce qui affecte sa liaison avec la calmoduline [44, 45]. En effet, il a été démontré que certains agonistes, comme l’acétylcholine et la bradykinine, pouvaient stimuler eNOS en augmentant les concentrations de calcium cytosolique [17]. La liaison de ces substances vasodilatatrices à leur récepteur, lequel est couplé aux protéines G, a pour effet d’induire une augmentation de la production du phosphatidilinositol-3-phosphate (IP-3), ce qui en retour entraîne une augmentation de la libération du Ca2+ par le réticulum endoplasmique, de même qu’une augmentation de la liaison de ce dernier à la calmoduline (côté gauche de la Figure 14) [16, 43, 50]. Le complexe ainsi formé peut se fixer à la protéine eNOS et ainsi augmenter son activité [16, 17]. D’autre part, la protéine eNOS peut aussi être activée par une autre voie, c’est-à-dire de façon indépendante au Ca2+ (côté droit de la Figure 14) [16, 17, 43]. Ainsi par exemple, tel que représenté à la figure 14 la liaison de l’insuline à son récepteur entraîne l’activation de eNOS, via l’activation de la voie de signalisation impliquant la PI-3 kinase et AKT [16]. C’est cette voie métabolique qui est régulée à la baisse dans la résistance à l’insuline [17]. Une étape importante de cette activation est la phosphorylation par AKT du résidu sérine en position 1179 de la protéine eNOS. Cette étape permet la dissociation de eNOS de la membrane plasmique, ce qui rend ainsi possible son activation. La phosphorylation par AKT est spécifique à eNOS et ne seproduit pas sur les isoforme nNOS et iNOS [51]. L’activation de eNOS peut également se faire par des stimuli physiques, tels que l’augmentation des forces de cisaillement, de l’étirement des parois artérielles et par la diminution de la PO2 [52]. D’ailleurs, de récent résultats démontrent que les forces de cisaillement peuvent activer la protéine AMP kinase (AMPK) qui elle stimule la phosphorylation de la protéine eNOS dans les cellules endothéliales, entraînant ainsi son activation et la production de NO [53]. L’équipe de Cohen a démontré qu’en présence de ONOO- , le BH4 est réduit et l’enzyme eNOS devient alors découplée [54]. Ce sujet sera abordé dans la section 9.2.2.3.

Généralement, l’enzyme eNOS est exprimée de façon constitutive mais plusieurs facteurs peuvent aussi stimuler son expression. Tout d’abord, la région du promoteur du gène de la protéine eNOS contient des éléments qui répondent aux oestrogènes [43], aux forces de cisaillement, aux stérols, aux protéines activatrices 1 et 2, au facteur nucléaire-1 et à l’adénosine 5’-monophosphate cyclique (AMPc) [17, 48]. L’expression de la protéine eNOS est aussi régulée à la hausse par l’entraînement physique [43], la lysophosphatidylcholine, le facteur de croissance des cellules endothéliales vasculaires (VEGF), l’insuline et par une faible concentration de LDL oxydées [17]. Inversement, l’expression de l’enzyme eNOS est réduite par l’hypoxie [43], le facteur alpha nécrosant des tumeurs (TNF-alpha) et une forte concentration de LDL oxydées [17].

L’enzyme eNOS est aussi sensible aux modifications post-translationelles qui médient sa localisation subcellulaire [43]. En effet, contrairement aux autres isoformes, l’enzyme eNOS subit deux modifications post-transductionelles, soit la myristylation et la palmitylation qui rendent possible sa liaison avec la protéine cavéoline associée à la membrane et son inactivation [44]. De plus, l’enzyme eNOS a la propriété de répondre non seulement à une variété d’agents neurohormonaux, mais aussi à des forces hémodynamiques [43]. Normalement, la protéine eNOS est fixée à la membrane des cellules endothéliales et est associée aux cavéolines [40]. Cette structure membranaire complexe est sensible à la pression des fluides qui s’exerce sur la membrane [40]. La pression sanguine constitue le principal mécanisme de régulation de l’activité de l’enzyme eNOS dans l’endothélium des mammifères [40].

Chez l’humain, le gène codant pour l’enzyme nNOS (2 x 161 kDa) est situé sur le chromosome 12 [40, 49] et la protéine nNOS a été la première isoforme à avoir été purifié et clonée. La protéine nNOS a été découverte dans les neurones et elle est retrouvée dans le système nerveux central et le système nerveux périphérique [45]. Cette protéine serait entre autres impliquée dans les processus de neurotransmission et d’apprentissage, l’érection et l’ischémie [48]. Elle est aussi largement distribuée dans des tissus autres que le système nerveux, comme le muscle squelettique par exemple [40]. Il a été rapporté que la production de NO, par les nerfs périvasculaires des artères cérébrales, pouvait directement moduler le tonus vasculaire [48]. L’enzyme nNOS est généralement exprimée constitutivement et de façon dépendante du Ca2+ (comme pour la protéine eNOS, côté gauche de la Figure 14) [43]. En effet, l’enzyme nNOS est aussi activée suite à une élévation de la concentration intracellulaire de Ca2+ qui est suivie par la liaison du Ca2+ à la calmoduline, tel que décrit précédemment avec l’enzyme eNOS (côté gauche de la Figure 14) [43]. Par contre, la régulation de l’activité de la protéine nNOS est unique car elle est l’isoforme le plus grosse, dû à ses 300 acides aminés supplémentaires en N-terminal [43]. Cette région contient le domaine PDZ (constitué de 90 acides aminés organisés en 2 hélices alpha et 4 feuillets bêta), lequel est responsable de la modulation de l’association de la protéine nNOS avec d’autres protéines contenant ce motif, comme la dystrophine (qui aide au maintien de l’intégrité du sarcolème dans la membrane du sarcolème) et la protéine post-synaptique PSD-95 [43]. L’enzyme nNOS diffère des autres isoformes par son empressement à catalyser l’oxydation du NAD(P)H, causant ainsi le découplage de l’enzyme [43]. Bien que cette réaction pourrait expliquer le rôle dommageable de la protéine nNOS dans l’ischémie du cerveau, son importance dans l’expression de la protéine nNOS dans les cellules autres que celles du cerveau n’est pas claire [43].

Chez l’humain, le gène codant pour la protéine iNOS (2 x 131 kDa) est situé sur le chromosome 17 [49] et cette protéine est surtout exprimée dans des cellules impliquées dans les processus inflammatoires et de défense contre les infections [40]. D’ailleurs, elle a été purifiée et clonée à partir de macrophages de souris activés par des extraits bactériens [40]. La protéine iNOS est exprimée seulement en grande quantité dans les macrophages, les leucocytes et les fibroblastes suite à une induction par des cytokines ou d’autres agents inflammatoires dans le but premier d’éliminer un agent délétère [43, 45, 48]. De plus, elle peut aussi être induite par des AGL à longues chaînes ou par de fortes concentration de glucose dans divers systèmes (cardiovasculaire, neuromusculaire, nerveux, génito-urinaire, gastrointestinal et rénaux) entraînant ainsi une forte augmentation de NO [55]. De ce fait, en condition physiologique normale, il est pratiquement improbable que l’enzyme iNOS ait un impact sur le système cardiovasculaire, car son expression est faible ou absente dans ces tissus [43]. En effet, la protéine iNOS n’est généralement pas présente dans les tissus sains [40]. Cependant, en condition pathologique, l’expression de l’enzyme iNOS peut être induite par des médiateurs de l’inflammation dans plusieurs types de cellules vasculaires telles que les cellules endothéliales, les myocytes cardiaques, les cellules musculaires lisses et les macrophages, ce qui résulte en une grande production de NO (plus de 1000 fois plus que par les enzymes eNOS et nNOS) pouvant causer des dommages cellulaires [43, 45]. Ces effets in vivo résultent de ses caractéristiques uniques, soit d’être inductible, c’est-à-dire indépendant du Ca2+ , car la protéine iNOS a une liaison irréversible avec la calmoduline [43]. Par contre, il a été rapporté que son activité peut être deux fois plus forte en présence de Ca2+ [43]. D’un autre côté, il a aussi été démontré qu’une mutation de la lysine à la position 525 de la protéine iNOS affecte son activité indépendante du Ca2+ [56]. Pour l’enzyme iNOS, sa dimérisation est facilité par sa liaison avec la L-arginine [43]. En outre, l’expression de l’enzyme iNOS peut être responsable de la diminution de la production de NO par la protéine eNOS dans des vaisseaux traités avec des médiateurs de l’inflammation [43]. Cependant, l’expression de l’enzyme iNOS peut avoir des effets protecteurs, comme dans la suppression d’allogreffe artérioscléreuse en prévenant l’hyperplasie de l’intima [43].

L'ET-1 est un peptide synthétisé et sécrété par les cellules endothéliales vasculaires. Il exerce une influence autocrine en se fixant à son récepteur ETB situé à la surface des cellules endothéliales vasculaires, ce qui, lorsque stimulé, induit une vasodilatation. Il exerce aussi une influence paracrine en agissant au niveau des cellules musculaires lisses vasculaires en se fixant à ses récepteurs ETA et ETB , ce qui a pour effet de provoquer une vasoconstriction et des effets mitogéniques [57-59] . ET-1 a été identifié comme étant un des plus puissants peptides vasoconstricteurs connu à ce jour [60]. Le NO et l’ET-1 sont des antagonistes mutuels. Ils agissent l’un sur l’autre afin de maintenir un équilibre dans le tonus vasculaire. Dans une situation de dysfonction endothéliale, où la biodisponibilité du NO diminue, l’effet vasoconstricteur de l’ET-1 prend le dessus et peut causer des dommages vasculaires importants en plus de promouvoir l’athérogénèse.

Des études ont indiqué qu’il existait une association étroite entre la résistance à l’insuline, la production d’ET-1 et l’expression de ses récepteurs. Ainsi , dans des préparations de cellules endothéliales en culture [61-63] et musculaires lisses [64] il a été démontré que l’insuline, à des concentrations physiologiques, stimulait la production d’ET-1. En ce qui concerne le mécanisme de cet effet, certaines évidences impliquent directement la liaison de l’insuline à son récepteur situé au niveau des cellules endothéliales, étant donné que la production d’ET-1 semble aussi correspondre à une augmentation de l’activité tyrosine kinase du récepteur [61]. L'hyperinsulinémie, soit provoquée par une infusion d'insuline ou soit consécutive à la résistance à l'insuline, a été associée à une augmentation de la concentration plasmatique d’ET-1 dans plusieurs modèles animaux de résistance à l'insuline. Chez l’individu obèse et diabétique, des niveaux élevés d’ET-1 circulant ont aussi été rapportés [62, 65-67]. D’autres études effectuées in vitro ont rapporté qu’une exposition chronique à l’insuline causait une augmentation de l'expression des récepteurs ETA dans des cellules musculaires lisses aortiques en culture [68]. Une augmentation de l’expression des récepteurs ETA a aussi été rapportée au niveau des tissus vasculaires chez les rats Zucker obèses [68] et les rats hypertendus nourris avec une diète riche en fructose [69]. D'autre part, des niveaux plasmatiques élevés d’ET-1 ont été observés chez des patients diabétiques [70, 71], des rats Sprague Dawley ayant développé de l’hypertension et de la résistance à l’insuline suite à une diète riche en fructose [69] et des rats traités à la streptozotocine [61]. Récemment, dans une étude où étaient comparés des sujets normaux à des sujets qui présentaient le syndrome de résistance à l’insuline, Piatti et ses collaborateurs ont démontré qu’il existait une corrélation positive entre les niveaux plasmatiques de ET-1 et ceux de l’insuline et le degré de résistance à l'insuline [72]. De plus, il a été rapporté que l’ET-1 inhibe le transport du glucose dans des adipocytes en culture et qu’une administration d’ET-1 exogène pourrait induire de la résistance à l’insuline chez l’homme et chez le rat [17]. Il a été démontré également que l’ET-1 pouvait inhiber la voie de signalisation de l’insuline par la PI-3 kinase [17].

Les études dans le domaine vasculaire ont permis de démontrer l’importance de l’endothélium et du NO dans l’homéostasie vasculaire et circulatoire. L’importance de cette découverte est appuyée par la démonstration que plusieurs conditions physiopathologiques, lesquels représentent d’importants facteurs de risque des maladies cardiovasculaires, incluant l’hypercholestérolémie, les dyslipidémies, l’athérosclérose, l’hypertension, le diabète mellitus, l’insuffisance cardiaque, le tabagisme et l’obésité, sont associées avec une anomalie de la fonction endothéliale, se traduisant dans la plupart des cas par une altération de la réponse vasorelaxante normalement médiée par le NO [14, 18, 73, 74]. L’expression dysfonction endothéliale est un terme plus ou moins bien définie qui fait référence à une perte des fonctions régulatrices normales de l’endothélium et qui souvent survient assez tôt dans le développement de certaines pathologies. La dysfunction endothéliale fait référence en fait à plusieurs altérations des fonctions de l’endothélium, dont les propriétés anticoagulante, anti-inflammatoire et antimitogénique aussi bien qu’à ses propriétés vasorelaxantes. La dysfunction endothéliale traduit un déséquilibre entre les facteurs relaxants et contractants, procoagulants et anticoagulants, proinflammatoires et anti-inflammatoires, pro-athérogéniques et anti-athérogéniques et pro-mitogéniques et anti-mitogéniques [18, 75, 76]. Cependant, dans la plupart des publications scientifiques, cette expression est surtout utilisée pour désigner l’altération des réponses vasodilatatrices endothelium-dependantes, étant donné que cette altération est communément rencontrée dans la majorité des conditions associées à la dysfunction endothéliale et que cette altération est souvent présente avant même que des irrégularités structurales dans la paroi artérielle ne deviennent apparentes.

Plusieurs études ont indiqué que de manière générale la dysfonction endothéliale résultait d’une réduction de la biodisponibilité du NO [14, 76, 77], ce qui n’est pas surprenant étant donné l’implication importante du NO dans la plupart des fonctions régulatrices de l’endothélium. Théoriquement, cette diminution peut résulter de deux mécanismes : 1) une réduction de sa production et/ou 2) une augmentation de sa dégradation. En fait, il existe des évidences à l’effet que ces deux situations se rencontrent chez l’homme et de nombreux modèles animaux de maladies vasculaires. Une réduction de la production de NO, peut être consécutive à une réduction de l’expression et/ou de l’activité de l’enzyme eNOS, une réduction de la disponibilité de son substrat et/ou d’un ou de plusieurs cofacteurs essentiels à sa production ou encore à une augmentation de la production de facteurs contractants qui aurait pour effet de compromettre, entre autre, les actions vasorelaxantes du NO. D’autre part, une dégradation accrue du NO, peut être causée par un stress oxydatif consécutif à une production excessive de radicaux libres ou d’espèces réactives de l’oxygène (ROS). En effet, certains dérivés de l’oxygène ont la propriété de réagir très rapidement avec le NO et ainsi d’empêcher son action. Plusieurs de ces mécanismes ont été caractérisés chez l’homme, et des modèles animaux de pathologies associées à la dysfunction endothéliale (soit le lapin hypercholestérolémique ainsi que le rat diabétique, obèse et/ou hypertendu). Cependant, parmi tous ces mécanismes, un nombre croissant d’évidences tend à indiquer le stress oxydatif comme l’une des principales causes de la réduction de biodisponibilité du NO et subséquemment dans la dysfunction endothéliale.

L’hypercholestérolémie, le diabète, l’hypertension, la cigarette et l’âge sont tous des facteurs de risque ayant été associés avec une augmentation de la production d’agents oxydants. La production de ces substances a pour effet d’initier plusieurs processus impliqués dans le développement et la progression des complications cardiovasculaires, incluant une stimulation de la prolifération et migration des cellules musculaires lisses, l’apoptose dans l’endothélium, l’augmentation de l’expression des molécules d’adhésion, l’oxydation des lipides, l’activation des métalloprotéases de la matrice et une altération de la réactivité vasculaire.

Le stress oxydatif réfère à une perturbation dans la balance métabolique cellulaire durant laquelle, la génération d’oxydants accable le système de défense antioxydant, que ce soit par une augmentation de la production d’oxydants et/ou par une diminution de la défense antioxydante, ce qui résulte en l’accumulation de radicaux libres causant des dommages oxydatifs aux macromolécules du tissu hôte [78, 79].

Par définition, les radicaux libres sont des substances chimiques très réactives comportant un nombre impair d’électrons qui peuvent semer le désordre dans la structure des protéines cellulaires, des lipides membranaires, des acides nucléiques et ils peuvent éventuellement entraîner la mort cellulaire [1, 14, 80].

Bien que le stress oxydatif peut avoir de graves conséquences au niveau cellulaire et vasculaire, il n’en demeure pas moins que dans des conditions physiologiques normales, le stress oxydatif est une conséquence normale du métabolisme aérobique. En effet, dans ces conditions, l’oxygène moléculaire subit une série de réactions qui ultimement conduit à la génération de molécules oxydantes. Ces dérivés sont continuellement générés au niveau de la chaîne respiratoire mitochondriale, et représentent des produits secondaires de la respiration cellulaire (Figure 3) [40]. Ainsi par exemple, l’oxygène moléculaire est réduit pour former l’anion superoxyde (O2- ), lequel, une fois généré peut soit dismuter spontanément en peroxyde d’hydrogène (H2 O2 ) et en oxygène ou dans une réaction catalysée par la superoxyde dismutase (SOD). À noter que cette enzyme est généralement présente en quantité suffisante pour assurer une dismutation rapide et efficace de tout l’O2- produit par la chaîne respiratoire. Le peroxyde d’hydrogène généré par cette réaction est ensuite hydrolysé par la catalase ou par la glutathion péroxydase.

Bien que dans des conditions physiologiques normales, l’anion O2- n’est produit qu’en faible quantité et que les systèmes de défense endogènes suffisent à neutraliser cette production, il arrive cependent que dans certaines situations particulières, comme par exemple dans des cas d’infection, d’inflammation ou de blessures, ou en réponse à certains stimuli exogènes ou endogènes [81], les quantités produites d’O2 - excéde la capacité antioxydante locale. Il s’en suit alors un stress oxydant au niveau des cellules endothéliales et musculaires lisses, qui altère leur fonction normale. Une fois le stress oxydant déclanché, un profil pathophysiologique caractéristique s’ensuit, notamment une altération de la relaxation vasculaire, de l’angiogénèse, induction de l’apoptose, adhésion des monocytes, activation plaquettaire, de l’hypertrophie vasculaire, prolifération et migration des cellules des muscles lisses vasculaires, activation des métalloprotéases de la matrice et remodelage vasculaire. De plus, il a été rapporté que le stress oxydatif stimule la synthèse d’homocystéine (un facteur de risque pour l’athérosclérose) et de méthylarginine (un inhibiteur endogène des enzymes NOS) [18]. Il va sans dire que ces nombreux changements induits par le stress oxydatif peuvent contribuer au développement et à la progression des maladies cardiovasculaires [82].

L’anion O2 - a été identifié comme étant un médiateur clé dans plusieurs des actions nuisibles des dérivés de l’oxygène. Cependant, cet anion initie aussi la formation de plusieurs autres molécules oxydantes, dont le H2 O2 . Bien que le H2 O2 soit un agent oxydant relativement faible, il peut cependant être réduit par la suite via différentes réactions, dont celle de Haber-Weiss, ou celle de type Fenton en présence de l’ion ferreux et être ainsi converti en un radical hydroxyl hautement reactif (OH°) et grandement toxique. Tous ces dérivés de l’oxygène, soit l’O2- , le H2 O2 et l’- OH, peuvent en retour induire la peroxydation des lipides et contribuer ainsi à la formation de lipoprotéines de faible densité (LDL) oxydées (LDLox). De plus, une production excessive d’O2 - favorise la réaction entre l’O2 - et le NO produit par l’enzyme eNOS, ce qui entraîne la production de peroxynitrite (ONOO- ) et réduit par conséquent la biodisponibilité du NO pour d’autres réponses biologiques, dont notamment la vasorelaxation dépendante de l’endothélium. La réaction du NO avec l’O2 - est très rapide (vitesse de la réaction : 4-20 x 109  M-1 *S-1 ), soit environ trois fois plus rapide que la neutralisation de l’O2 - par la SOD [40]. Le ONOO- ainsi formé est un agent oxydant extrêmement puissant, capable d’endommager plusieurs molécules biologiques et de causer d’importants préjudices tissulaires et donc, de contribuer à la dysfonction endothéliale. D’autre part, le ONOO- a aussi la propriété d’initier la peroxydation des lipides et donc, de contribuer à la formation de LDL oxydées. Plusieurs évidences experimentales existent à l’effet que les LDL oxydées ainsi formées peuvent causer d’important préjudices aux cellules endothéliales et à la paroi vasculaire et ainsi altérer les réponses vasculaires.

Il existe au niveau vasculaires plusieurs sources ou systèmes enzymatiques qui, dans des condtions normales ou pathophysiologiques, sont capables de produire de l’O2 - et ses dérivés. Ces sources sont: les mitochondries (O2 - générés au cours de la respiration mitochondriale) qui dans des conditions physiologiques normales peuvent produire des quantités importantes de radicaux libres, la NADH/NAD(P)H oxydase(s), la xanthine oxydase, l’enzyme eNOS, la cycloxygénase, la lipoxygénase, la glucose oxydase et la myéloperoxydase [79]. La contribution relative de chacune de ces sources au cours d’un stress oxydatif n’est pas encore tout à fait élucidée. Cependant dans le contexte des maladies vasculaires, les systèmes enzymatiques NADH/NADPH oxydase(s), la xanthine oxydase et l’enzyme eNOS ont été identifiés comme étant des sources majeures d’O2 - impliquées dans l’altération de la fonction cellulaire de même que dans la génèse et le développement de maladies cardiovasculaires.

La NAD(P)H oxydase est une enzyme associée aux membranes des cellules du système cardiovasculaire qui catalyse la réduction d’un électron de l’oxygène en utilisant le NADH ou le NAD(P)H comme donneur d’électron [82] selon l’équation suivante :

Plusieurs évidences expérimentales et cliniques ont révélé que l’enzyme NAD(P)H oxydase représente une source majeure d’O2 - dans les cellules endothéliales et vasculaires dans plusieurs conditions pathologiques associées à la dysfunction endothéliale, telles que l’athéroclérose, l’hypertension, le diabète mellitus, le resténose, et l’hypercholestérolémie [75, 83, 84]. À l’origine, cette enzyme (ou complexe enzymatique constitué de plusieurs sous unités) a été caractérisée dans les neutrophiles. Ce même complexe enzymatique a ensuite été identifié dans les cellules endothéliales et les cellules des muscles lisses vasculaires (Figure 15). Ce qui rend la NAD(P)H oxydase si importante dans la fonction vasculaire est sa capacité à réagir à une variété de stimuli ayant un impact hémodynamique. L’activité de la NAD(P)H oxydase peut être augmentée par différents facteurs hémodynamiques (stress d’étirement), génétiques (polymorphisme au niveau du promoteur p22phox) et humoraux (l’angiotensine II, LDLox et cytokines inflammatoires) [82]. Voici la structure de la NAD(P)H oxydase associée aux membranes des cellules musculaires lisses vasculaires.

La résistance à l’insuline (ou insulino-résistance) se définit comme étant une condition caractérisée par une réduction de la réponse des tissus à des concentrations physiologiques normales d’insuline. Bien que la résistance à l’insuline peut impliquer plusieurs actions exercées par l’insuline, cette expression réfère surtout à une réduction de la capacité glucorégulatrice de l'hormone [16, 17, 85, 86]. Le foie et le muscle squelettique étant les deux principaux tissus impliqués dans le maintien de l'homéostasie du glucose, la résistance à l'insuline a donc été catégorisée de résistance hépatique et de résistance périphérique. La résistance hépatique se traduit par une atténuation de la capacité de l'insuline à bloquer la production de glucose par le foie, alors que la résistance périphérique se traduit par une réduction de l'action stimulatrice de l'insuline sur l'entrée et l'utilisation du glucose par les muscles squelettiques [85, 86]. Le muscle squelettique peut à lui seul extraire jusqu'à 90% du glucose plasmatique en présence d'insuline, ce qui lui confère un rôle majeur dans la régulation du transport du glucose [87, 88]. La résistance à l'insuline est une caractéristique communément rapportée chez les patients diabétiques de type 2, les personnes obèses, dyslipidémiques et les sujets hypertendus [85, 89, 90]. Elle peut être aussi décelée chez des personnes pré-diabétiques, des personnes non diabétiques qui développeront plus tard la maladie, de même que chez les enfants de parents hypertendus [91-93]. De plus, la résistance à l’insuline peut aussi être induite expérimentalement chez l’animal par le biais d’une alimentation à teneur élevée en sucre et en gras saturé, ou encore par un régime hypercholestérolémique [31, 94, 95]. Par conséquent, il semble que la présence de certaines prédispositions génétiques et/ou de certains facteurs environnementaux (tels que la sédentarité, les habitudes de vie, l’alimentation et l’excès de poids) peuvent contribuer au développement de la résistance à l'insuline (Figure 16). À l’exception d’un déficit sécrétoire de l'insuline, l'insulino-résistance entraîne une élévation des taux circulants d'insuline (à jeun ou après une charge glucidique) et plusieurs études assimilent l’hyperinsulinémie et l’insulino-résistance [85, 96].

La résistance à l’insuline induit une dysfonction endothéliale qui est en lien avec une production exessive de ROS et une augmentation des réactions de découplage de l’enzyme eNOS [16]. De plus, dans la résistance à l’insuline, une diminution simultanée des mécanismes de défense antioxydants causant des dommages cellulaires (organelles et enzymatiques) et menant à l’augmentation de la peroxydation des lipides a été observée [80]. Cette augmentation du stress oxydatif entraîne une surproduction d’O2 - par rapport à la production du NO. En fait, l’O2 - réagit avec le NO pour former du ONOO- , ce qui cause une diminution de la biodisponibilité du NO et à une augmentation de la résistance vasculaire, bloquant ainsi la vasodilatation dépendente de l’endothélium [33]. En fait, le stress oxydatif serait responsable d’une multitude de dysfonctions métaboliques comme la résistance à l’insuline, l’obésité, l’hypertension, les maladies cardiovasculaires, le diabète et l’athérosclérose. De plus, il est indéniable que le plus important point en commun de ces pathologies est la dysfonction endothéliale. Finalement, le stress oxydatif, les niveaux d’ET-1, l’activité du système rénine-angiotensine et l’activité sécrétoire d’hormones et de cytokines par le tissu adipeux sont tous liés à la résistance à l’insuline et aux pathologies vasculaires [17].

L’augmentation de la prévalence et de l’incidence des maladies cardiovasculaires est la conséquence clinique la plus importante de l’obésité abdominale [97]. Une personne est considérée obèse si son indice de masse corporelle, c’est-à-dire que son poids exprimé en kg, divisé par le carré de la taille exprimée en mètre est égale ou supérieure à 30. L’obésité morbide correspond, quant à elle, à un indice de masse corporelle égale ou supérieure à 40. D’ailleurs, Galen a été le premier à établir une méthode scientifique pour décrire et traiter l’obésité morbide [98]. L’obésité est indépendamment associée à la dysfonction endothéliale chez l’humain et elle est un facteur de risque indépendant pour le développement de l’athérosclérose dans les artères coronaires [73]. De plus, chez l’individu obèse et résistant à l’insuline, la dysfonction endothéliale est en corrélation avec la distribution des graisses abdominales et viscérales [47]. L’obésité est associée à une diminution de l’utilisation des graisses comme carburant. Cela signifie que les acides gras libres (AGL) en circulation dans les vaisseaux des muscles squelettiques sont moins utilisés suite à l’absorption d’aliments [3]. La majeure partie des personnes obèses sont souvent également atteintes de diabète de type 2. Cette association pourrait venir du fait que le tissu adipeux contient et libère des molécules qui tendent à augmenter la résistance à l’insuline. L’obésité ne touche pas seulement les adultes, mais aussi les enfants où elle est associée à une élévation du stress oxydatif qui joue un rôle important dans le développement de l’athérosclérose [99]. Une diminution des niveaux d’antioxydants plasmatiques et de la capacité antioxydante ont été observées chez ces enfants [99]. L’obésité infantile est associée à un risque accru de développer des maladies cardiovasculaires [99]. De plus, 9% des enfants obèses sont aussi atteints du syndrome métabolique [99].

L’association entre l’obésité, la résistance à l’insuline et la dysfonction endothéliale est fortement supportée par le fait que la vasodilatation dépendante de l’endothélium est diminuée en proportion avec la résistance à l’insuline et plusieurs indices d’adiposité en conditions basales [73]. En effet, chez les patients atteints du syndrome métabolique, il y a généralement une perte dans la capacité de vasodilatation dans les petits vaisseaux de l’avant-bras [73]. Donc, la perte simultanée de la relaxation médiée par le NO dans les artères de conductance et de la perte de la relaxation médiée par le potassium dans les artères de résistance ne font pas seulement que ces patients sont particulièrement prédisposés à des maladies cardiovasculaires prématurées, mais aussi à perpétrer la résistance à l’insuline en exerçant une action négative sur le métabolisme et sur l’hémodynamie [73].

Un régime alimentaire riche en graisse mène à une augmentation des AGL circulants, contribuant ainsi au développement de la résistance à l’insuline [8]. Il est bien connu que des taux élevés de lipides sanguins (triglycéride, cholestérol estérifié) peuvent entraîner la formation de plaques athéromateuses et ainsi contribuer à l’augmentation de la rigidité des artères. L’effet de l’insuline sur la rigidité des artères a récemment été comparé chez des individus obèses et non obèses [97]. Cette étude a clairement démontré une anomalie dans l’action normale de l’insuline à diminuer la rigidité artérielle chez l’obèse [97]. Cette action de l’insuline qui paraît bloquée chez l’obèse, pourrait être un mécanisme potentiel reliant l’obésité et les maladies cardiovasculaires [97]. Les AGL contribuent directement à diminuer la fonction des cellules bêta pancréatiques et sur la production d’insuline autant in vitro que in vivo possiblement dû à un effet transcriptionnel [8]. De plus, les AGL contribuent directement à la réduction du transport du glucose stimulé par l’insuline dû à une diminution dans la transduction du signal de l’insuline [8]. De plus, les AGL peuvent induire la protéine iNOS qui elle est associée à la résistance à l’insuline.

D’un autre côté, il a clairement été démontré que des modifications alimentaires peuvent être très efficaces dans l’amélioration de la sensibilité à l’insuline. De plus, l’ajout de certains nutriments au régime comme l’huile de poisson, les antioxydants, la L-arginine, l’acide folique et les protéines de soya ont tous montré qu’ils pouvaient améliorer la fonction endothéliale et amener, du moins en partie, à des effets cardioprotecteurs [74].

Plusieurs modèles animaux ont été développés pour étudier la résistance à l’insuline. Par exemple, les souris knockout conventionnelles pour le gène IRS-1 démontrent une intolérance au glucose et une diminution de la stimulation du captage du glucose par l’insuline [12]. La souris ob/ob (dont le gène de la leptine est inactivé) est un modèle largement utilisé dans l’étude de l’obésité et du diabète de type 2. Un autre exemple, le rat Zucker est un modèle animal génétiquement modifié caractérisé par une obésité et de la résistance à l’insuline. La présence de stress oxydatif a été démontré dans ce modèle animal [100, 101]. Il y a aussi le rat Zucker diabétique et obèse (ZDF) dont le gène du récepteur de la leptine est inactif.

De plus, une récente technique a grandement été améliorée afin d’étudier la résistance à l’insuline dans des tissus spécifiques par l’inactivation conditionnelle de gènes chez la souris [12]. Par exemple, le système Cre-lox-P est utilisé pour interrompre le gène du récepteur à l’insuline dans le muscle squelettique précisément chez la souris, ce qui permet de déterminer la contribution métabolique de la résistance à l’insuline musculaire sur le phénotype du diabète [12].

D’autres modèles animaux de résistance à l’insuline ont été élaborés à partir de rats naïfs nourris avec un régime alimentaire enrichie (glucides, gras). À cet effet, il a été démontré, dans notre laboratoire, que le rat Sprague-Dawley nourri avec un régime riche en sucrose durant 4 semaines développe une résistance à l’insuline [31]. Tout récemment, nous avons démontré que le rat Sprague-Dawley nourri avec un régime riche en graisse et en sucrose (HFHS) durant 4 semaines est aussi un bon modèle de dysfonction endothéliale et de résistance à l’insuline accompagné d’un surplus de poids [102]. D’autres équipes ont aussi développé des modèles animaux de résistance à l’insuline et de dysfonction endothéliale. Par exemple, Katakam et ses collaborateurs ont développé un modèle animal de dysfonction endothéliale et de résistance à l’insuline en utilisant le rat Sprague-Dawley nourri avec un régime riche en fructose [103]. D’autres groupes ont démontré que des rats naïfs nourris avec un régime alimentaire riche en sucre et en graisse induit une dysfonction endothéliale et le développement de l’hypertension [104-106]. De son côté, l’équipe du Dr André Marette a utilisé un modèle animal (la souris NOS2-/- ) dont le gène codant pour la protéine iNOS a été inactivé et qui ont aussi reçu un régime riche en gras afin d’étudier l’influence de la protéine iNOS dans le développement de la résistance à l’insuline [107].

Dans cette étude, nous avons voulu vérifier la possibilité que la dysfonction endothéliale et vasculaire, de même que la résistance à l’insuline précédemment rapportées dans notre modèle animal, résultent, du moins en partie, d’une réduction de la biodisponibilité du NO, consécutive à une augmentation du stress oxydatif induit par une alimentation hypercalorique. Des études effectuées autant chez l’homme, qu’avec certains modèles animaux de pathologies associées à de la dysfunction endothéliale (i.e. le lapin hypercholestérolémique, le rat diabétique, obèse ou hypertendu), ont en effet pointé le stress oxydatif comme l’une des principales causes de réduction de la biodisponibilité du NO, et subséquemment de la dysfunction endothéliale. Par exemple, une étude de l’équipe du Dr André Marette a démontré que des souris nourries avec un régime riche en graisse développent de la résistance à l’insuline, ont une augmentation de l’expression de la protéine iNOS dans le tissu adipeux et le muscles squelettique, ainsi qu’une augmentation de l’expression et de la sécrétion du TNF-alpha et d’autres cytokines pro-inflammatoires par rapport aux souris nourries avec un régime standard (chow) [107]. De plus, elles ont une réduction du transport du glucose stimulé par l’insuline par rapport aux souris contrôles. La présence de cytokines pro-inflammatoires induit l’expression de la protéine iNOS, qui elle détériore la voie de signalisaiton de l’insuline au niveau de la PI3-kinase en réduisant grandement son activité. Les résultats de cette étude démontrent bien la présence d’un lien entre la résistance à l’insuline et le stress oxydatif dans ce modèle animal [107]. D’autre part, une étude récente effectuée dans le laboratoire du Dre Hélène Bachelard a démontré qu’un régime riche en gras et en sucre induisait, chez le rat Sprague-Dawley, une altération de la réactivité vasculaire, caractérisée par une réduction significative de la vasorelaxation dépendante de l’endothélium, et une augmentation de la formation de protéines nitrotyrosinées (indice du stress oxydatif) par rapport aux rats contrôles nourris avec un régime standard de moulée pour rat [108]. Aussi, Roberts et ses collaborateurs ont démontré qu’un régime comparable entaîne aussi le développement d’une dysfonction endothéliale et d’un stress oxydatif par l’augmentation de la concentration plasmatique de l’H2 O2 ainsi que par une diminution de la capacité antioxydante [33]. Ainsi, plusieurs évidences suggèrent qu’un régime alimentaire entraînant le développement d’une dysfonction endothéliale et d’un stress oxydatif contribue grandement au développement de pathologies telles que le diabète de type 2 et l’obésité.

D’ailleurs, l’hypercholestérolemie, le diabète, l’hypertension et l’obésité sont tous des facteurs de risque ayant été associés avec une augmentation de la production d’espèces réactives de l’oxygène par les cellules vasculaires (cellules endothéliales et musculaires lisses vasculaires). À cet effet, certains radicaux libres de l’oxygène ont la propriété de réagir très rapidement avec le NO. Ainsi par exemple, l’anion superoxyde réagit très rapidement avec le NO pour former du ONOO- qui peut à son tour conduire à la formation d’acide peroxynitreux dont les produits de clivage sont parmi les dérivés de l’oxygène les plus réactifs connus. Il a été démontré que le ONOO- induit des dommages oxydatifs à l’ADN, aux lipides et aux cellules vasculaires contribuant tous aux dommages cellulaires. En outre, l’inactivation du NO par les ROS vient empêcher, ou du moins altérer, ses effets vasodilatateurs, antiathérogènes, anti-inflammatoires et anti-prolifératifs. Plusieurs autres systèmes de défense contre le stress oxydatif existent dans les cellules.

En conditions normales, le métabolisme aérobique chez les mammifères génère des substances réactives de l’oxygène, lesquels sont susceptibles de créer d’importants préjudices vasculaires. Le stress oxydatif vasculaire est impliqué dans un large spectre de maladies cardiovasculaires et pulmonaires, lesquelles ont un impact énorme sur la santé des populations de pays industrialisés [14]. Il est souvent initié et propagé par une surproduction d’O2 - et de H2 O2 et par leur conversion en de puissants oxydants qui sont très dommageables pour les cellules. Cependant, en guise de protection, les cellules possèdent des mécanismes de défense endogènes enzymatiques et non-enzymatiques qui, de manière générale, suffisent à renverser le stress oxydant résultant du métabolisme aérobique et que l’on appelle antioxydants. Les antioxydants ont comme principal rôle de neutraliser et de dégrader les radicaux libres toxiques pour les tissus. Par conséquent, le concept d’une thérapie à l’aide d’antioxydants, dans le but de renforcir les défenses antioxydantes endogènes pour une protection plus efficace contre le stress oxydatif, représente un but thérapeutique important et est d’intérêt scientifique et public [14]. En effet, plusieurs études démontrent que la défense antioxydante peut être soit diminuée ou compromise dans certaines conditions pathophysiologiques. Ainsi par exemple, une diminution des niveaux d’antioxydants spécifiques comme la vitamine E et l’acide ascorbique, ainsi qu’une réduction de l’activité d’enzymes antioxydantes, comme la catalase, la SOD et la gluthation péroxydase, ont été observée et décrite chez des patients diabétiques [84].

Présentement, la thérapie antioxydante est considérée comme un outil pharmacologique utile pour renverser la dysfonction endothéliale [109]. Parmi les différents antioxydants, les plus communs sont les vitamines A, C et E, et les enzymes SOD, catalase et glutathion péroxydase. D’autres antioxydants comme l’acide lipoléique, les caroténoïdes, la coenzyme Q10, plusieurs bioflavonoïdes, les antioxydants minéraux (cuivre, zinc, manganèse et le sélénium) et les cofacteurs (l’acide folique, les vitamines B1, B2, B6, B12) peuvent aussi défendre l’organisme [80]. Tous ces antioxydants travaillent de façon synergique contre les différents types de radicaux libres. Par exemple, la vitamine E élimine la propagation de la peroxydation des lipides, tandis que les vitamines C et E inhibent la formation d’hydroperoxyde [80]. Ces antioxydants ont donc un potentiel intéressant dans le traitement de conditions pathologiques associées au stress oxydatif. De leur côté, les enzymes SOD (conversion de l’O2 - en H2 O2 ) et catalase (conversion du H2 O2 en H2 O) semblent être les meilleures candidates pour le développement d’une médication antioxydante [14]. Cependant, les divers résultats obtenus chez les animaux ou en clinique indiquent que ces enzymes n’ont fourni qu’une modeste, sinon aucune protection contre le stress oxydatif vasculaire [14]. Cela peut s’expliquer en partie par une distribution inadéquate de ces enzymes au site d’action thérapeutique, comme par exemple, une zone ischémique ou un foyer d’inflammation [14].

Les antioxydants peuvent être divisés en deux groupes selon leur mode d’action : les antioxydants enzymatiques et les antioxydants non-enzymatiques (piégeurs) [14]. Les enzymes antioxydantes (SOD et catalase) possèdent plutôt une grande affinité pour les ROS, avec lesquelles elles réagissent très rapidement pour les neutraliser [14]. De leur côté, les piégeurs sont de petites molécules, comme la vitamine E, pouvant être administrées oralement pour traiter le stress oxydatif chronique [14]. Cependant, étant donné que les piégeurs sont consommés par les ROS, ils doivent donc être administrés à des concentrations relativement élevées pour être efficaces [14]. Par conséquent, il est proposé que les enzymes antioxydantes fourniraient une protection plus efficace contre les ROS, comme dans l’inflammation par exemple, par rapport aux piégeurs [14].

La SOD est l’une des plus importantes enzymes cellulaires qui possède une fonction antioxydante. En fait, elle est l’enzyme antioxydante contre les O2 - la plus importante dans toutes les cellules vasculaires [79]. La SOD catalyse la dismutation de l’O2 - de la manière suivante : 2O2 .-  + 2H+  → O + H2 O2 . L’absence de cette enzyme est létale et une trop grande quantité, durant un stress oxydatif, entraîne une production d’H2 O2 excessive qui devient rapidement toxique pour la cellule. La quantité de SOD produite est contrôlée par des gènes spécifiques sensibles aux réactions d’oxydo-réduction. L’activité des SOD est dépendante d’ions métalliques et elle est présente dans le cytoplasme (Cu/Zn-SOD, cuivre-zinc), dans le milieu extracellulaire (EC-SOD, cuivre-zinc) et dans les mitochondries (Mn-SOD, manganèse), où elle maintient la concentration d’anion O2 - à des niveaux faibles [79]. La EC-SOD est fermement liée à la membrane des cellules endothéliales et est particulièrement abondante dans l’interstitium de la paroi artérielle. Sa localisation entre l’endothélium et les muscles lisses vasculaires, soit là où le NO est normalement inactivé par l’anion O2 - , font de la EC-SOD un important régulateur de la biodisponibilité du NO et de la fonction endothéliale, bien que la Cu/Zn-SOD joue également un rôle important [110]. La forme extracellulaire de la SOD peut aussi se retrouver dans le plasma, la lymphe et le liquide synovial qui agit à la surface des cellules. Le NO peut réguler à la hausse la SOD extracellulaire et la SOD-manganèse dans les cellules musculaires lisses vasculaires [79].

Plusieurs études ont démontré l’importance de la SOD dans le maintien de la réactivité vasculaire. Ainsi par exemple, dans une étude récente où ont été comparées les réponses vasorelaxantes d’un agoniste cholinergique dans des préparations d’artéres mésentériques isolées de souris sauvages et de souris SOD knockout, il a été observé que l’administration de doses croissantes de méthacholine provoquait dans les deux groupes de souris une relaxation, laquelle était toutefois plus élevée dans le groupe de souris sauvages [111]. Cependant, en présence de PEG-SOD, un antioxydant liposoluble, la relaxation induite par la méthacholine chez le groupe SOD knockout, a été significativement améliorée. Cette amélioration a été abolie suite à l’addition de L-NAME, ce qui suggère que l’addition de PEG-SOD a pu contribuer à augmenter la biodisponiobilité du NO en réduisant sa dégradation causée par le stress oxydatif et une production excessive de O2- [111]. Dans une autre étude, des rats ont été soumis pendant six semaines à un régime alimentaire pauvre en cuivre, afin d’induire chez ces derniers une réduction de l’activité CuZn-SOD. Il a été observé qu’une réduction de l’activité de cette enzyme entraînait une réduction significative de la réponse vasorelaxante endothelium-dependent à l’acétylcholine dans des préparations d’anneaux d’aorte isolés [112]. Par ailleurs, il a été rapporté qu’en présence d’un inhibiteur de la Cu/Zn-SOD, soit du diethyldithiocarbamate, la réponse vasorelaxante de l’acétylcholine était significativement réduite dans des préparations d’anneaux d’aorte isolés de rats normaux [112]. Ces études confirment donc l’importance de la SOD comme mécanisme de défense endogène antioxydant.

Parmi les autres mécanismes endogènes non-enzymatiques ayant un pouvoir antioxydant, il y a des vitamines E et C pour ne nommer que ceux-là.

La vitamine E (alpha-tocophérol) est liposoluble et elle est l’antioxydant le plus important dans les lipides [114]. En fait, la vitamine E est l’antioxydant prédominant dans les lipoprotéines et les membranes cellulaires. La vitamine E neutralise de manière efficace les ROS. Elle agit de deux façons différentes, soit en piégeant directement les ROS ou en régulant à la hausse les enzymes antioxydantes, telles que la SOD, les glutathion péroxydase et réductase, la catalase du foie, la glutathion-transférase et la NAD(P)H réductase [114]. Il a été rapporté que l’alpha-tocophérol cellulaire pourrait être impliqué dans l’inhibition de la PKC, la diminution de la relâche de ROS en inhibant l’assemblage de la NAD(P)H oxydase, la réduction de l’oxydation des lipides, la diminution de la relâche de cytokines (interleukine-1 et le TNF-alpha) et la diminution de l’adhésion des monocytes à l’endothélium [115].

De son côté, la vitamine C (acide ascorbique) est l’un des principaux antioxydants hydrosolubles présent dans les fluides intra- et extra-cellulaires (compartiments hydrophiles) [114]. Ses activités biologiques viennent de son puissant potentiel réducteur. La vitamine C agit principalement en piégeant directement les ROS (majoritairement l’O2 - et le ONOO- ) ou bien elle peut recycler l’alpha-tocophérol pour aider à prévenir l’oxydation des lipides [114].

Certaines études ont démontré expérimentalement qu’un traitement aigu avec ces antioxydants pouvait améliorer la sensibilité à l’insuline et la fonction endothéliale et réduire l’incidence d’événements cardiovasculaires [17, 116]. Cependant, de récentes études effectuées à plus grande échelle ne viennent pas confirmer ces données. [17].

En effet, des études cliniques n’ont pas réussi à démontrer que les antioxydants, comme la vitamine E et C, avaient des effets bénéfiques sur des patients atteints de maladies coronariennes. En effet, selon Warnholtz et collaborateur, la vitesse de réaction entre ces vitamines et l’O2 - est beaucoup plus lente (de 1000 et 10000 fois) que celle entre le NO et l’O2 - [117]. Donc, pour être efficace, les antioxydants doivent être administrés en grande quantité, ce qui peut avoir comme conséquence un effet pro-oxydant, c’est-à-dire un effet contraire à celui recherché [117]. Par exemple, cet effet pro-oxydant peut résulter de la réaction de l’anti-oxydant avec un radical libre, permettant ainsi à la nouvelle molécule de participer à des activités pro-oxydantes. C’est pourquoi il est important de déterminer la dose optimale d’antioxydant dans le but d’améliorer et non d’empirer la fonction vasculaire. Ces résultats décevants peuvent être en partie dus aux différents antioxydants choisis dans chaque étude.

Les nitroxydes sont des radicaux libres stables et ils sont non seulement de puissants antioxydants, mais également les radioprotecteurs de non-thiol (exemple : les inhibiteurs de l’enzyme de conversion de l’angiotensine) les plus efficaces [118]. Ils protègent contre la toxicité des ROS autant in vitro que in vivo [119]. D’ailleurs, il a été observé que les nitroxydes pouvaient conduire à l’élimination ou du moins, à la réduction des dommages causés par le stress oxydatif [120, 121]. De plus, il a été rapporté que les nitroxydes, dont le cycle contient 5 atomes de carbones et 1 atome d’azote, pouvaient réagir avec l’O2- deux fois plus rapidement que les nitroxydes dont le cycle contient seulement 4 atomes de carbones et 1 atome d’azote, ce qui en font des agents mimétiques de la SOD plus utiles [122]. Aussi, selon Hahn et collaborateurs, les nitroxydes ont des propriétés anti-inflammatoires, car ils protègent les cellules contre des dommages causés par les ROS à l’ADN suite à l’activation des neutrophiles [123]. De plus, les nitroxides sont largement utilisés comme sondes biophysiques en spectroscopie de résonance paramagnétique électronique [119]. La Figure 17 représente la structure générale des nitroxydes.

Le tempol a la particularité d’être stable, soluble dans l’eau, perméable aux membranes, de faible toxicité, lipophile et considéré comme étant non-immunologique [120, 124]. Notre intérêt s’est arrêté sur le tempol, car en plus de posséder les caractéristiques des nitroxydes, il est du type SOD mimétique [125, 126] et contrairement aux SOD endogènes, le tempol ne requière pas la présence d’ions métalliques pour agir. De plus, le tempol a l’avantage d’être de petite taille (poids moléculaire de 172,25   g*mol-1 ) et contrairement au large peptide formé par les SOD endogènes (poids moléculaire variant de 2 x 23 000 à 2 x 28 000), il est plus stable et plus lipophile aux membranes. Le tempol est aussi un bon protecteur de radiation in vivo [124, 125]. Le tempol réagit aussi très rapidement avec l’anion O2- pour le neutraliser (vitesse de réaction du tempol avec l’O2- à pH=7,0 varie entre 1,1 x 103 à 1,3 x 106  M-1  s-1 ) [125]. À ce jour, il n’y a pas d’étude consernant la toxicité du tempol chez l’humain. Par contre, quelques études utilisant des préparation de cellules isolées [127, 128] et une étude où une solution de tempol (70 mg/ml d’une solution d’éthanol à 70%) a été appliquée sur la peau ont été publiées [129].

Le tempol est une molécule encore très peu utilisée dans le domaine de la dysfonction endothéliale. En effet, son action dans le contexte des maladies cardiovasculaires, comme l’athérosclérose et l’hypertension est peu documentée, alors que ses actions dans des préparations de vaisseaux isolés comme l’aorte, de même que dans le muscle squelettique et son influence sur la dismutation de l’O2- provenant majoritairement du système NAD(P)H oxydase, sont encore moins bien définis.

Cette section résume quelques uns des résultats obtenus à partir de recherches effectuées au niveau vasculaire et utilisant le tempol. Tout d’abord, dans des préparations de cellules endothéliales d’aorte de bovin, il a été rapporté que le tempol accélère l’action de la SOD et augmente la quantité de NO relâchée par les cellules en culture [120]. De façon similaire, des études effectuées in vitro ont démontré que les nitroxydes mimétiques de la SOD augmentent la biodisponibilité et la quantité détectable de NO [120]. Le tempol améliore aussi la vasodilatation dépendante de l’endothélium induite par l’acétylcholine dans des artérioles afférentes rénales de lapins rendus diabétiques suite à un traitement à l’alloxane (diabète de type 1) [130]. De plus, Onuma et ses collaborateurs ont démontré que le tempol pouvait augmenter la biodisponibilité du NO et ainsi influencer des mécanismes impliqués dans le contrôle du débit sanguin médullaire chez des rats nourris avec un régime fructosé (induisant l’hypertension) et traités avec le tempol (1 mmol/L) durant 4 semaines [126]. Dans une autre étude, il a été démontré que l’administration chronique de tempol chez des rats âgés avait pour effet de normaliser les réponses vasoconstrictrices, induites par la norépinéphrine ou la sérotonine, de même que les réponses vasodilatatrices causées par l’acétylcholine, la papavérine ou l’isoprénaline, dans des préparations de lits mésentériques isolés [131]. En fait, les réponses observées étaient similaires à celles obtenues dans des préparations vasculaires de jeunes rats, suite au traitement avec le tempol [131]. D’autre part, Hahn et collaborateurs ont rapporté une réduction de la pression artérielle moyenne et une diminution de la résistance vasculaire systémique chez le porc suite à une infusion intraveineuse de tempol [119]. Chez l’humain, une équipe de Londre a isolée des anneaux d’artère radiale provenant de patients hypertendus avec hypercholestérolémie qu’ils ont mis en présence ou non de tempol [128]. Ils ont démontré que le traitement au tempol d’anneaux d’artères radiales diminu la réponse contractile et réduit la production de superoxydes engendrées par l’angiontensine II dans ces artères [128].

Nous avons émis l’hypothèse qu’une réduction de la biodisponibilité du NO, consécutive à une augmentation de sa dégradation par des molécules oxydantes, lesquelles résultent d’une augmentation du stress oxydatif induit par un régime alimentaire à teneur élevée en graisse et en sucre, contribue, du moins en partie, à l’insulino-résistance et à la dysfonction endothéliale précédemment observées dans notre laboratoire chez ce même modèle animal. Le principal objectif de mon projet de maîtrise consistait à caractériser les effets d’un traitement chronique avec un antioxydant (le 4-hydroxy-2,2,6,6-tétraméthyl pipéridine- N -oxyl (tempol)), sur les paramètres cardiovasculaires, la sensibilité à l’insuline, la réactivité vasculaire, la fonction endothéliale et les réponses vasculaires et hémodynamiques à l’insuline dans un modèle animal de résistance à l’insuline et de surplus de poids, soit le rat Sprague-Dawley soumis à un régime à teneur élevée en graisse et en sucre.

Suite à la période d’acclimatation, les rats furent entraînés au gavage une fois par jour durant 5 jours. Les expérimentations décrites dans ce mémoire ont été réalisées sur des rats mâles Sprague Dawley de 150-200 g âgés initialement de 5 semaines (Laboratoire Charles Rivers). Les rats ont été divisés de façon aléatoire en deux groupes, soit un groupe contrôle «chow», lequel recevait comme nourriture de la moulée standard pour rat, et un groupe «HFHS» («high fat high sucrose»), lequel était soumis à une alimentation à teneur élevée en gras et en sucrose (Tableau 4). Ce régime est comparable à celui d’un pourcentage fort élevé de la population nord-américaine, c’est à dire riche en gras saturés et en sucres raffinés. Chacun des deux groupes a été subdivisé en deux autres groupes, soit un groupe contrôle et un groupe HFHS traités avec du tempol administré par gavage intragastrique à la dose de 1,5 mmol/kg une fois par jour, et des groupes contrôles et HFHS non traités. Les régimes chow et HFHS, avec ou sans traitement au tempol, s’échelonnaient sur une période de 4 à 5 semaines. La consommation de nourriture et d’eau, de même que la prise de poids ont été mesurées quotidiennement pour chacun des rats.

Des études ont indiqué qu’un tel régime hypercalorique peut entraîner, avec le temps, des désordres métaboliques tels que de l’hyperglycémie, une hyperlipidémie et une hyperinsulinémie, lesquels représentent d’importants facteurs de risque des complications cardiovasculaires. En effet, une association entre ces facteurs de risque et la dysfonction endothéliale, la résistance à l’insuline, le diabète de type 2, l’obésité, l’hypertension artérielle et pulmonaire et l’athérosclérose a été rapportée. Le modèle animal utilisé dans cette étude a déjà fait l’objet d’une étude descriptive et fonctionnelle par un de mes prédécesseurs, M. Frédéric Bourgoin, au laboratoire du Dre Bachelard. Parmi les différentes caractéristiques physiques et métaboliques de ce modèle animal, il a été démontré que le rat HFHS par rapport au rat contrôle Chow possède, à la fin des 4 semaines du régime HFHS, un poids corporel total supérieur, une glycémie et une insulinémie plus élevées, des niveaux plasmatiques de triglycérides et d’acide gras non estérifiés plus élevés, une réduction de la sensibilité à l’insuline, de même qu’une altération de la réactivité vasculaire résultant possiblement d’une dysfonction endothéliale. Ce modèle animal présentent des caractéristiques physiopathologiques se rapprochant étroitement de celles rapportés chez l’humain obèse et insulino-résistant. Ce modèle animal est donc très pertinent pour élucider les mécanismes de dysfonction endothéliale et vasculaire associées à la résistance à l’insuline induite par le biais d’une alimentation du type «fast-food» ou «nord-américaine».

Des groupes de rats Chow et HFHS traités ou non avec du tempol ont été utilisés afin de déterminer, dans chacun des groupes, le transport du glucose, la réactivité vasculaire in vitro , ainsi que l’expression de certaines protéines et molécules d’intérêts dans différents tissus. Les expérimentations ont été effectuées à la fin des quatre semaines de régime chez l’animal à jeun (12-14 heures), anesthésiés au pentobarbital (75 mg/kg, i.p.), puis sacrifiés par une ponction cardiaque.

Cette technique est effectuée afin de mesurer la captation de glucose, à l’aide d’un analogue de glucose marqué ([3 H]-2-déoxyglucose), à l'état basal ou lorsque stimulée par des doses croissantes d'insuline. Cette technique repose sur le fait que lorsque le glucose entre dans les cellules, il est immédiatement phosphorylé afin d’être maintenu à l’intérieure de la cellule. L’analogue utilisé, le [3 H]-2-déoxyglucose, est non métabolisable et il permet de mesurer le transport du glucose dans le tissu cible.

Le transport de glucose basal et stimulé par l’insuline a été déterminé dans les muscles squelettiques soleus et EDL (extensor digitorum longus) isolés de nos quatre groupes expérimentaux. Pour ce faire, les muscles squelettiques soleus et EDL droits et gauches ont rapidement été prélevés chez l’animal anesthésié, puis déposés dans un plat de pétri contenant une solution oxygénée (95% O2 et 5% CO2 ) de Krebs-Ringer Bicarbonate (KRB) à un de pH=7,4. La composition du KRB est la suivante: chlorure de sodium (NaCl) : 137 mM, chlorure de potassium (KCl) : 5 mM, sulfate de magnésium (MgSO4 (7H2 O)) : 1 mM, phosphate de sodium (NaH2 PO4 (2H2 O)) : 1 mM, chlorure de calcium (CaCl2 ) : 2 mM et bicarbonate de sodium (NaHCO3 ) : 24 mM. Chaque muscle est ensuite découpé longitudinalement en trois lanières de 20-30 mg et incubés pour une période de 30 minutes à 30°C dans des fioles de 25 ml contenant 3 ml d’une solution physiologique de KRB-I (KRB + D-glucose : 8 mM, mannitol : 32 mM et l’albumine sérique bovine (BSA) : 0,1%), sous oxygénation et agitation constantes. Suite à cette première incubation, les tissus ont été à nouveau incubés dans les mêmes conditions, mais cette fois-ci en absence ou en présence de doses croissantes d’insuline (Humulin R) (0.002, 0.02, 0.2 et 2 mU/ml). Après l’incubation, le KRB-I a été retiré de chaque fiole et remplacé par 3 ml d’une solution fraîche de KRB-II oxygénée (KRB + mannitol : 40 mM et BSA : 0,1%). Les muscles ont ainsi été incubés pendant 10 minutes à 29°C sous agitation constante et en présence ou en absence d’insuline, selon l’incubation précédente. Suite à cela, le KRB-II a été retiré de chaque fiole, puis remplacer par 3 ml d’une solution radioactive de KRB-III (KRB + [3 H]-2-déoxy-D-glucose (2DG) (2,25 μ Cu/ml) : 8 mM, [14 C]-mannitol (0,3 μ Cu/ml) : 32 mM, pyruvate de sodium : 2 mM et BSA : 0,1%) oxygénée. Les muscles ont été incubés dans cette nouvelle solution pendant 20 minutes à 29°C, sous agitation constante. À la fin de cette dernière étape d’incubation, les muscles ont été retirés des fioles, épongés à l’aide d’un papier filtre, puis rapidement congelés à –80°C. Par la suite, chaque muscle a été pesé, bouilli durant 10 minutes, vortexé et centrifugé à 1000 x  g pendant 10 minutes. Des triplicatas de 200 μ l de ce surnageant et du milieu d’incubation (KRB-III) ont été comptés pour la radioactivité à l’aide d’un compteur à scintillations. La captation du 2DG a été corrigée pour les quantités résiduelles interstitielles en utilisant le [14 C]-mannitol.

La vasodilatation dépendante de l’endothélium peut être induite expérimentalement en exposant un vaisseau à un agent pharmacologique (comme l’acétylcholine et le carbachol (CA)) ou à des forces de cisaillements. Cette technique reproductible et accessible est largement utilisée afin d’évaluer la fonction endothéliale et la biodisponibilité du NO dans différentes conditions pathologiques [17].

Suite à la ponction cardiaque effectuée chez l’animal anesthésié, la cage thoracique du rat a été ouverte et l’aorte thoracique a été prélevée. Le vaisseau a été placé dans une solution de Krebs-Henseleit modifiée (NaCl : 118 mM, KCl : 4,7 mM, NaHCO3  : 25 mM, MgSO4  : 1,18 mM, KH2 PO4  :1,18 mM, CaCl2  : 2,5 mM, glucose : 5,5 mM; pH=7,4) et soigneusement dégagé de tout tissus conjonctifs. L’aorte a été coupée en quatre anneaux de 3-4 mm de long, lesquels ont été installés dans quatre bains à organe de 20 ml, puis suspendus à des transducteurs de forces reliés à un physiographe Grass. Chacun des anneaux a été soumis à une tension de 2 grammes. Chaque bain contenait 15 ml de la solution physiologique de Kreb’s oxygénée (95% d’O2 et 5% de CO2 ) et maintenue à une température de 37°C. Dans quelques bains, les essais biologiques ont été effectués en présence de L-NAME (NG -nitro-L-arginine méthylester, 100 mM), un antagoniste des NOS. Cet antagoniste était alors présent pendant toute la période d’équilibration et d’expérimentation. La période d’équilibration avant chaque expérience était d’une heure, durant laquelle des lavages ont été effectués aux 15 minutes. À la fin de la période d’équilibration, les anneaux ont été stimulés une première fois avec du KCl (18 mM), laquelle solution provoque une vasocontriction. Lorsqu’un plateau était atteint, une période de lavage s’en suivait aux temps 0, 2, 4, 8, 15 et 30 minutes. Les tissus étaient ensuite contractés de nouveau avec une dose de phényléphrine (10-6  M) suivi d’une relaxation avec une dose de CA (10-5  M), afin de vérifier l’intégrité de l’endothélium. Après confirmation d’un endothélium intact, des courbes dose-réponse ont été obtenues pour chacune des substances vasoactives suivantes : (1) phényléphrine (10-9 à 10-5  M), (2) pré-contraction avec phényléphrine (10-6  M ) suivi de carbachol (10-8 à 10-4  M), (3) pré-contraction avec phényléphrine (10-6 M ) suivi de SNP (10-10 à 10-7  M), (4) phényléphrine (10-9 à 10-5  M), (5) phényléphrine (10-9 à 10-5  M) en présence d’insuline (150 nM).

Cette technique comprend tout d’abord une électrophorèse de type SDS-PAGE, suivi d’un immunobuvardage. L'électrophorèse permet la séparation de molécules selon leur charge électrique. La variante de l'éléctrophorèse la plus répandue consiste à séparer les protéines en fonction de leur poids moléculaire. Les protéines sont dénaturées par du sodium-dodécyl sulfate (SDS), molécule très fortement chargée négativement. Les charges négatives du SDS noient complétement les charges propres de la protéines qui n'interviennent alors plus dans la migration. Donc, la migration dépend alors uniquement de la longueur de leur chaîne protéique. De son côté, l’immunobuvardage consiste à transférer les protéines du gel d’acrylamide sur une membrane (par exemple, de polydifluorure de vinylidène (PVDF)) où elles se fixent de façon non spécifique pour former une sorte d’empreinte. Par la suite, les protéines peuvent être identifiées spécifiquement par des colorants liés à des anticorps appropriés. Cette technique est à la fois relativement facile à mettre en oeuvre et très puissante, car elle permet la séparation de différentes molécules. De plus, elle permet de traiter simultanément plusieurs échantillons sur un même gel et donc de soumettre ces échantillons exactement aux mêmes conditions expérimentales pour des résultats et des comparaisons fiables.

L’expression de la protéine eNOS et la formation de protéines nitrotyrosinées ont été déterminées par immunobuvardage à partir d’échantillons provenant du muscle gastrocnémius et de l’aorte thoracique. Ainsi, une portion d’environ 200 mg de gastrocnemius ou l’aorte thoracique en entier a été broyée dans l’azote liquide à l’aide d’un mortier et d’un pilon, puis suspendu dans cinq volumes (soit environ 1 ml) de tampon de lyse pendant 1 heure à 4o C. La composition du tampon de lyse est la suivante: 50 mM de Tris-HCl (pH 7,5), 1 mM d’EDTA, 1 mM d’EGTA, 10% de glycerol, 1 mM de DTT, 50 mM de NaF, 5 mM de pyrophosphate de sodium, 1% de Triton X-100, 0,1 mg/ml de PMSF et un cocktail d’inhibiteurs de protéases (pepstatine A : 1 mM, E64 : 10 mM et leupeptine : 1 mM) (P-8340, Sigma). Les homogénats sont centrifugés à 10 000 x  g pendant 10 minutes à 4°C afin de ne conserver que le surnageant. La concentration en protéines du surnageant a ensuite été dosée à l’aide de la méthode à l’acide bicinchoninique (BCA) de Pierce avec le BSA comme standard.

Pour les homogénats de muscles gastrocnémius, 2 mg de protéines de chacun des échantillons ont été mis en présence de 5 mg de billes de résine 2’5’-ADP-Sépharose afin de purifier l’enzyme eNOS [107]. Le tout a été incubé pendant 2 heures à 4°C. Ensuite la solution est centrifugée afin de récupérer les billes. Celles-ci sont ensuite lavées 3 fois dans une solution de PBS, dont la deuxième solution de lavage était additionnée de 2% de Triton X-100. Avant de procéder à l’électrophorèse, chaque culot de billes a été mis en présence de 30 µl de tampon Laemmli, bouilli 10 minutes, afin de détacher les protéines des billes, puis centrifugé à 10 000 RPM durant 1 minute. Pour les lysats d’aortes thoraciques, 45 μ g de chaque échantillon a été mis en présence d’environ 8 μ l de tampon Laemmli sans utiliser les billes. Ces échantillons ont ensuite été bouillis 10 minutes et centrifugés à 10 000 RPM durant 1 minute. Les surnageants ont alors subi une électrophorèse dans des gels de SDS-polyacrylamide (SDS-PAGE). Pour la détermination de l’expression de la protéine eNOS provenant du gastrocnemius, la concentration du gel d’entassement était de 5%, et celle du gel de séparation était de 6%. Pour la détermination de l’expression de eNOS et des protéines nitrotyrosinées dans l’aorte thoracique, la concentration du gel de séparation a été portée à 10%. Ce changement a été introduit afin de faciliter la migration de la protéine α -Tubulline, dont le résultat de l’expression permet de standardiser l’analyse des immunobuvardages. Les électrophorèses se sont déroulées à la température ambiante et le tampon était constitué de glycine : 0,2 M, Tris base : 25 mM et SDS : 3,5 mM. Subséquemment, les protéines ont été transférées (100 V, 2 heures, 4o C) sur des membranes de polyvinylidene difluoride filter (PVDF) dans un tampon de transfert constitué de glycine : 192 mM, Tris base : 25 mM et méthanol histologique : 20%. La membrane de PVDF a été incubée une heure à la température de la pièce dans une solution de lavage (50 mM de Tris-HCl [pH=7.5], 150 mM de NaCl, 0.04% d’Igepal et 0.02 % de Tween-20) additionnée de lait écrémé en poudre (5%). Les membranes ont ensuite été incubées avec l’anticorps primaire spécifique à eNOS, (dilué 1 : 500 dans une solution de BSA à 1% dans l’eau distillée) ou aux protéines nitrotyrosinées (dilué 1 : 500 dans une solution de BSA à 1% dans de l’eau distillée) à 4o C durant toute la nuit. À noter que la concentration de l’anticorps primaire spécifique à l’α -Tubulline était de 1 : 5000. Le lendemain, les membranes ont subi une série de trois lavages d’une durée de 15 minutes chacun, avec le tampon de lavage. Les membranes ont ensuite été incubées pendant une heure avec l’anticorps secondaire immunoglobuline G anti-souris couplé à une peroxydase, dilué 1 :10 000 (pour l’α -Tubulline, la dilution était aussi de 1 :10 000) dans la solution de lavage contenant 5% de lait écrémé. Ensuite, les membranes ont été lavées à nouveau durant 45 minutes, puis les bandes immunoréactives ont été détectées par chémiluminescence. L’autoradiographie a été analysée à l’aide d’un scanner de type «Agfa scanner» et quantifiée avec un logiciel de traitement d’image (NIH Image).

La microscopie de type confocale est l’une des découvertes les plus importantes de ce siècle en microscopie optique. Elle relie différentes technologies dont les lasers, des éléments d’optiques, des dispositifs de balayage rapide et des ordinateurs traitant les images numériques. Le tout a permis aux utilisateurs d’analyser l’intérieur des objets microscopiques et de les visualiser en trois dimensions. Contrairement à la microscopie à fluorescence conventionnelle, la microscopie confocale permet d’effectuer des coupes optiques virtuelles dans l’objet observé et de n’enregistrer que l’image de la fluorescence émise dans le plan. Cela est possible grâce au diaphragme variable qui élimine le signal fluorescent provenant des autres plans. De plus, contrairement à la microscopie conventionnelle, la microscopie confocale permet la localisation in situ d’une ou de plusieurs sondes fluorescentes dans les cellules, et ce surtout dans des coupes épaisses de tissus. Ainsi, il est possible de localiser la protéine eNOS dans les cellules endothéliales de l’aorte thoracique de nos quatre modèles animaux par microscopie confocale.

Tout d’abord, des segments frais d’aorte thoracique ont rapidement été dégagés des tissus conjonctifs et graisseux, puis entourés de milieu d’enrobage pour la coupe de tissus (OCT) et congelés à –80o C jusqu’au moment de la coupe. Des coupes transversales de 7 μ m d’épaisseur ont été préparées au Microtome Cryostat, puis montées sur des lames de verre. Les tissus ont ensuite été fixés dans l’acétone-méthanol (7:3) à –20°C pendant 15 minutes, puis séchés sur une plaque chauffante pendant environ 30 minutes. Par la suite, les lames sont conservées à –20o C. Les lames ont ensuite été lavées dans du PBS-triton (0,2%) pendant 5 minutes à la température de la pièce, puis 3 fois durant 5 minutes avec une solution de PBS. Par la suite, les lames ont été plongées dans une solution de blocage (PBS-sérum de bovin fétal (FBS) (10%)) durant 45 minutes toujours à la température de la pièce et à l’abris de la lumière. La solution de blocage a alors été retirée et les coupes ont été incubées avec l’anticorps primaire spécifique à la protéine eNOS couplé avec «Alexa Fluor 594 GF» (dilué 1 : 200 dans la solution de blocage) en présence de phalloïdine «Alexa Fluor 488 » (1 : 150) à 4o C, à l’abris de la lumière durant toute la nuit. La phalloïdine possède une grande affinité pour la F-actine. Ensuite, la solution d’anticorps primaire a été retirée et un lavage durant 5 minutes avec une solution de PBS-triton (0,2%) suivi de 3 lavages de 5 minutes avec une solution de PBS ont été effectués. Ensuite, les coupes d’aorte thoracique ont été incubées avec l’anticorps secondaire approprié (dilué 1 : 1000 dans la solution de blocage) durant une heure dans la chambre humide à l’abris de la lumière. Suite à cela, la solution d’anticorps secondaire a été retirée et 3 lavages durant 5 minutes avec une solution de PBS suivi d’un lavage de 5 minutes avec de l’eau distillée ont été effectués. Finalement, les coupes d’aortes ont été recouvertes de milieu de montage (tampon glycine 0,2 M, pH=8,6) et d’une lamelle. Un contrôle négatif sans anticorps primaire et un test d’autofluorescence sans anticorps secondaire ont aussi été effectués. Les lames ainsi préparées ont brièvement été entreposées à 4o C jusqu’à l’observation. La fluorescence est observée à l’aide d’un microscope confocale (BioRad LSCM 1024). La comparaison des niveaux de fluorescence entre les groupes a été effectuée en utilisant les mêmes conditions d’exposition au laser et la quantification a été effectuée en utilisant le logiciel Metaphore (Universal Imaging Corporation).

La mesure des concentrations d’endothéline-1 immunoréactive (ir-ET-1) a été déterminée dans des lits mésentériques de rats à jeun provenant de nos 4 groupes expérimentaux. Les lits mésentériques ont été homogénéisés deux fois pendant 15 secondes dans 2 ml d’une solution d’extraction (1 M de HCl, 1% d’acide acétique, 1% de TFA et 1% de NaCl) [31, 132]. Les homogénats ont été centrifugés à 3000 x g à 4° C. Les surnageants ont été récoltés et 100 μ l de [125 I]ET-1 (près de 1000 cpm) ont été ajoutés avant l’extraction sur une colonne C18 Sep-Pak, préalablement activée avec 4 ml d’acétronitrile (60%) et de TFA (0,1%), puis rincée deux fois avec du TFA (10%). Par la suite, les échantillons ont été introduits dans la colonne et cette dernière a été rincée deux fois avec 10 ml de TFA (10%). La fraction d’ir-ET-1 a été récoltée par élution avec 3 ml d’acétonitrile 60% et TFA 0,1%, puis comptée à l’aide d’un compteur gamma (5-10% de perte). Ensuite, les extraits d’échantillons ont été séchés à l’aide d’un «Speed-Vac» et reconstitués dans 500 μ l de tampon de RIA. Des volumes de 100 μ l et 200 μ l des extraits d’échantillons ou 200 μ l de standard ont été ajoutés à 100 μ l d’anticorps anti-ET-1, et le volume final a été ajusté à 300 μ l avec du tampon RIA. Après 24 heures d’incubation à 4° C, 100 μ l de [125 I]ET-1 (15000 cpm) dans du tampon à RIA ont été ajoutés et les tubes ont été incubés 24 heures de plus à 4° C. La radioactivité libre et liée a été séparée à l’aide d’un second anticorps. Après 2 heures d’incubation à la température de la pièce, 0,5 ml de tampon RIA a été ajouté et les tubes ont été centrifugés à 2500 x g pour 20 minutes à 4° C. Les surnageants ont été écartés et les culots ont été comptés dans un compteur gamma. La concentration d’ir-ET-1 a été corrigée pour les pertes lors de l’extraction.

Deux semaines après le début des régimes et traitements, les animaux ont subi une première intervention chirurgicale, laquelle consistait à installer de façon chronique des sondes Doppler autour de trois artères spécifiques pour permettre l’enregistrement de débits sanguins régionaux. Ainsi, des sondes miniatures pulsatiles Doppler ont été installées autour de l’artère rénale gauche, de l’artère mésentérique supérieure et de l’aorte abdominale. Ces trois artères ont été choisies car le moindre changement hémodynamique se produisant au niveau de l’un de ces trois lits vasculaires, exerce une influence majeure sur le débit cardiaque. Cette technique de mesure est couramment utilisée dans le laboratoire du Dre Bachelard et a été décrite en détail dans l’article de Pître et ses collaborateurs [133]. Brièvement, avant la chirurgie, les animaux recevaient une injection sous-cutanée (s.c.) de buprénorphine (0,05 mg/kg) et de saline (10 ml). Par la suite, les animaux ont été anesthésiés (pentobarbital sodique, 75 mg/kg, i.p., avec doses additionnelles si nécessaire). Une laparotomie a été pratiquée, puis, sous un stéréomicroscope, l’artère mésentérique supérieure, l’artère rénale gauche et l’aorte abdominale ont soigneusement été dégagées des tissus conjonctifs environnants. Des sondes Doppler ont été installées autour de ces trois artères et leurs fils conducteurs ont ensuite été passés sous la peau du dos au moyen d’une tige métallique, puis extériorisés dans la région dorsale du cou et suturés sur place. Les viscères ont alors été replacées dans la cavité abdominale et hydratées avec de la saline physiologique stérile. L’incision de la paroi abdominale a été refermée avec du fil résorbable et la peau cousue avec du fil de coton stérile. En traitement post-opératoire, les animaux recevaient une injection biquoditienne de buprénorphine (0,05 mg/kg, s.c., pendant 5 jours) et de la saline (10 ml jusqu’à la récupération du poids corporel).

La technique de mesure que nous avons utilisée ce base sur le principe de Doppler selon lequel, un son réfléchi à partir d'une particule en mouvement (en l’occurrence les globules rouges), aura une fréquence légèrement différente de celle à laquelle il a été émis. Cette différence de fréquence dépend de la vitesse des particules en mouvement. Le système de détection Doppler s’effectue à partir d’un cristal piezoélectrique (lequel constitue la sonde ultrasonique) qui pendant un court laps de temps émet un signal ultrasonique de 20 mHz. Après émission du pulse ultrasonique, le cristal devient alors muet et est maintenant prêt à capter l’écho du signal ultrasonique qui est réfléchi par les globules rouges. La différence de fréquence entre le signal transmis et le signal capté est alors analysé, puis intégré. Cette différence est directement proportionnelle à la vitesse de la particule en mouvement, tel que démontré par l'équation Doppler :

Équation de Doppler : Df = (2*FoVCosθ)/C

Où     Df : différence de fréquence entre le signal émis et capté

Fo : fréquence du signal émis

V : vitesse de la particule

θ : angle entre le cristal et le vaisseau sanguin (45o )

C : vitesse du son dans le fluide

Étant donné que Fo, C et θ sont des constantes , la différence (Df) est donc directement proportionnelle à la vitesse de la particule en mouvement (V) [134]. Les signaux transmis par les sondes fournissent un estimé de la vitesse à laquelle le sang circule, plutôt que du débit sanguin [134]. Par contre, l'implantation chronique de la sonde permet au tissu conjonctif de se développer autour de l’implant, "fixant" ainsi le vaisseau sanguin à l'intérieur de la sonde [135]. Dans ces conditions, une relation linéaire a été démontrée entre le signal transmis par une sonde Doppler («Doppler shift») et celui transmis par une sonde électromagnétique, laquelle enregistre directement le débit sanguin. La mesure du «Doppler shift» devient alors un indice valable du débit sanguin. L’avantage de cette méthode est que les sondes sont miniaturisées, ce qui fait qu’elles n’interfèrent pas avec les fonctions des organes avoisinants. De plus, cette méthode est efficace, reproductible et elle permet des enregistrements continus des débits sanguins régionaux chez l’animal éveillé et non-immobilisé.

Environ 10 jours après l’installation des sondes Doppler, les rats ont été à nouveau anesthésiés (voir plus haut) et les fils conducteurs des 3 sondes ont été soudés à un microconnecteur et la qualité des signaux a été vérifiée sur un oscilloscope. Seul les animaux ayant des signaux acceptables ont subi une seconde intervention chirurgicale, laquelle consistait en l’installation chronique de cathéters intra-vasculaires. Ainsi, un premier cathéter a été introduit dans l'artère fémorale gauche pour nous permettre de mesurer les valeurs de pression artérielle, de fréquence cardiaque et aussi pour nous permettre d’effectuer des prélèvements sanguins pendant le clamp. Deux autres cathéters ont ensuite été introduits dans la veine jugulaire droite pour permettre les infusions intraveineuses (i.v.) d’insuline et de dextrose pendant le clamp. Les cathéters ont ensuite été passés sous la peau du dos au moyen d’une tige métallique puis extériorisés dans la région dorsale du cou avec les fils conducteurs des sondes Doppler. Le microconnecteur, soudé à ces derniers, a ensuite été fixé à un harnais porté par le rat. Les cathéters ont été passés dans un tube métallique flexible (ressort) fixé au harnais du rat. À la fin de cette deuxième étape chirurgicale, les animaux ont reçu les injections post-opératoires, tel que décrites précédemment, puis ont été placés sous observation jusqu'à leur réveil, et ont été retournés dans leur cage individuelle.

Le clamp a été réalisé tel que développé et couramment effectué dans le laboratoire du Dre Bachelard et décrit en détail dans Pître et ses collaborateurs [133]. Cette technique, développée à l’origine par DeFronzo et collaborateurs [136], nous permet de caractériser chez des individus ou des animaux éveillés et non-immobilisés la sensibilité à l’insuline, tout en maintenant un état euglycémique. Cette technique est hautement reproductible, et constitue la méthode par excellence pour déterminer la consommation corporelle totale du glucose, et indiquer la capacité de l’insuline à stimuler la captation du glucose par les tissus insulino-sensibles [137]. En résumé, le clamp euglycémique hyperinsulinémique consiste à infuser de façon continue et à dose fixe une solution d’insuline et ce pour toute la durée du clamp, soit environ 2 heures. Afin de maintenir l’état d’euglycémie, une solution de dextrose (ou de glucose) est infusée parallèlement à l’insuline et ce à vitesse variable, mais ajustée de façon à maintenir la glycémie à sa valeur initiale. La quantité de glucose infusée représente la consommation corporelle totale de glucose et constitue un indice de la sensibilité à l'insuline. Cette technique nous permet donc d’étudier in vivo les effets de l’insuline tout en évitant de les confondre avec les changements provoqués par une hypoglycémie. De plus, dans notre projet de recherche nous avons non seulement déterminé la sensibilité à l’insuline, mais aussi effectué chez ce même animal des enregistrements simultanés de pression artérielle, fréquence cardiaque et de débits sanguins régionaux, grâce aux sondes Doppler et au cathéter artériel que nous avons préalablement installés.

Chacune des clamps euglycémiques hyperinsulinémiques a été effectué chez l’animal à jeun (12-14 heures), éveillé et non immobilisé. Des échantillons de sang (0,3 ml) ont alors été prélevés sur chacun des rats (via le cathéter artériel) aux temps –20 et 0 minutes, afin de déterminer les concentrations plasmatiques basales de glucose et d’insuline. Les échantillons sanguins ont été centrifugés et les plasma récupérés. Les globules rouges ont ensuite été resuspendus dans environ 0,15 ml de solution saline 0,9% (équivalent au volume de plasma prélevé), puis immédiatement retournés à l'animal. Les enregistrements continus de fréquence cardiaque, de pression artérielle et de débits sanguins régionaux ont débuté 30 minutes avant le début des clamps et ce pour toute la durée de l'expérience. Le clamp a débuté par l’infusion i.v. d’une solution d’insuline à concentration et vitesse constante (4 mU kg-1  min-1 et vitesse d’infusion de 1,2 ml/heure) pendant 2 heures. Cinq minutes après le début de l’infusion d’insuline, une solution de dextrose (30% p/v) a été infusée simultanément à vitesse variable, mais ajustée de façon à maintenir la glycémie initiale, selon les fréquentes déterminations de glucose sanguin effectuées sur des échantillons de sang artériel prélevés aux 10 minutes. Des échantillons sanguins de 0,3 ml ont aussi été prélevés aux 20 min tout de suite après le début de la clamp pour permettre le dosage enzymatique de l’insuline et du glucose plasmatiques. Chaque échantillon de sang prélevé a été reconstitué et immédiatement retourné à l’animal, tel que décrit plus haut. La quantité totale de glucose infusé durant la dernière heure du clamp, période pendant laquelle la concentration d'insuline a atteint un plateau et que le taux d’infusion de glucose est égal à son taux d’utilisation par les cellules, a été utilisée comme un indice de la sensibilité à l'insuline.

Des expériences contrôles ont aussi été effectuées, durant lesquelles les infusions d’insuline et de dextrose ont été remplacées par des infusions de saline-BSA 0,2% à des vitesses d’infusion équivalentes à celles utilisées pour l’insuline et le dextrose. Au cours de ces expériences contrôles, les différents paramètres cardiovasculaires ont été mesurés en continu, la glycémie a été déterminée à chaque 10 minutes et des échantillons sanguins de 0,3 ml ont été prélevés à toutes les 20 minutes et traités de la même manière qu’au cours des clamps euglycémiques/hyperinsulinémiques.

© Mylene Badeau, 2006