Collection Mémoires et thèses électroniques
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Chapitre 1. Introduction générale

Table des matières

Les infections aiguës des voies respiratoires sont l’une des causes majeures de morbidité et de mortalité à travers le monde et plusieurs virus ont été identifiés comme étant des agents étiologiques responsables de ces infections. Parmi ceux-ci, on retrouve principalement des virus à ARN de la famille desParamyxoviridae, qui comprend deux sous-familles : lesParamyxovirinae(contenant les virus parainfluenza [PIV]) ainsi que lesPneumovirinae(dont le virus respiratoire syncytial [VRS]). D’autres virus, tels que les virus influenza(Orthomyxoviridae), adénovirus (Adenoviridae), rhinovirus (Picornaviridae) et coronavirus (Coronaviridae), sont aussi considérés comme d’importants pathogènes respiratoires pouvant causer une variété de symptômes allant du simple rhume à une pneumonie sévère. Jusqu’à ce jour, plusieurs cas de pneumonies acquises dans la communauté chez l’adulte et des cas de bronchiolites et de pneumonies chez les patients pédiatriques demeurent cependant sans agents étiologiques connus [72, 324]. Or, depuis quelques années, ce nombre tend à diminuer puisque de nouveaux virus respiratoires ne cessent d’être découverts [84, 111, 179, 211, 390].

Le métapneumovirus humain (hMPV) est un nouveau virus respiratoire qui a été identifié pour la première fois par un groupe hollandais en 2001 [387]. L’équipe du Dr Osterhaus a découvert ce pathogène encore inconnu de tous à partir d’aspirations nasopharyngées prélevées chez 28 jeunes enfants présentant divers symptômes respiratoires allant d’une simple infection des voies respiratoires supérieures à de sévères bronchiolites et pneumonies [387]. Par la suite, l’équipe du Dr Guy Boivin a été la première en Amérique du Nord à identifier la présence de ce virus et à en décrire les manifestations cliniques et les caractéristiques virologiques [32]. Bien que le hMPV ait été isolé depuis 1993 au Laboratoire de virologie régional du CHUQ-CHUL (Québec, Québec, Canada), il a fallu attendre jusqu’en 2001 pour confirmer l’existence de ce pathogène viral. Depuis ce temps, plusieurs autres groupes de recherche à travers le monde ont rapporté la présence du hMPV.

Suite aux analyses morphologique, biochimique et génétique des particules virales du hMPV, ce dernier a préliminairement été classé dans l’ordre desMononegavirales(virus à ARN négatif non segmenté), famille desParamyxoviridae, sous-famille desPneumovirinaeet au genreMetapneumovirus(figure 1).

Les membres de la famille desParamyxoviridaepossèdent tous les caractéristiques suivantes : a) leur génome est constitué d’un simple brin d’ARN négatif retrouvé exclusivement à l’intérieur d’une nucléocapside résistante aux ARNses qui comprend la polymérase virale; b) le génome est transcrit selon des événements séquentiels d’arrêt-recommencement où la polymérase est guidée par des éléments «cis-acting» et produit des ARNm subgénomiques; c) le cycle de réplication viral s’effectue dans le cytoplasme de la cellule infectée; d) les nouveaux virions formés acquièrent une enveloppe lipidique en bourgeonnant à la membrane plasmique; et e) ils entrent à l’intérieur de la cellule hôte par fusion [53]. Dans la sous-famille desPneumovirinaese retrouvent le genrePneumovirusqui contient le virus respiratoire syncytial (VRS), un important virus resporatoire chez les jeunes enfants, et le genreMetapneumovirusqui contient le hMPV. Ce dernier est le seul pathogène humain retrouvé dans le genreMetapneumovirus, puisque l’autre représentant, le métapneumovirus aviaire (APV), infecte seulement les dindes et les poulets.

Le génome du hMPV est composé d’un simple brin d’ARN négatif non segmenté et enveloppé. Les principales caractéristiques génomiques séparant les deux genres de la sous-famille desPneumovirinaesont la longueur totale du génome ainsi que l’organisation et la présence de gènes particuliers. Effectivement, les génomes desPneumovirus(VRS) sont d’une longueur d’environ 15 200 bases (b), alors que ceux desMetapneumovirus(hMPV et APV) sont plutôt de 13 300 b. De plus, la longueur du génome du hMPV varie selon les souches. Par exemple, le génome de la souche CAN 97-83 (numéro d’accession sur GenBank : AY297749) est de 13 335 b, celui de la souche CAN 98-75 (GenBank : AY297748) est de 13 280 b et, finalement, celui de la souche 00-1 décrite par le groupe hollandais (GenBank : AF371337) fait 13 378 b. Cette variation est principalement observée au niveau des protéines G et SH et dans les régions intergéniques.

L’analyse des cadres de lecture ouverts présents dans le génome du hMPV démontre l’existence de huit gènes codant pour neuf protéines différentes : la nucléoprotéine (N), la phosphoprotéine (P), la protéine (M) de la matrice, la protéine (F) de fusion, un facteur d’élongation de la transcription (M2-1), un facteur de régulation de la synthèse d’ARN (M2-2), la petite protéine de surface (SH) hydrophobe, la glycoprotéine majeure (G) d’attachement et finalement la sous-unité majeure (L) de la polymérase. Ces dernières sont arrangées selon l’ordre 3’-N-P-M-F-M2-SH-G-L-5’, comme l’APV [26, 386]. Cependant, il existe deux différences majeures entre les génomes du hMPV et du VRS : l’organisation des gènes est différente et le hMPV ne contient pas les deux gènes codant pour les protéines non structurales NS1 et NS2 (figure 3) [436].

Des études phylogénétiques ont démontré que, parmi les membres de la sous-famille desPneumovirinae, le hMPV s’apparente plus fortement à l’APV du génotype C (APV-C) qu’aux autres virus (figure 4) [131, 180, 439]. Effectivement, la séquence des gènes N, P, M et F démontre que l’homologie en acides aminés entre le hMPV et le APV-C varie de 66 à 89 %, alors qu’elle varie de 23 à 43 % avec le VRS [18, 387]. Bien que le hMPV et l’APV soient apparentés, le hMPV ne peut généralement pas infecter les dindes alors que le APV ne peut infecter les humains [387].

L’analyse de plusieurs isolats de hMPV démontre que les souches peuvent être classées selon deux génotypes distincts (A et B), tout comme le VRS [18, 26, 32, 295, 387]. L’alignement complet des génomes indique que les deux groupes sont identiques à 80 % en nucléotides et à 90 % en acides aminés (tableau 1) [26]. La variabilité entre ces derniers se retrouve principalement dans les gènes SH et G [26, 177, 294, 386, 388], alors que les gènes N, P, M et F sont beaucoup plus conservés [18, 26]. Effectivement, les protéines SH et G des deux génotypes ne sont similaires qu’à 59 et 37 % respectivement, alors que les autres le sont à 94,1-97,6 %. Le VRS démontre aussi une très grande variabilité au niveau des protéines SH et G (72 et 55% d’identité en acides aminés entre les deux groupes) [53, 189]. Chez ce dernier virus, les génotypes A et B correspondent aussi à deux groupes antigéniques différents [52]. Une étude effectuée chez le hMPV a révélé que les deux génotypes pourraient correspondre aussi à deux groupes antigéniques distincts, puisque des essais de neutralisation à partir de sérums de furets montrent une différence de neutralisation entre les deux génotypes [388]. Cependant, suite à un essai de neutralisation et d’infection chez le hamster, un autre groupe de recherche a affirmé le contraire et stipule qu’il y aurait seulement un groupe antigénique [351]. Finalement, d’autres études sont nécessaires afin de confirmer si les deux génotypes du hMPV correspondent aussi à deux groupes antigéniques.

Chacun des génotypes du hMPV se sépare en deux sous-groupes distincts : A1 et A2 ainsi que B1 et B2 (figure 5) [35, 177, 294, 388]. Suite à l’analyse phylogénétique de plusieurs souches, deux équipes de recherche ont récemment identifié la présence potentielle de nouveaux sous-groupes de hMPV (figure 5). L’une démontre que le sous-groupe A1 se divise en deux autres, soit A1a et A1b [17], alors que l’autre suggère que le sous-groupe A2 se sépare en A2a et A2b [175]. Encore plusieurs analyses génétiques et phylogéniques restent à être effectuées sur plusieurs années afin de bien classifier les différentes souches du hMPV.

Le génome du hMPV est composé de huit cadres de lecture ouverts codant potentiellement pour neuf protéines différentes (figure 6).

Les particules virales du hMPV comportent une enveloppe qui est composée de trois protéines transmembranaires : la protéine de fusion (F), la glycoprotéine d’attachement (G) et la petite protéine hydrophobe (SH).

Le gène F du hMPV code pour une protéine transmembranaire de 539 acides aminés. Le rôle de la protéine F chez lesparamyxovirusest de favoriser la fusion de l’enveloppe virale avec la membrane de la cellule hôte afin que le virus puisse pénétrer à l’intérieur et se répliquer [53]. Malgré le bas pourcentage d’identité entre la protéine F du hMPV et celle des autres paramyxovirus, cette dernière contient plusieurs motifs propres à ce type de protéine [258].

Tout d’abord, cette glycoprotéine comprend trois sites de glycosylation liés à N [386]. Parmi ces trois sites, deux sont aussi retrouvés chez le APV [386], alors qu’aucun ne l’est chez le VRS [35, 187, 386]. Le troisième site est donc unique au hMPV [35]. Comme les autres membres des paramyxovirus [53], la protéine F du hMPV montre une distribution particulière de nombreux résidus cystéines [35, 386]. Parmi les 14 retrouvés chez ce virus, 8 sont conservés à travers l’ensemble des membres de cette famille [386].

Bien que la protéine F soit retrouvée à la surface des particules virales, sa séquence en acides aminés est très conservée à travers les génotypes du hMPV [18, 26, 35, 121]. Afin de conserver pleinement sa fonction de fusion, cette protéine ne peut subir d’importantes mutations. La protéine de fusion des paramyxovirus est synthétisée en un précurseur F0 qui est clivé dans le trans-golgi par des protéases cellulaires afin de former un hétérodimère F2-F1 lié par des ponts disulfures (figure 7) [53]. Chez le VRS, les deux sites de clivage sont généralement composés des acides aminés R-X-R/K-R, motif reconnu par les furines cellulaires [53], alors que celui du hMPV est composé des résidus RQSR [35, 386]. Les deux arginines (R) sont aussi retrouvées chez le APV (RRRR) et le VRS, alors que les résidus glutamine (G) et sérine (S) sont retrouvés chez d’autres paramyxovirus, tels que les virus parainfluenza type 1 (PIV-1), le virus Sendai et lesmorbillivirus.

Comme pour certains paramyxovirus [168], l'ajout de protéase extracellulaire de type trypsine favorise l'infection par le hMPVin vitro[27, 351, 387]. Cependant, la séquence en acides aminés du site de clivage aurait un rôle à jouer sur la dépendance de l’ajout de trypsine [25, 331, 387]. Les souches dépendantes de la trypsine possèdent le site de clivage RQSR [387], alors que qu’une substitution de la sérine (S) pour une proline (P) (site de clivage : RQPR) rend les souches indépendantes de la trypsine [331]. Les différentes souches de hMPV peuvent aussi présenter une susceptibilité variable à l’ajout de trypsine pour croître en culture cellulaire selon leur séquence : RQSR > RQPR > RKAR > RRRR, où le RQSR correspond à la séquence du site de clivage le plus dépendant de l’ajout de trypsine extra-cellulaire [25].

Le clivage du précurseur F0 est nécessaire afin que la protéine effectue sa fonction de fusion. Suite à la formation des fragments F2 et F1, le peptide de fusion adjacent au site de clivage devient alors accessible et constitue alors l’extrémité N-terminale du segment F1 (figure 7) [53, 258]. Ce peptide est suffisamment hydrophobe pour agir comme un domaine d’ancrage transmembranaire [288] et serait directement impliqué dans l’insertion de la protéine F à la membrane cellulaire [53]. Deux motifs particuliers sur le fragment F1 sont nécessaires à la fusion virale des paramyxovirus [41, 48, 216, 325] et se retrouvent aussi chez le hMPV [386]. Lesheptad repeatsA (HRA) etheptad repeatsB (HRB) (figure 7) sont des motifs composés d’une répétition de sept acides aminés chargés(a-b-c-d-e-f-g), à l’exception des positionsaetdoù se trouvent des acides aminés hydrophobes [386]. Ces régions ont la capacité d’interagir ensemble afin de former une hélice appeléecoiled coilà l’intérieur d’une même protéine ou même entre plusieurs protéines (figure 8) [163]. Afin d’effectuer sa fonction de fusion, la protéine F doit subir plusieurs changements de conformation [163]. Il a été démontré que les paramyxovirus possèdent une protéine de fusion de classe 1 formant des trimères, tout comme celle des rétrovirus, des coronavirus, des virus ébola et de l’hémagglutinine (HA) des virus influenza [59, 87, 89, 182]. Il est donc suggéré que trois HRA de même que trois HRB interagiraient ensemble afin de former uncoiled coilet un complexe à six hélices assurant une grande stabilité à la protéine [88, 195].

Finalement, la protéine F a été identifiée comme étant l’antigène immunogène majeur impliqué dans la protection contre l’infection par le hMPV. Effectivement, un groupe de recherche a démontré que des hamsters ayant reçu le virus PIV-1 recombinant exprimant la protéine F du hMPV en surface étaient complètement protégés contre l’infection virale, alors que ceux n’ayant reçu que la protéine G ou SH ne l’étaient pas [350]. Une autre étude a aussi révélé que des hamsters vaccinés avec un virus recombinant de PIV-3 humain/bovin exprimant la protéine F du hMPV avaient développé une très forte réponse en anticorps neutralisants et étaient protégés contre l’infection virale [367]. Contrairement au VRS où les deux protéines de surface F et G sont les antigènes protecteurs majeurs [277, 336, 337], la protéine F semble être la seule protéine immunogène chez le hMPV [28, 350].

Le gène G du hMPV code pour une glycoprotéine de 236 acides aminés. Celle-ci a été identifiée comme étant la protéine d’attachement chez le VRS, puisque les anticorps spécifiques à la protéine G bloquaient l’attachement des particules virales aux cellules, alors que les anticorps spécifiques à la protéine F prévenaient la fusion et non l’attachement [222, 403]. La structure de la protéine G desPneumovirinaeest très différente de la protéine d’attachement desParamyxovirinae, car elle ne possède pas les activités de neuraminidase et d’hémagglutinine.

L’analyse du profil d'hydrophobicité de la protéine G du hMPV révèle qu'il s'agirait d'une glycoprotéine transmembranaire de type II, similaire à celle desPneumovirinae[386]. L'extrémité N-terminale hydrophile et cytoplasmique est suivie d'un petit domaine transmembranaire hautement hydrophobe, puis d’un grand fragment hydrophile extracellulaire, constituant l’extrémité C-terminale [17, 386, 388]. La glycoprotéine G est la plus variable du hMPV [17, 177, 294, 388]. Puisqu’elles sont souvent soumises à de fortes pressions immunologiques, certaines protéines de surface des pathogènes sont appelées à muter afin d’éviter la réponse du système immunitaire. De plus, l’analyse des séquences du hMPV démontre une utilisation variable du codon stop, résultant en la traduction de protéines de différentes longueurs, pouvant être plus courtes que la protéine originale de 236 acides aminés [17, 177, 294, 388].

La principale caractéristique de cette protéine est la présence de nombreux sites de glycosylation. La protéine G du hMPV contient cinq sites potentiels de glycosylation liés à N, alors que le VRS et le APV en ont respectivement quatre et de trois à cinq [177, 386, 410]. De plus, cette protéine contient un très grand nombre de résidus sérine et thréonine (34 %) qui sont des sites potentiels de glycosylation liés à O. Tout comme le VRS et le APV, la partie extracellulaire de la protéine G contient un nombre inhabituellement élevé de résidus proline (8 %) [17, 294, 386] qui sont des déterminants majeurs de la structure tridimensionnelle des protéines [410]. Cette composition particulière en acides aminés ainsi que la présence de nombreux sites potentiels de glycosylation liés à O sont des caractéristiques propres aux glycoprotéines d’origine muqueuse et suggèrent que la protéine G du hMPV aurait une structure de type mucine hautement glycosylée [184, 411].

Bien que cette protéine de surface semble être impliquée dans l'attachement du virus à la cellule cible, celle-ci ne semble pas être essentielle pour l’assemblage des particules virales ou pour la croissance du hMPVin vitroetin vivo. Un groupe de recherche a démontré que les virus recombinants du hMPV où le gène G avait été enlevé se répliquaient aussi efficacement que le virus sauvage en culture cellulaire, et seulement 40 fois moins dans le modèlein vivodu hamster [28]. Ces observations suggèrent que le hMPV, tout comme le VRS [201], utiliserait aussi d’autres mécanismes afin de s’attacher aux cellules hôtes. Aucun récepteur cellulaire n’a encore été étudié chez le hMPV. Toutefois, chez le VRS, il a été décrit que l’interaction entre la protéine G et les glycosaminoglycans (GAGs) est essentielle à l’attachement de la particule virale à la membrane cellulaire [242]. De plus, l’interaction de cette protéine avec le récepteur CX3CR1 faciliterait l’infection et aurait un rôle crucial à jouer dans la sévérité de la pathogenèse associée à l’infection virale [9, 377]. De récentes études ont aussi proposé que la protéine G pourrait interagir avec la L-sélectine et l’annexine II [238]. L’utilisation de ces composés ou d’antagonistes inhibent l’infection par le VRSin vitroetin vivoet ces résultats suggèrent que la L-sélectine et l’annexine II pourraient être des récepteurs du VRS sur les leucocytes et les cellules épithéliales. Finalement, des évidences ont démontré que la protéine G n’est pas impliquée dans la protection contre le hMPV et que cette dernière n’induit seulement qu’une très faible réponse immune [28].

Le gène SH du hMPV code pour une petite protéine de 183 acides aminés. Son rôle exact au sein de la particule virale n’est pas connu et ne l’est d’ailleurs toujours pas pour le VRS.

L’analyse du profil d'hydrophobicité de la protéine SH du hMPV révèle qu'il s'agirait d'une protéine transmembranaire de type II [386]. La partie N-terminale hydrophile se situerait dans le cytoplasme de la particule virale, alors que l’autre partie hydrophile retrouvée en C-terminale après la région hydrophobe serait extracellulaire. Tout comme la protéine G du VRS, la glycoprotéine SH du hMPV est hautement variable [26, 386] et contient deux sites potentiels de glycosylation liés à N et un nombre très élevé de résidus sérine et thréonine (22 %) [386]. Ces caractéristiques sont semblables aux autres protéines SH desPneumovirinaeet démontrent que celle du hMPV leur est similaire [11, 56].

Comme chez le VRS, la protéine SH n’est pas essentielle pour la croissance du hMPVin vitroetin vivo[42, 370]. Effectivement, il a été démontré que les virus mutants ne possédant pas le gène SH se répliquaient efficacement en culture cellulaire et même plus facilement que les virus sauvagesin vivodans les poumons de hamsters infectés [28]. Cependant, une délétion des gènes G et SH simultanée limite la réplication du virus mutant au niveau des voies respiratoires supérieures du hamster [28]. Finalement, malgré le fait que la protéine SH soit exprimée à la surface des particules virales, celle-ci est faiblement immunogène et n’induit pas la production d’anticorps neutralisants [350].

Afin de se répliquer, le hMPV utilise un réseau bien ordonné composé de quatre protéines virales : la nucléoprotéine (N), la phosphoprotéine (P), le facteur de transcription et de régulation M2 ainsi que l’unité majeure de la polymérase (L).

Lorsque le hMPV pénètre à l’intérieur de la cellule hôte, il s’ensuit de multiples événements afin de former de nouvelles particules virales et de propager l’infection (figure 9). Le cycle viral du hMPV et le rôle des protéines impliquées n’ont pas encore été étudiés, mais peuvent être suggérés à partir des mécanismes retrouvés chez le VRS et les autres pneumovirus.

La première étape du cycle viral consiste en l’attachement des particules à la surface de la cellule hôte via un récepteur toujours inconnu à ce jour. Chez le VRS, il a été démontré que l’interaction entre la protéine G et les glycosaminoglycans (GAGs) est essentielle à l’attachement de la particule virale à la membrane cellulaire [242]. Les GAGs sont composés de sous-unités de disaccharides répétées présentes dans la matrice extracellulaire [110, 146], et la protéine G semblerait s’attacher préférentiellement aux GAGs contenant des disaccharides héparane sulfate et chondroitine sulfate B.

Il est possible que l’interaction entre les GAGs et la protéine G ne soit que le premier événement d’attachement et que celui-ci soit suivi par d’autres étapes impliquant une ou plusieurs des trois protéines de surface. En ce sens, il a été rapporté que les virus mutants où les gènes G et SH ont été enlevés peuvent très bien se répliquerin vitro[24, 28]. Cela suggère que la protéine F pourrait être impliquée dans l’attachement et consisterait en un mécanisme alternatif ou en une seconde étape du processus. Une équipe de recherche a d’ailleurs déjà indiqué que la sous-unité F2 de la protéine F serait responsable de la spécificité de l’infection plutôt que la protéine G [334]. De plus, la protéine F a la capacité de se fixer à la protéine cellulaire RhoA [287] et il se pourrait que cette dernière agisse comme un récepteur de la protéine virale ou que l’interaction entre ces deux composés favorise l’activation de RhoA et, par conséquent, que la signalisation déclenchée facilite l’infection virale [132].

Suite à l’attachement, les particules du hMPV entreraient à l’intérieur de la cellule hôte par fusion, comme les autres paramyxovirus [53]. Cependant, la fusion cellulaire n’a pas été tellement caractérisée pour le hMPV. En se basant sur d’autres virus possédant des protéines similaires comme le virus de l’immunodéficience humaine (VIH), l’influenza et les autres paramyxovirus, il est possible d’en déduire un modèle de fusion [102, 122, 216, 244, 291, 325, 435]. La protéine F est au cœur de ce phénomène et doit subir plusieurs changements de conformation afin d’effectuer sa fonction.

Tout d’abord, la protéine F0 est assemblée en trimères et serait clivée soit à l’intérieur, soit à l’extérieur de la cellule. Cette forme clivée active de la protéine résulte en la formation de deux fragments F2 et F1 reliés ensemble par des ponts disulfures. Le peptide de fusion est alors accessible et peut donc s’insérer dans la membrane de la cellule hôte. Par la suite survient une interaction entre lesheptad repeatsde la protéine. La partie N-terminale du HRA est adjacente au peptide de fusion ancré dans la membrane cellulaire, alors que la partie C-terminale du HRB précède le domaine transmembranaire ancré dans la membrane virale. Les trimères de HRA et HRB interagissent ensemble afin de former un complexe à six hélices, permettant ainsi le rapprochement de ces deux structures (figure 10). Les membranes cellulaire et virale sont donc suffisamment rapprochées pour fusionner et alors créer l’espace (le pore) par lequel le virus pénètre dans la cellule.

Lorsque le virus pénètre à l’intérieur de la cellule, celui-ci libère sa nucléocapside dans le cytoplasme. L’ARN polymérase ARN dépendante peut alors initier la transcription du génome en des ARNm coiffés en 5’ et polyadénylés en 3’. Tout d’abord, avant de synthétiser les ARNm correspondant aux différents gènes, la polymérase virale doit obligatoirement transcrire la séquence «leader» en 3’ du génome [218]. Par la suite, celle-ci peut continuer la transcription de l’extrémité 3’ à l’extrémité 5’ sans se détacher. La polymérase virale transcrit les gènes de manière séquentielle selon des facteurs d’initiation et de terminaison présents dans chacune des régions intergéniques. Celles-ci sont composées de la séquence terminatrice du gène où se trouve une série de 4 à 7 uraciles responsables de la polyadénylation, d’une courte région intergénique non transcrite et d’un signal de commencement du gène comprenant la région de la coiffe et d’initiation de la synthèse d’ARNm. Lorsque la polymérase en cours de transcription rencontre la série d’uraciles dans la séquence terminatrice du gène, elle libère l’ARNm nouvellement synthétisé et progresse jusqu’à la rencontre d’une séquence de commencement d’un gène [218].

Parfois, la polymérase virale se détache des régions intergénique et est incapable d’initier la synthèse de l’ARNm du gène suivant. Cela occasionne donc un arrêt de la transcription des gènes se trouvant sur le reste du génome jusqu’à l’extrémité 5’. Par conséquent, la quantité d’ARNm de chacun des gènes décroît selon leur position dans le génome par rapport à l’extrémité 3’. Les gènes proximaux sont favorisés et plus fréquemment transcrits que les gènes se rapprochant de l’extrémité 5’ [57]. De plus, il a été démontré que la polymérase ne peut s’attacher à l’intérieur du génome. Cependant, celle-ci pourrait avancer et reculer sur le génome [108], ce qui expliquerait la transcription de gènes contenant des cadres de lecture ouverts chevauchants, comme le M2-2 chez le hMPV [386] et le gène L chevauchant le gène M2 chez le VRS [53]. Finalement, une fois que les ARNm ont été synthétisés, ils sont traduits en protéines en utilisant la machinerie cellulaire et ces dernières sont ensuite assemblées en de nouvelles particules virales.

La réplication du génome viral débute suite à la traduction des transcrits et à l’accumulation de protéines virales. Tout d’abord, le génome ARN (-) du hMPV se réplique par l’intermédiaire d’un antigénome (+), qui consiste en une copie d’ARN parfaitement complémentaire et de même longueur que le génome (-). Cet antigénome ne contient aucun cadre de lecture ouvert et aucune protéine ne semble être transcrite à partir de ce dernier [218]. Leur unique fonction serait de servir d’intermédiaire afin de refaire des copies du génome (-) qui seront au centre des particules virales nouvellement formées.

La même ARN polymérase ARN dépendante qui est impliquée dans la transcription et la synthèse des ARNm est responsable de la réplication. Il semblerait qu’au cours de la réplication, la polymérase virale ignorerait simplement les jonctions entre les gènes et synthétiserait une copie complémentaire et exacte du génome initial (-). La synthèse d’ARN génomique et antigénomique semble être dépendante de la quantité de protéines produite, puisque lorsque des cellules infectées sont traitées avec un inhibiteur de la synthèse de protéines, la transcription continue normalement, alors que la réplication du génome est cessée rapidement [173, 320]. Il est aussi suggéré que la balance de la transcription vers la réplication serait contrôlée par la concentration intracellulaire de la protéine M2-2 [22]. En début d’infection, la quantité de M2-2 est faible et on observe un haut taux de transcription, alors que plus la concentration de M2-2 augmente, plus la transcription est inhibée et la réplication favorisée [218].

Depuis le rapport initial des chercheurs hollandais [387], le hMPV a été identifié dans plusieurs pays à travers l’Amérique du Nord [19, 32, 33, 104, 107] et du Sud [207], l’Europe [115, 183, 236, 357, 387, 389, 397, 398], l’Asie [49, 91, 290, 316, 363, 423]et l’Australie[171, 271, 314]; (révisé en [149]). Le virus du hMPV a aussi été identifié en Afrique du Sud chez de jeunes enfants non immunocompromis et aussi ceux infectés par le VIH [233].

Malgré le fait que la plupart de ces études aient limité leur période de surveillance à la saison des infections respiratoires virales, une étude canadienne a démontré que la majorité des cultures cellulaires positives pour le hMPV (86,7 %) étaient retrouvées entre décembre et mai [32]. Effectivement, dans les pays au climat tempéré, les infections par le hMPV surviennent principalement en période hivernale/printanière [19, 316] et présentent une activité plus particulièrement importante sur une période d’environ 4 à 6 semaines au début du printemps [262]. Dans les climats subtropicaux, tels que celui de Hong Kong, l’activité virale du hMPV diffère légèrement et semble plus importante au printemps et dans les premiers mois de l’été [290]. L’analyse génétique effectuée à partir de plusieurs isolats cliniques a permis de démontrer que, malgré la prédominance d’un génotype en particulier au cours d’une saison de hMPV, différentes souches appartenant à d’autres groupes pouvaient circuler simultanément au sein d’une population [2, 229, 397].

Le mode de transmission de l’infection par le hMPV n’a toujours pas été décrit, mais pourrait s’apparenter à celui du VRS et se transmettre suite à un contact avec une personne infectée ou par la propagation de gouttelettes dans l’air. La période d’incubation du virus lors de la contraction de l’infection n’a pas non plus été définie clairement. Suite à la publication d’un seul rapport, il est estimé que celle-ci serait d’environ 4 à 6 jours [91].

Le hMPV cause principalement des infections aiguës des voies respiratoires à travers les différents groupes d’âge, mais plus particulièrement chez les jeunes enfants, les personnes âgées et les sujets immunosupprimés [32, 33, 45, 107, 151, 292, 389, 397].

Le hMPV est considéré comme l’un des pathogènes respiratoires majeurs chez le jeune enfant, après le VRS. Le hMPV est responsable de 12 à 15 % des cas de consultations pour des infections des voies respiratoires supérieures et inférieures chez les jeunes enfants non hospitalisés [416]. Ce virus est aussi associé à 5 à 10 % des cas d’hospitalisations pour des infections aiguës des voies respiratoires [33, 91, 113, 246, 316, 389]. Le diagnostic le plus rapporté chez le jeune enfant est la bronchiolite avec ou sans pneumonie [33, 113, 236, 290, 363, 397]. Plusieurs études ont aussi rapporté que cette infection virale était associée à des respirations sifflantes ainsi qu’à des exacerbations d’asthme [104, 113, 115, 183, 290].

Les principaux symptômes respiratoires observés lors de l’infection par le hMPV sont la rhinorrhée, la toux et la fièvre, alors que les symptômes non respiratoires, tels que la diarrhée, les vomissements et l’apparition d’érythème, sont plutôt rares [33, 104, 262, 389]. Le hMPV peut aussi causer des infections des voies respiratoires supérieures [416, 419]. Ce virus a d’ailleurs été retrouvé dans le nasopharynx de plusieurs enfants souffrant d’otites aiguës de l’oreille moyenne [33, 332].

Les manifestations cliniques observées lors des infections par le hMPV sont très similaires à celles du VRS [33, 115, 183, 397]. Les symptômes de fortes toux, de difficultés respiratoires prononcées et de respirations rapides et/ou sifflantes rendent le diagnostic impossible à effectuer entre les deux pathogènes. Quelques hypothèses contradictoires ont été émises quant au degré de sévérité de ces deux infections virales. Certains affirment que l’infection par le VRS serait plus sévère que celle par le hMPV, lorsque la proportion de patients avec hypoxémie, pneumonie ou admis aux soins intensifs est évaluée [33, 389, 397, 402]. D’autres, au contraire, affirment que le hMPV causerait des infections plus sévères que le VRS [259, 290] ou de sévérité comparable [262, 414]. L’évaluation de la gravité des symptômes causés par les infections avec les différents génotypes du hMPV résulte aussi en des conclusions contradictoires. Une étude suggère que le génotype A causerait des infections plus sévères [400] (ce qui serait en accord avec le fait que ce génotype semble mieux se répliquerin vivoque le génotype B [426]), alors qu’une autre stipule que la variabilité génétique n’entraîne pas de changement au niveau de la sévérité des symptômes [2]. D’autres études prospectives sont nécessaires afin de bien caractériser ces infections virales.

Finalement, les jeunes enfants aux prises avec des maladies sous-jacentes sont beaucoup plus susceptibles de contracter une infection sévère par le hMPV [246, 259, 382, 385]. Une étude réalisée en Amérique du Nord a démontré que 25 à 33 % des cas d’hospitalisations suite à une infection par le hMPV survenaient chez des enfants prématurés, immunosupprimés ou présentant des problèmes cardiorespiratoires [32, 104]. Malgré le fait que ces infections virales ne causent habituellement pas la mort, quelques cas fatals chez l’enfant ont été relatés dans la littérature [292, 333].

Chez l’adulte sain, le hMPV cause principalement des infections respiratoires bénignes avec des symptômes d’allure grippale. Ces infections virales ont été beaucoup moins étudiées chez l’adulte que chez l’enfant et les quelques rapports disponibles suggèrent que ce pathogène serait responsable d’environ 2 à 5 % des cas d’infections d’allure grippale [32, 107, 275]. Les jeunes adultes semblent moins susceptibles de développer une infection sévère par le hMPV et présentent des symptômes d’infection des voies respiratoires supérieures s’apparentant au rhume, alors que ceux plus âgés démontrent surtout des dyspnées associées à des respirations sifflantes [107, 357]. Les adultes aux prises avec des problèmes cardiorespiratoires sont aussi plus susceptibles de contracter l’infection virale et semblent être malades sur une plus longue période de temps.

Selon quelques études, le hMPV est l’agent étiologique d’environ 4-5 % des cas de pneumonies acquises dans la communauté et, selon d’autres, des cas d’exacerbations de maladie pulmonaire obstructive chronique (MPOC) [151, 275, 322, 399]. Comme chez les jeunes enfants, ce virus cause d’importantes exacerbations d’asthme chez l’adulte [415]. Finalement, ces infections virales sont habituellement sans gravité dans ce groupe d’âge, mais peuvent être associées à de sévères symptômes et même causer la mort chez les adultes à risques, tels que les transplantés d’organes [100, 275].

Les cas de co-infections avec le hMPV existent, mais ne sont pas fréquents [151, 259, 316, 385]. Quelques études ont tenté de démontrer si la co-infection du hMPV avec le VRS augmentait la sévérité des symptômes. Cette question demeure toujours sans réponse précise, puisque certains groupes de recherche ont démontré que, dans les cas de co-infections, les symptômes observés étaient plus sévères que lors des infections individuelles [135, 208, 343], alors que d’autres n’ont observé aucune différence [220, 397].

Il est aussi suggéré que les infections respiratoires virales pourraient favoriser le développement d’une infection bactérienne [154]. En ce sens, des évidences suggèrent que certains enfants présentant une pneumonie causée par le VRS pourraient être co-infectés avec le pneumocoque, mais ce phénomène ne serait pas fréquent [196, 252]. Des cas de co-infections avec ce pathogène bactérien ont aussi été observés chez des jeunes enfants hospitalisés suite à une infection aiguë des voies respiratoires inférieures causée par le hMPV. Il a d’ailleurs été rapporté qu’une proportion significative de ces hospitalisations pouvait être prévenue par l’administration du vaccin polysaccharidique conjugué du pneumocoque [234].

Finalement, l’effet de la co-infection du hMPV et du «severe acute respiratory syndrome» (SARS)-coronavirus sur l’ampleur des symptômes respiratoires observés a été suggéré au cours de l’épidémie survenue au Canada et à Hong Kong en 2003 [49, 303]. Dans une étude comprenant 48 patients possiblement infectés par le SARS, Chanet al. ont identifié par PCR la présence du hMPV dans 52 % des échantillons nasopharyngés déposés en culture cellulaire [49]. Cependant, aucune augmentation des symptômes n’a été observée suite à la co-infection de ces deux virus dans le modèle expérimental du macaque [112]. L’effet du hMPV sur l’infection par le SARS-coronavirus demeure donc hypothétique.

Plusieurs techniques différentes ont été mises au point afin d’identifier la présence du hMPV dans divers échantillons.

Le hMPV ne se réplique pas aisément en culture cellulaire. En fait, très peu de lignées sont permissives à cette infection virale. Jusqu’à présent, les cellules tertiaires de rein de singes (tMK) et cellules de rein de singe rhésus (LLC-MK2) sont parmi les seules qui démontrent un effet cytopathique consistant suite à l’infection par le hMPV [32, 212, 295, 387]. Les LLC-MK2 ne font pas partie des lignées cellulaires couramment utilisées en laboratoire afin d’identifier un pathogène viral à partir d’un échantillon clinique. Cela pourrait expliquer en partie le fait que le hMPV ait été identifié pour la première fois en 2001, alors qu’il serait présent parmi la population depuis au moins 50 ans. La culture du hMPV est très laborieuse et peut être très lente lorsque l'infection se fait à partir de spécimens cliniques, tels que des aspirations nasopharyngées (ANP). Les premiers effets cytopathiques apparaissent en moyenne en 17,3 jours, et l’attente peut même aller jusqu’à >21 jours.

D’autres lignées cellulaires, telles que les Vero (cellules de rein de singes verts africains) et les Hep-2 (cellules humaines originellement issues d'un carcinome du larynx), semblent permissives à l’infection par le hMPV. Les Vero sont présentement utilisées par différents groupes de recherche et démontrent généralement un bel effet cytopathique suite à l’infection virale pour la plupart, mais pas toutes les souches [6, 26, 70, 78, 232]. D’un autre côté, les Hep-2 supportent faiblement la réplication du hMPV et ne sont pas considérées comme une lignée cellulaire idéale [78]. Plusieurs autres lignées ont aussi été testées afin de vérifier leur capacité à supporter la réplication virale. Les fibroblastes humains de prépuce (PR1), les cellules dérivées d’adénocarcinomes de poumon humain (A-549), de rhabdomyosarcomes humains (RD), de reins humains transformées (293), d’adénocarcinomes du colon humain (HT-29), les cellules de rein de chien Madin-Darby (MDCK) et les cellules de poumon de vison se sont toutes avérées faiblement ou non permissives à cette infection virale [32, 387]. Jusqu’à maintenant, les LLC-MK2 ainsi que les Vero semblent être les cellules les plus appropriées pour la culture et l’étude du hMPV.

Lors de l’infection par le hMPV en culture cellulaire, différents effets cytopathiques peuvent être distingués selon les souches (figure 11). Tout d’abord, il est possible d’observer un arrondissement des cellules qui deviennent réfringentes et décollent du tapis cellulaire. La présence d'amas de cellules démontrant un aspect granuleux et une forme irrégulière est aussi notée (figure 11B). Finalement, le hMPV, comme le VRS, possède une protéine de fusion favorisant la formation de syncytia visiblesin vitro(LLC-MK2) (figure 11C). Contrairement au VRS, seulement certaines souches de hMPV forment des syncytia en culture cellulaire. La cause de ces différents effets cytopathiques n’est toujours pas expliquée. Un groupe de recherche a récemment suggéré que la formation de syncytium était directement reliée à l’ajout de trypsine extracellulaire et la présence d’un pH bas en culture cellulaire [339]. Toutefois, ces observations n’expliquent toujours pas pourquoi certaines souches de hMPV forment des syncytia sans ces conditions.

Afin d’évaluer les titres viraux en culture cellulaire, deux méthodes sont habituellement utilisées. Tout d’abord, la technique de Reed and Muench [315] est basée sur l’apparition des effets cytopathiques. Celle-ci consiste à déterminer la dilution à laquelle la moitié des puits infectés présentent un effet cytopathique (TCID50-«Tissue Culture Infectious Dose 50 %»). L’autre méthode détermine le nombre d’unités formatrices de plaques (UFP) en se servant d’agarose, mais cette méthode est difficile à réaliser pour le hMPV (absence de plaques franches). Suite à l’infection de tissus maintenus en culture cellulaire, il est possible cependant d’utiliser un anticorps dirigé contre le hMPV afin d’effectuer une réaction de détection avec un second anticorps marqué. Cette technique semble plus sensible que celle de Reed and Muench ou de la technique des plaques avec agarose, puisque l’anticorps spécifique au hMPV peut reconnaître son épitope sur des cellules infectées avant que les premiers effets cytopathiques ne soient observés.

À cause de sa grande rapidité et de sa grande sensibilité, la réaction de RT-PCR est devenue la méthode de choix afin de diagnostiquer les infections par le hMPV. Cette technique est maintenant employée dans plusieurs laboratoires et semble être plus sensible que les autres méthodes utilisées [94, 214, 385]. À cause de la variabilité génétique du hMPV, les amorces doivent être dessinées méticuleusement afin que le PCR soit le plus sensible possible et qu’il permette la détection de l’ensemble des sous-types du hMPV. La plupart des groupes de recherche utilisent les gènes N, P, F et L [62, 230, 231, 235]. Parmi ceux-ci, le gène N semblerait être une cible plus particulièrement intéressante, puisqu’il permet la détection des 4 sous-types associés à ce virus [235].

Les PCR multiplex sont des outils pratiques qui permettent de détecter plusieurs virus en une seule réaction de PCR. Ces derniers sont principalement utilisés afin d’identifier rapidement le pathogène en cause parmi plusieurs possibilités. Par exemple, dans le cas d’infections respiratoires, le hMPV ainsi que plusieurs autres virus peuvent être identifiés simultanément, ce qui consiste en un atout majeur pour le diagnostic rapide [20, 137]. Finalement, l’utilisation d’une approche PCR en temps réel permet d’estimer les titres viraux et d’évaluer de façon quantitative ou semi-quantitative le nombre de copies de hMPV présentes dans un échantillon [78].

La pathogenèse associée à l’infection par le hMPV a principalement été étudiée dans des modèles expérimentaux chez le petit animal de laboratoire et chez les primates. Quelques études anecdotiques ont aussi été effectuées chez l’humain, mais celles-ci sont peu nombreuses. Les principaux points caractérisant la pathogenèse associée à cette infection virale font l’objet de cette thèse et seront détaillés aux chapitres trois et quatre ainsi que dans le chapitre huit, où les différentes études effectuées seront discutées.

Le VRS est un virus respiratoire appartenant à la même sous-famille que le hMPV. En se basant sur leurs ressemblances cliniques et génétiques, il est suggéré que leurs protéines virales auraient des rôles similaires à jouer au niveau de la réplication, de l’immunité et de la physiopathologie. Les connaissances acquises chez le VRS sont importantes à prendre en considération afin de guider les études prospectives du hMPV [237].

La pathophysiologie de l’infection par le VRS est associée à une dysfonction des voies respiratoires et à une importante réponse inflammatoire [256]. L’altération de la fonction des voies respiratoires est causée par une destruction des cellules épithéliales des bronchioles, une hyperproduction de mucus et le développement d’hyperréactivité bronchique. Plusieurs composantes de l’inflammation sont aussi impliquées dans la sévérité de la maladie. Les lymphocytes T et B, les éosinophiles, les neutrophiles, plusieurs cytokines et chimiokines ainsi que les leucotriènes et les prostaglandines ont tous un rôle important à jouer dans la pathogenèse associée à l’infection par le VRS [37, 77, 248, 298, 362, 378].

De façon plus détaillée, la pathogenèse associée à cette infection virale est caractérisée par une nécrose des cellules épithéliales ciliées qui peut être accompagnée d’une prolifération de l’épithélium suite à la réplication du virus [4]. Le VRS favorise aussi le développement d’une importante inflammation péribronchique, composée principalement de neutrophiles, de macrophages et de lymphocytes, associée à de l’œdème sous-mucosal et à la sécrétion de mucus [4, 279]. L’inflammation contribue à la sévérité de la maladie et peut conduire à une obstruction des bronches et au développement d’atélectasie et d’emphysème [279]. Il peut parfois arriver que certaines sections des poumons collapsent à cause de l’interférence mécanique avec la ventilation. Finalement, les alvéoles ne sont généralement pas infectées, mais, dans certains cas, il arrive que l’infection se propage et qu’une pneumonie interstitielle caractérisée par des dommages à l’épithélium, une infiltration de lymphocytes et de l’œdème pulmonaire se développe [4].

L’infection par le VRS se transmet entre les individus suite à un contact avec une personne déjà infectée, par des gouttelettes présentes dans l’air et par des contacts mains-bouche ou mains-yeux avec des surfaces infectées [144, 145, 376]. Ce pathogène viral infecte principalement l’épithélium respiratoire cilié [441], suite à une interaction entre les domaines de liaison à l’héparine retrouvés sur la protéine G et les GAGs situés à la surface des cellules [242, 372]. De plus, une région conservée non glycosylée de la protéine G contient un motif CX3C capable d’interagir avec le récepteur des chimiokines CX3CR1 facilitant alors l’infection par le VRS [377]. Ce virus ne se réplique pas seulement dans les cellules épithéliales; il peut aussi infecter les macrophages alvéolaires, des cellules mononucléaires retrouvées dans le sang périphérique [438] et d’autres types de cellules pulmonaires [376].

Plusieurs groupes de recherche ont rapporté que le VRS pourrait être associé à une persistance ou une latence suite à l’infection virale. L’infection des cellules du système immunitaire pourrait être un mécanisme contribuant à ce phénomène. Effectivement, il a été démontré que des particules infectieuses persistent dans les poumons des cochons d’Inde [40, 69], dans la lignée cellulaire de macrophages murins P388D1 [141] et dans les macrophages en culture [142]. Le VRS établit aussi une latence et une persistance chez les souris Balb/c, malgré la présence de lymphocytes T cytotoxiques spécifiques au VRS et la présence d’IgG dans le sérum [342]. Un rapport publié récemment a démontré que le VRS peut infecter les cellules neuronales innervant les poumons, ce qui pourrait constituer un autre mécanisme expliquant la persistance du virus suite à l’infection [224]. Toutefois, ces observations n’ont toujours pas été démontrées chez l’humain.

L’immunité acquise induite par une infection virale protège habituellement les individus contre une réinfection et confère un certain niveau de protection contre les souches apparentées. Contrairement aux autres pathogènes, les cas de réinfections avec la même souche de VRS ou une autre différente sont communs [376]. De plus, l’infection résulte en une latence ou en une persistance du virus chez l’hôte animal [141, 142, 160, 342]. Ces observations suggèrent que la réponse immune induite suite à l’infection primaire par le VRS est incomplète ou que ce virus pourrait en moduler divers aspects afin d’y échapper.

Chez l’humain, l’infection primaire est caractérisée tant par une réponse immune de type Th1 que Th2 [85, 378]. Cependant, dans certains cas, l’immunité peut être déviée vers une réponse Th2 si l’individu a été exposé auparavant à un antigène induisant une réponse non spécifique au VRS, si une population particulière de lymphocytes T spécifiques au VRS a été préalablement activée (vaccination avec la protéine G ou le virus complet inactivé à la formaline [FI-VRS]), ou si ce dernier présente certains facteurs intrinsèques de l’hôte (figure 12) [134]. Par exemple, une personne atopique ou démontrant une importante réponse inflammatoire suite à l’exposition à un allergène va préférentiellement développer une réponse immune de type Th2 au cours de l’infection virale.

Au cours du développement embryonnaire, la réponse immune de type Th1 du fœtus est supprimée afin d’empêcher le rejet du placenta. Après la naissance, cette réponse se développe progressivement suite à des stimuli extérieurs. Il est suggéré que cette faible immunité de type Th1 associée à la présence de l’immunité Th2 lors des premiers mois de la vie contribuerait à la sévérité de l’infection par le VRS, serait la cause des dysfonctions pulmonaires observées [167, 241, 310] et expliquerait l’infection plus sévère notée chez les jeunes enfants comparés à ceux plus âgés.

Le profil et l’intensité de la réponse inflammatoire développés suite à l’infection virale sont orchestrés par les différents types de cytokines sécrétées par les cellules épithéliales infectées et les macrophages alvéolaires [380]. Récemment, le TLR4 a été démontré comme ayant un important rôle à jouer dans la réponse immune lors de l’infection par le VRS [213]. La protéine F aurait la capacité d’interagir avec ce dernier, ce qui résulterait en l’activation de multiples médiateurs de l’immunité innée [213]. De plus, l’infection augmente l’expression d’ARNm du TLR4 et certains ont aussi suggéré que ce récepteur serait impliqué dans la sévérité de l’infection [365].

L’infection par le VRS stimule l’expression de gènes impliqués dans la défense antivirale : les interférons (INF) α et β [86]. Afin de parer à ce système de défense cellulaire, le VRS a développé une stratégie qui est propre aux pneumovirus [124, 434]. Il possède dans son génome deux gènes codant pour les protéines non structurales NS1 et NS2. Celles-ci sont des antagonistes des INF α et β et permettent au VRS de se répliquer plus facilement dans les cellules infectées [312].

Suite à l’infection virale, plusieurs cytokines, telles que IL-1, IL-6 et TNF-α, sont produites [85, 213, 376]. IL-8 et MCP-1 sont d’autres cytokines impliquées dans la réponse immune de l’hôte contre le VRS et favorisent le recrutement de neutrophiles et de macrophages au site d’infection [1, 274]. Par la suite, la sécrétion des cytokines inflammatoires RANTES et MIP-1α stimule le recrutement de lymphocytes et l’activation des neutrophiles. Celles-ci favorisent aussi le développement d’une réponse inflammatoire prononcée en induisant le relâchement de médiateurs provenant des éosinophiles, des basophiles et des mastocytes [186, 200, 373]. Il est d’ailleurs suggéré que ces deux cytokines pourraient contribuer à la sévérité de la maladie [245, 376]. L’éotaxine est une autre cytokine sécrétée [442] qui va à son tour attirer les éosinophiles et les lymphocytes T de type Th2 [323]. Une fois recrutés au niveau des poumons infectés, les lymphocytes et les éosinophiles sensibles à l’action de l’éotaxine vont sécréter de l’IL-13 [335], ce qui va favoriser le développement d’hyperréactivité bronchique.

Contrairement aux particules virales entières, la protéine G du VRS induit une forte réponse immune de type Th2 [155, 192]. Cette protéine existe sous deux formes : membranaire et sécrétée [319]. Des évidences suggèrent que la forme sécrétée stimule plus fortement l’immunité de type Th2 que la forme membranaire [191]. La réponse immune stimulée par la protéine G est principalement caractérisée par une production d’éotaxines, IL-4, IL-5 et IL-13 [134, 191, 192, 379] associée à une infiltration d’éosinophiles au site d’infection [134, 193]. Au cours de l’infection virale, certains individus prédisposés au développement d’une réponse immune de type Th2 sont susceptibles à l’effet de la protéine G sécrétée et présentent ce profil d’inflammation à différents degrés, alors que d’autres semblent plutôt développer une réponse immune modulée, non dominée par l’effet immunogénique de cette protéine virale.

Plusieurs cytokines de type Th2, telles que IL-4, IL-5, IL-13 et IL-10, sont impliquées dans le développement de réactions allergiques et dans la dysfonction des voies respiratoires [375, 404, 406]. Celles-ci sont aussi produites lors de l’infection par le VRS et auraient possiblement un rôle important à jouer dans la pathogenèse de l’infection virale.

L’asthme est une maladie respiratoire chronique dont les épisodes peuvent être causés par l’exposition à un allergène, par des substances irritantes des voies respiratoires ou par la survenue d’une infection respiratoire virale [129, 240]. De plus en plus d’évidences démontrent une corrélation entre les infections sévères par le VRS chez le jeune enfant et le développement d’asthme et d’hyperréactivité bronchique ultérieurement au moins de façon transitoire [105, 241, 281]. Certains ont aussi suggéré que ce virus contribuerait au développement d’une sensibilisation allergique [330, 348, 349]. Cependant, d’autres n’ont pas observé d’association entre ces deux facteurs, malgré le fait qu’une corrélation significative entre les infections virales et le développement d’asthme ait été notée [311, 355].

Récemment, un groupe de recherche a rapporté que les enfants à risque de développer des complications suite à l’infection par le VRS et qui avaient été traités de façon prophylactique avec des immunoglobulines hyperimmunes contre le VRS avaient de moins grandes chances que les enfants non traités d’obtenir un résultat positif au test d’aéro-allergènes cutané et de développer de l’asthme [408]. Ces résultats suggèrent que la prévention des infections par le VRS chez les jeunes enfants pourrait diminuer l’incidence d’asthme et d’allergies observée au cours de leur croissance. Plusieurs études prospectives randomisées sont encore nécessaires avant de confirmer cette hypothèse.

Malgré le fait que plusieurs aient rapporté l’existence d’une corrélation significative entre l’infection virale et le développement d’asthme, il est important de noter qu’une grande proportion des enfants infectés par le VRS ne développeront pas d’infections sévères ou d’asthme au cours de leur vie. Ces observations suggèrent que certaines prédispositions génétiques auraient possiblement un rôle à jouer. En ce sens, il a été démontré que deux polymorphismes différents retrouvés au niveau du gène de IL-4 étaient associés à la sévérité de l’infection par le VRS [51, 166]. De plus, la présence d’un certain polymorphisme au niveau du promoteur de IL-10 semble corréler avec un taux d’hospitalisation plus élevé lors de l’infection virale [165] et des variations dans le gène codant pour cette cytokine semblent favoriser la nécessité d’une ventilation mécanique [422].

Finalement, la pathogenèse associée à l’infection par le VRS est complexe et englobe une multitude de facteurs. Plusieurs éléments demeurent toujours sans réponse, les principaux étant la cause de la sévérité des infections chez certains individus et le développement d’une immunité de type Th2 prononcée. Bien que de nombreuses études confirment les mêmes hypothèses, certaines démontrent le contraire et sèment le doute.

Plusieurs animaux de laboratoire, tels que la souris, le «cotton rat», le hamster doré, le furet et les primates non humains, ont été utilisés afin de développer des modèles expérimentaux d’infection pour le hMPV. Ces derniers sont d’une grande importance afin de mieux comprendre la pathogenèse associée à l’infection virale et sont aussi d’excellents outils afin d’évaluer l’efficacité de traitements thérapeutiques et prophylactiques.

Les primates non humains ont été les premiers animaux à être utilisés comme modèlein vivod’infection par le hMPV [387]. Au départ, des macaques cynomolgus et des dindes ont été infectés par le hMPV afin de vérifier si ce virus était un pathogène des primates ou un pathogène aviaire pouvant infecter l’humain. Les macaques se sont avérés susceptibles à l’infection virale et ont développé des symptômes de rhinite. Des changements histopathologiques au niveau des voies respiratoires pouvaient aussi être observés [212]. Plusieurs autres primates (chimpanzés, singes verts africains et macaques rhésus) ont par la suite été utilisés comme modèles expérimentaux.

Les chimpanzés sont permissifs à l’infection par le hMPV et celle-ci entraîne une réplication efficace du virus, un épaississement de la muqueuse et une perte d’appétit [351]. Les singes verts africains peuvent aussi supporter l’infection par le hMPV, mais aucun signe clinique n’est observé suite à l’administration de la souche virale [232, 351]. Finalement, les macaques rhésus ne sont pas permissifs au hMPV, puisque le virus ne semble pas se répliquer au niveau des voies respiratoires et qu’aucun signe clinique n’est observé [232, 351]. Étonnamment, environ 61 % des chimpanzés sont séropositifs pour le hMPV, ce qui démontre que cette espèce est susceptible à l’infection naturelle par ce virus [351]. Il est donc primordial de vérifier si les animaux n’ont pas déjà contracté cette infection virale avant de débuter un protocole expérimental. Les primates sont dispendieux et plus difficiles à manipuler que les petits rongeurs, mais, étant donné leur grande similarité avec l’humain, ils restent un modèle expérimental de choix afin de caractériser la pathogenèse virale et l’efficacité de différents traitements.

Le modèle expérimental d’infection idéal doit permettre une réplication efficace du virus, l’apparition de changements histopathologiques au niveau de l’organe atteint chez l’humain et le développement de signes cliniques associés à la maladie. Certains modèles existants ne présentent pas l’ensemble de ces caractéristiques et sont seulement permissifs à la réplication virale et parfois aussi au développement de changements histopathologiques. Il survient dans quelques cas que le modèle expérimental idéal illustrant les trois aspects mentionnés ne puisse être développé, puisque les animaux utilisés ne sont pas des hôtes naturels de ces pathogènes et sont donc moins susceptibles à l’infection.

Plusieurs critères doivent être pris en considération afin de développer un modèle expérimental s’apparentant le plus possible à l’infection naturelle observée chez les individus (révisé en [44, 80]). Parmi ceux-ci, les facteurs génétiques de prédisposition chez l’hôte en sont un d’importance. De plus, certaines études visant à caractériser la pathogenèse de l’infection requièrent des souches animales spécialisées (cosanguines, transgéniques ou knockout pour différents gènes). Il s’avère donc primordial que celles-ci soient disponibles ou faciles à développer chez l’espèce animale choisie. Finalement, il est suggéré que le modèle expérimental sélectionné présente certains avantages pratiques. La manipulation des animaux et les chirurgies doivent être faciles à effectuer et le coût de la procuration et de la maintenance des animaux en laboratoire doit être peu élevé. Par conséquent, un nombre considérable d’animaux doit être utilisé, permettant ainsi d’incorporer tous les groupes contrôles nécessaires et d’effectuer des calculs statistiques valables.

Jusqu’à présent, aucun vaccin, agent antiviral ou préparation d’immunoglobulines n’a été approuvé chez l’humain afin de traiter ou prévenir les infections par le hMPV.

La ribavirine (1-β-D-ribofuanosyl-1,2,4triazol-3-carboxamide), un analogue de la guanosine, est un agent antiviral qui démontre une activité efficace contre plusieurs virus composés d’un génome à ARN ou ADN [79, 116, 130, 170, 344]. Bien que cette molécule ait été synthétisée pour la première fois en 1972 [347], son mécanisme d’action n’a été élucidé que très récemment. Plusieurs investigateurs ont proposé que l’activité antivirale de la ribavirine serait de favoriser l’accumulation de mutations afin de rendre les génomes défectifs [65, 97](révisé en [81]).

Concernant son métabolisme intracellulaire, la ribavirine est phosphorylée par une adénosine kinase [420] pour former la ribavirine monophosphate (RMP) qui est ensuite convertie en ribavirine triphosphate (RTP) suite à l’action successive de kinases [123]. Le premier composé, la RMP, est un puissant inhibiteur de la IMP déhydrogénase, enzyme nécessaire à la formation de guanosine monophosphate (GMP) (figure 13). Par conséquent, les niveaux intracellulaires de guanosine triphosphate (GTP) peuvent être diminués jusqu’à 90 % chez les cellules traitées à la ribavirine.

Les virus, tout comme les cellules hôtes, sont dépendants de la présence de GTP pour se répliquer. Une baisse de la disponibilité de ces nucléotides entraîne vraisemblablement une diminution de leur réplication. Il a d’ailleurs été démontré que les niveaux intracellulaires de GTP étaient très peu élevés lors d’infections contractées avec le VRS, le virus de la rougeole et les virus influenza et traitées avec de la ribavirine [353]. L’inhibition de la IMP déhydrogénase ainsi que la réduction des niveaux de GTP pourraient expliquer l’activité antivirale non spécifique et répandue de la ribavirine.

De plus, des évidences suggèrent que la RTP (un analogue des GTP) pourrait interagir avec l’ARN polymérase en agissant comme substrat pour celle-ci [66, 285]. L’incorporation de nucléotides analogues dans l’allongement de la chaîne favorise l’accumulation de mutations et résulte en un phénomène «d’erreur catastrophique» chez les virus exposés à l’antiviral [65]. La ribavirine induit l’insertion de mutations létales au niveau des génomes d’ARN viraux [64].

La ribavirine est approuvée chez l’humain afin de traiter les infections sévères par le VRS et pourrait être un agent antiviral efficace contre le hMPV. Un groupe de recherche s’est intéressé à ce composé et a démontré que la ribavirine possède effectivement une activité antivirale contre le hMPV qui est similaire (concentration inhibitrice 50 % semblable) à celle du VRSin vitro[425]. L’activité de la ribavirine a aussi été évaluéein vivodans le modèle expérimental de la souris Balb/c et sera discutée au chapitre cinq.

L’attachement et la pénétration des particules virales à l’intérieur de la cellule hôte sont des étapes cruciales du cycle de réplication et sont des cibles de choix afin de développer des molécules antivirales. Plusieurs composés sulfatés ont la capacité de nuire à l’attachement et à la pénétration des virus en agissant au niveau de l’interaction entre les protéines virales et les GAGs à la surface des cellules [39, 226]. Le NMSO3 est une molécule sulfatée qui inhibe l’adsorption du VRS aux cellules en modulant les forces de liaison entre les protéines virales et les membranes cellulaires [205]. L’héparine, une autre molécule sulfatée, inhibe la réplication virale du VRSin vitro[210] en empêchant l’interaction essentielle de la protéine d’attachement G avec les GAGs cellulaires [110, 147, 242].

À cause de l’activité antivirale de ces deux composés contre le VRS, ceux-ci ont aussi été testés contre le hMPV afin d’évaluer leur efficacité antivirale. Le NMSO3 et l’héparine inhibent efficacement la réplication du hMPV en agissant au niveau des premières étapes du cycle viral, soit l’attachement et la pénétration [430]. Les mécanismes d’action ainsi que les niveaux d’activité antivirale observés suggèrent que le VRS et le hMPV posséderaient des sites d’attachement et des récepteurs analogues ou similaires [430]. Finalement, il a été démontré que le NMSO3, mais pas l’héparine, pouvait inhiber, ou du moins limiter, la propagation de l’infection par le hMPV et le VRS entre les cellules [430].

Les préparations commerciales d’immunoglobulines (IVIG) sont composées d’un mélange non spécifique d’anticorps polyclonaux provenant de centaines de donneurs. Elles sont habituellement utilisées comme modalité prophylactique et ont la capacité de protéger les individus contre une variété de pathogènes viraux [329]. Des IVIG hyperimmunes (avec haut taux d’anticorps spécifiques) possèdent une très forte activité antivirale contre le VRS et, en 1996, les États-Unis ont approuvé leur utilisation comme modalité prophylactique [10, 345, 346]. Au départ, l’usage des IVIG hyperimmunes contre le VRS (RespiGamTM, MedImmune, Inc., Gaithersburg, MD) était principalement indiqué chez les jeunes enfants à risque de développer de sévères infections respiratoires, tels que les prématurés et ceux aux prises avec une dysplasie broncho-pulmonaire. Ces préparations sont d’une grande efficacité, mais l’administration d’un tel traitement n’est pas sans désavantage. Par exemple, à cause des divers effets secondaires, celui-ci n’est pas recommandé chez les jeunes enfants démontrant des maladies cardiaques congénitales [10]. De plus, l’administration par voie intraveineuse est difficile et requiert de grands volumes (15 ml/kg) avec de hautes concentrations en anticorps (750 mg/kg). Malgré tout, les IVIG demeurent un traitement de choix en attendant le développement d’un vaccin contre le VRS.

Les préparations d’immunoglobulines ordinaires ont aussi été testées contre le hMPV afin d’évaluer leur efficacité à inhiber l’infectionin vitro. Les IVIG se sont avérées très efficaces contre cette infection virale et ont démontré une activité de neutralisation pratiquement égale à celle observée avec le VRS [425]. D’autres étudesin vivosont encore nécessaires, mais ces premiers résultats suggèrent que les IVIG pourraient éventuellement être utilisées comme modalité prophylactique contre l’infection par le hMPV.

Le palivizumab (SynagisTM, MedImmune, Inc., Gaithersburg, MD) est un anticorps monoclonal humanisé dirigé contre la protéine F du VRS. Celui-ci est présentement utilisé comme modalité prophylactique chez les jeunes enfants à risque afin de prévenir le développement de complications associées aux infections respiratoires sévères [374]. Ces anticorps sont administrés sous forme d’une injection intramusculaire tous les mois durant la saison du VRS et ont remplacé l’usage des IVIG hyperimmunes. Récemment, la même compagnie a développé deux anticorps monoclonaux similaires pour le hMPV. Ces derniers sont dirigés contre la protéine F virale et démontrent une activité de neutralisation contre les deux génotypes du virusin vitro[381]. De plus, l’administration de ces anticorps en prophylaxie chez le hamster le protège contre l’infection virale [381].

Jusqu’à présent, aucun vaccin contre le hMPV n’a été testé chez l’humain. Des études préliminaires chez le hamster et le singe ont démontré que l’infection intranasale avec une souche non atténuée de hMPV protégeait complètement contre une infection subséquente par une souche homologue du même génotype et contre des souches hétérologues appartenant à un génotype différent [232, 351]. Ces résultats suggèrent qu’il serait donc possible de développer un vaccin efficace capable de protéger les individus contre les différentes souches de hMPV.

Le développement du système de génétique inverse permettant de manipuler le génome du hMPV [27, 162] (figure 14) a permis d’effectuer une progression majeure dans ce domaine [28, 297, 351, 366, 367]. Bien que cet outil soit très précieux afin de caractériser différents aspects de la pathogenèse associée à l’infection virale, il est aussi un atout majeur pour le développement de candidats vaccinaux. Quelques groupes de recherche ont d’ailleurs utilisé ce système afin d’évaluer l’effet protecteur de virus vivants atténués dans des modèles expérimentaux. De plus, il a été démontré que la protéine F était la seule des trois protéines de surface impliquée dans la protection.

Une équipe de recherche a créé des virus recombinants dont les gènes SH et G ont été enlevés (ΔSH etΔG). Ces derniers se répliquent faiblementin vivoet consistent en de bons candidats comme vaccins vivants atténués [28]. Chez le hamster, l’administration de ces virus par voie intranasale induit une certaine protection contre le hMPV. Effectivement, suite à l’infection avec la souche de hMPV sauvage, l’ARN viral peut être détecté chez seulement 40 % des hamsters immunisés au niveau nasal et les titres viraux sont 3000 fois plus faibles que chez les hamsters non immunisés, alors qu’une protection complète est observée au niveau pulmonaire. Finalement, de hauts titres en anticorps neutralisants sont observés [28].

De plus, la délétion du gène M2-2 chez des virus recombinants ∆SH/G affecte davantage leur capacité réplicative. Ces derniers pourraient aussi être considérés comme vaccin vivant atténué [24]. L’administration de la souche ∆SH/G/M2-2 chez des singes verts africains induit un niveau de protection élevé contre le hMPV. De ce fait, il a été démontré que, suite à l’infection de ces derniers avec la souche sauvage du hMPV, l’ARN viral est détecté seulement chez un des douze singes immunisés et ces derniers présentaient tous de très hauts titres en anticorps neutralisants [24].

Des virus chimériques peuvent aussi être créés par génétique inverse afin de développer des vaccins efficaces contre un ou plusieurs virus à la fois. D’ailleurs, un groupe de recherche a ajouté le gène F et le gène de l’hémagglutinine-neuraminidase (HN) du PIV-3 humain et le gène F du hMPV à une souche de PIV-3 bovin atténuée [367]. Les hamsters et les singes verts africains infectés par voie intranasale et intratrachéale avec ce virus chimérique étaient complètement protégés contre l’infection par le hMPV sauvage [366, 367]. De plus, un autre groupe de recherche a créé un virus chimérique différent en ajoutant cette fois le gène F du hMPV au hPIV-1 [350]. L’administration de ce dernier chez le hamster induit une protection contre l’infection par les deux génotypes du hMPV et contre le hPIV-1 [350, 351]. Ces deux virus chimériques induisent une réponse immune protectrice intéressante et pourraient être considérés comme candidats vaccinaux contre le hMPV.

Récemment, le premier rapport démontrant l’efficacité de l’administration d’un peptide contre l’infection par le hMPV a été publié [161]. Basés sur des algorithmes permettant d’identifier des peptides possiblement exprimés par les complexes majeurs d’histocompatibilité de classe I (CMH-I), certains épitopes des protéines N et SH ont été sélectionnés. L’immunisation de souris avec ces derniers favorise le développement d’une réponse cytotoxique CTL suite à l’infection virale et diminue les titres viraux pulmonaires de 2 log10 [161]. Finalement, plusieurs moyens sont disponibles afin de créer un vaccin contre le hMPV. Cependant, une connaissance approfondie du type de réponse immune induite par le pathogène est nécessaire afin de développer le meilleur vaccin possible.

Les vaccins constituent la modalité de choix pour prévenir le développement d’infections et en empêcher la transmission. Lors d’une infection virale, la fonction principale du système immunitaire est d’éliminer les virus libres dans l’organisme et les cellules infectées ayant le potentiel de relâcher d’autres particules infectieuses (figure 15) [263]. Afin de conférer une protection maximale, les vaccins doivent donc stimuler adéquatement le système immunitaire pour que ce dernier accomplisse efficacement son rôle [23]. Les caractéristiques d’un vaccin idéal sont faciles à définir (tableau 2), mais très difficiles à réaliser, car les pathogènes utilisent plusieurs mécanismes qui interfèrent avec la réponse immune de l’hôte [23].

Différentes préparations antigéniques peuvent être prises en considération dans le développement d’un candidat vaccinal. Parmi celles-ci, les virus complets inactivés, vivants atténués, ou protéines virales peuvent être utilisés. Les vaccins acellulaires semblent toutefois plus sécuritaires que ceux contenant un organisme complet, car les risques de développer la maladie ou de sévères effets secondaires sont pratiquement inexistants.

Parmi les vaccins disponibles commercialement, plusieurs sont constitués de virus vivants atténués. L’atténuation de ces souches virales peut s’effectuer de différentes façons. La plus communément utilisée consiste à passer la souche plusieurs fois dans un hôte non habituel du virus. Au cours des passages, des mutations se créent et entraînent une modification du phénotype viral [263]. Les virus sont ensuite sélectionnés selon l’atténuation et l’immunogénicité désirées. Des souches virales sensibles aux différentes températures peuvent aussi être utilisées comme candidat vaccinal. Une autre alternative consiste à atténuer les souches en utilisant un site d’infection où la maladie ne se développe habituellement pas. Par exemple, le vaccin contre l’adénovirus administré oralement cause une infection asymptomatique dans les intestins et ne se propage pas jusqu’aux voies respiratoires [95]. Finalement, une souche d’origine aviaire ou de mammifères qui est reliée antigéniquement à celle du pathogène humain peut servir de candidat vaccinal [296]. Ces souches ne se répliquent pas de façon efficace chez les individus, car elles sont très bien adaptées à leur hôte naturel.

Il est aussi possible de créer diverses souches virales atténuées par génétique inverse. Cette technique consiste à enlever certains gènes cibles du génome, ce qui résulte en la production de virus recombinants dont la réplication virale est atténuée considérablement, mais qui restent immunogènes. Ces derniers peuvent donc être par la suite utilisés comme candidats vaccinaux afin de protéger contre le pathogène sauvage.

L’utilisation de souches vivantes atténuées en vaccination possède plusieurs avantages. Le principal est que les virus vivants activent l’ensemble des composantes du système immunitaire résultant en une balance parfaite entre l’immunité systémique et l’immunité locale. Il s’agit là d’une particularité importante dans le cas où l’immunité cellulaire joue un rôle de premier ordre et dans le cas d’infections mucosales. En ce sens, il a d’ailleurs été rapporté que l’immunité systémique et surtout l’immunité locale sont nécessaires afin d’établir une protection efficace contre un pathogène infectant les muqueuses et que les virus vivants atténués étaient beaucoup plus efficaces qu’un virus inactivé, administré de façon parentérale pour induire ce type de réponse [263].

Les virus vivants peuvent aussi stimuler une réponse immune contre l’ensemble des antigènes protecteurs [263]. Cela est particulièrement important pour les virus complexes qui en possèdent plusieurs, puisqu’il est difficile d’immuniser les individus avec chacune des protéines purifiées ou de construire des vecteurs multivalents en respectant des coûts minimes. Quoi qu’il en soit, l’immunité induite par les virus vivants est aussi plus durable et plus efficace [188]. Finalement, le développement de virus vivants atténués comme candidats vaccinaux est avantageux : ils sont peu coûteux à produire et faciles à administrer.

Malgré le fait que les virus vivants atténués possèdent de nombreux avantages comme candidats vaccinaux, ceux-ci présentent tout de même quelques inconvénients qui ne sont pas à négliger. Premièrement, ceux-ci peuvent être contaminés avec un autre agent infectieux. Le risque de contamination est très faible, mais le potentiel reste toujours présent. De ce fait, il a été rapporté que les premiers lots de vaccins contre la poliomyélite avaient été contaminés avec le virus vivant SV40 [260]. Heureusement, un suivi des individus vaccinés n’a démontré aucun effet secondaire à long terme relié à cet incident [359].

Deuxièmement, les virus atténués peuvent causer divers symptômes associés à la maladie, se propager d’un individu à l’autre et perdre leur atténuation (c’est-à-dire une réversion). Par exemple, la faible infectivité démontrée par les vaccins contre le virus de la rougeole, de la rubéole et de la fièvre jaune provoque de minimes symptômes chez les individus. Néanmoins, les réactions sont mineures et n’interfèrent pas avec les règles d’utilisation et de commercialisation des vaccins. Un problème plus sérieux survient lorsque le virus regagne un certain niveau de virulence. Ce phénomène a été observé avec le vaccin contre la poliomyélite [272]. Il semblerait que la neurovirulence du virus aurait augmenté suite à l’apparition d’une mutation, favorisant ainsi le développement de paralysie chez les individus vaccinés et la propagation de la maladie à leurs proches [128]. Très récemment, un groupe de recherche a aussi démontré la perte de l’atténuation de la souche vaccinale utilisée contre le métapneumovirus aviaire (APV) [47]. L’apparition d’une mutation aurait favorisé le gain de virulence de la souche atténuée.

Troisièmement, les virus peuvent perdre leur infectivité au cours de l’entreposage des préparations, du transport ou de l’utilisation. La stabilité des particules est un problème sérieux pour les virus sensibles aux différentes températures, tels que le virus de la rougeole. Ce dernier doit être transporté et entreposé à de basses températures (environ 4oC), ce qui limite l’utilisation du vaccin dans les climats tropicaux où la maintenance des produits à températures fraîches est difficile. Finalement, il est aussi possible que les infections naturelles chez un individu interfèrent avec l’infection par le virus vivant atténué, résultant ainsi en une diminution de l’efficacité du vaccin [247]. Afin de surmonter ce problème, l’administration de doses multiples est nécessaire pour assurer le développement d’une réponse immune protectrice complète.

Présentement, quelques vaccins contenant des virus inactivés sont commercialement disponibles. Ceux-ci sont préparés à partir de virus ayant d’abord été répliqués dans des œufs (influenza A et B), sur des lignées cellulaires de reins de singes (virus de la poliomyélite type 1, 2 et 3), dans des fibroblastes diploïdes humains (virus de la rage et de l’hépatite A) ou dans des cerveaux de souris (vaccin contre le virus de l’encéphalite japonaise) [263]. Par la suite, soit que les virus deviennent inactifs avec différents agents chimiques, tels que la formaline, soit que les particules virales se brisent au contact de détergents.

Ce type de vaccin possède cependant plusieurs inconvénients. Tout d’abord, certaines préparations vaccinales semblent plutôt favoriser le développement d’une réponse immune exagérée suite à l’infection virale au lieu de protéger les individus contre cette infection. Le premier cas a été observé avec le vaccin du virus de la rougeole inactivé à la formaline. Au lieu d’être protégés, les jeunes enfants vaccinés développaient une réponse atypique avec des symptômes accentués de la maladie lorsqu’ils étaient exposés à l’infection virale au cours de leur vie [119]. Des analyses rétrospectives ont démontré que cette réponse atypique serait caractérisée principalement par l’induction d’une réponse immune de type Th2 [302] et que l’inactivation des particules virales avec la formaline aurait modifié la capacité de la protéine F à induire des anticorps inhibant l’hémolyse [273]. Ce cas indique que l’inactivation des virus peut modifier l’antigénicité des vaccins.

Autre inconvénient : des cas de réponse immune exagérée ont aussi été observés chez de jeunes enfants vaccinés avec le VRS inactivé à la formaline. Suite à l’infection naturelle par ce virus, les enfants immunisés développaient plus fréquemment des infections sévères des voies respiratoires inférieures que d’autres n’ayant pas été vaccinés [204]. Deux en sont d’ailleurs décédés [199, 204]. Les mécanismes à l’origine de cette réponse immune exagérée semblent provenir d’aberrations impliquant différentes composantes du système immunitaire.

Premièrement, il semblerait que ce vaccin ne peut stimuler une production appréciable d’IgA sécrétoires au niveau des voies respiratoires, laissant ainsi les gens vaccinés susceptibles à l’infection virale. Deuxièmement, des immunisations avec le VRS inactivé à la formaline induisent la production d’un titre très élevé en anticorps spécifiques contre la glycoprotéine F qui ne possèdent cependant qu’une très faible activité de neutralisation [264]. Troisièmement, de récentes études ont démontré que l’infection par le VRS chez des souris préalablement immunisées avec le virus inactivé à la formaline favorise le recrutement de cellules T CD4+ au niveau pulmonaire, alors qu’aucune réponse cytotoxique CTL n’est observée [61]. Chez des sujets préalablement immunisés, l’immunité développée suite à l’infection est fortement déviée vers la réponse Th2, alors qu’elle est normalement balancée entre Th1 et Th2 chez les sujets naïfs [60, 133].

L’infection par le PIV-3 chez des «cotton rats» préalablement immunisés avec le virus inactivé à la formaline induit aussi une réponse aberrante [282]. Il a récemment été suggéré que des immunisations avec le hMPV inactivé pourraient aussi favoriser le développement d’une réponse immune exagérée et déviée Th2 suite à l’infection virale. Ces résultats seront discutés plus amplement au chapitre six de cette thèse.

Finalement, un autre désavantage de l’utilisation des virus inactivés, comme préparation vaccinale, est que les immunisations parentérales avec des virus infectant principalement des surfaces muqueuses pourraient ne pas être complètement efficaces contre l’infection étant donné que l’administration d’antigènes par ces voies ne stimule pas de façon satisfaisante la production d’anticorps IgA sécrétoires [263].

Au cours des dernières années, d’énormes progrès ont été effectués dans le domaine de la production de protéines recombinantes. Ces dernières sont particulièrement intéressantes à utiliser comme candidat vaccinal et sont beaucoup plus sécuritaires que les préparations mentionnées précédemment. Il n’y a aucun danger de développer l’infection, aucune réponse immune aberrante n’est observée suite à la modification des antigènes de surface et l’absence d’acide nucléique viral diminue le risque de développement d’effets secondaires associés à l’infection ou à l’intégration de l’acide nucléique au niveau du génome de l’hôte.

La production de glycoprotéines virales par des techniques d’ADN recombinant procure plus d’avantages que les autres techniques conventionnelles. En ce sens, il est possible d’insérer des mutations à l’intérieur du gène codant pour la protéine d’intérêt à exprimer afin que celle-ci soit plus facile à produire et à purifier ou encore il est possible d’étudier la fonction de certaines régions peptidiques en particulier. Par exemple, les domaines d’ancrage membranaire ainsi que le signal peptide peuvent être enlevés du gène afin de favoriser la solubilité de la protéine. De plus, l’insertion de mutations à l’intérieur du gène à exprimer crée un changement au niveau des acides aminés correspondants et permet ensuite d’en vérifier l’effet dans le contexte désiré.

Finalement, cette technique permet aussi de développer des protéines chimériques. Celles-ci correspondent à un agent immunogène constitué des portions antigéniques de deux antigènes protecteurs. L’utilisation de chimères en vaccination accroît l’immunogénicité et la réponse immune protectrice du vaccin.

De façon générale, la production d’antigènes viraux dans un système procaryote ne connaît pas d’immenses succès. Il est très difficile de produire des glycoprotéines virales à l’aide de ce type de système, puisque les antigènes n’adoptent souvent pas la bonne conformation. Les cellules procaryotes utilisent un processus de maturation des protéines différent de celui des cellules eucaryotes dans lesquelles se répliquent les virus et le micro-environnement n’est pas le même. Cependant, ce système ne peut être complètement mis de côté, car certaines protéines ou fragments protéiques peuvent parfois y être exprimés [269].

Un grand nombre de virus enveloppés ou non possèdent la capacité de s’assembler en particules apparentées aux virus (VLP) dans les cellules procaryotes. Contrairement aux virions, les VLPs ne sont pas infectieuses et correspondent aux protéines de la capside assemblées entre elles afin de former une structure similaire sans acide nucléique viral à l’intérieur [103]. Ces structures présentent à leur surface plusieurs épitopes conformationnels qui ne sont normalement pas retrouvés lorsque les protéines la composant sont exprimées séparément [261]. L’organisation des épitopes selon la forme la plus représentative possible de celle retrouvée sur la particule virale est un très grand avantage afin de stimuler une réponse immune protective adéquate [103]. D’ailleurs, un vaccin récemment approuvé composé de la VLP du papillomavirus produite à l’aide du système procaryote s’est avéré être très efficace contre l’infection virale [356]. Certaines VLPs s’assemblent efficacement dans les cellules procaryotes, mais peuvent aussi être produites très facilement dans les cellules eucaryotes, telles que les levures et le système de baculovirus.

Les systèmes d’expression de protéines dans des cellules eucaryotes sont couramment utilisés afin de produire des protéines virales. Parmi ceux-ci, les levures, les baculovirus et les cellules de mammifères sont les plus utilisés. Le système de levure semble bien fonctionner pour exprimer certains antigènes viraux, tels que celui retrouvé dans le vaccin contre l’hépatite B [263] et les VLPs du papillomavirus [227]. Cependant, d’autres protéines virales sont difficilement exprimables dans ce système [327].

Un avancement majeur dans l’expression de protéines virales est survenu suite au développement du système de baculovirus. L’expression des protéines s’effectue dans des cellules d’insectes et résulte en la production d’une grande quantité d’antigènes [263]. Le système d’expression de baculovirus a d’ailleurs été utilisé afin d’exprimer les glycoprotéines virales du VRS [43, 409] et du hMPV [178]. De plus, l’expression de l’hémagglutinine (HA) de l’influenza A fonctionne très bien dans ce système et il a même été démontré que des immunisations avec cette protéine étaient aussi sécuritaires et immunogènes que le vaccin commercial inactivé présentement utilisé chez l’humain [304].

Les cellules de mammifères semblent être un système d’expression optimal afin de produire des protéines virales. Le repliement, le transport et la maturation des protéines s’effectuent de façon très similaire à ce qui se produit chez l’humain et reflètent donc la façon dont les protéines virales sont produites lors de l’infection. D’ailleurs, la compagnie MedImmune a récemment utilisé ce système afin de produire la protéine F du hMPV pour développer des anticorps monoclonaux neutralisants [381].

Deux systèmes différents peuvent être utilisés afin de produire des antigènes viraux dans les cellules de mammifères. Le premier correspond au système de virus recombinant T7/vaccine qui fonctionne suite à une double infection des cellules. Un des virus recombinant contient le gène d’intérêt à exprimer sous le contrôle du promoteur T7, alors que l’autre exprime la T7 polymérase [118]. Cependant, une fois l’expression terminée, les virus infectieux de la vaccine doivent être enlevés de la préparation finale avant que celle-ci soit utilisée à d’autres fins. L’autre système est celui des vecteurs d’expression construits à partir des alphavirus [117, 126]. Au cours des dernières années, les alphavirus ont été modifiés pour supporter l’expression de différents ARN étrangers et, par le fait même, traduire la protéine correspondante [117]. Les particules virales recombinantes ont la capacité d’infecter les cellules en culture cellulaire à un très haut niveau et, par conséquent, d’induire la production d’une grande quantité de protéines.

Finalement, un système d’expression de protéines chez les plantes a été récemment développé. Ces organismes sont génétiquement modifiés pour exprimer différentes protéines virales et il n’est pas impossible que de futurs vaccins soient constitués de protéines recombinantes purifiées à partir de plantes [46]. Un groupe de recherche a d’ailleurs démontré que cette technique pourrait être utilisée en vaccination, car l’administration orale de plantes exprimant des protéines virales ou des VLPs confère une protection contre l’infection par le pathogène [413].

Le système immunitaire a évolué en partie afin de se défendre adéquatement contre les antigènes retrouvés à la surface des particules virales et des cellules infectées, favorisant ainsi une réponse immune plus forte contre des antigènes multimériques. Toutefois, les protéines ou peptides viraux produits par des techniques d’ADN recombinant sont très faiblement immunogènes chez l’hôte naïf. L’ajout d’un adjuvant à la préparation vaccinale est donc nécessaire afin d’accroître l’immunogénicité des antigènes viraux composés de monomères ou d’oligomères. Étant donné l’engouement pour le développement de vaccins sous-unitaires protéiques, des efforts considérables sont déployés afin d’identifier de nouveaux adjuvants [286, 384].

Généralement, les adjuvants peuvent augmenter l’immunogénicité des préparations antigéniques de trois façons différentes. Premièrement, certains favorisent la formation de dépôts qui libèrent graduellement des antigènes sur une longue période de temps. Ce phénomène mime l’infection virale aiguë où il peut y avoir libération d’antigènes viraux pendant deux à quatre semaines [63]. L’alum, un adjuvant présentement utilisé chez l’humain, agit de cette façon. Il favorise d’abord la formation de dépôts en créant un lien électrostatique avec l’antigène et libère ensuite progressivement ce dernier au site d’injection. Un second type consiste en une émulsion d’huile et d’eau à laquelle l’antigène est mélangé. L’huile biodégradable est métabolisée ou enlevée par les macrophages et l’antigène est libéré. Le dernier type de dépôt, plus complexe, consiste en une microparticule constituée d’un polymère synthétique auquel a été ajouté l’antigène viral. Une fois dans l’organisme, la microparticule est dégradée par les enzymes des tissus et libère graduellement les antigènes viraux. Les microparticules sont une forme habituellement utilisée afin de libérer des antigènes sur une très longue période de temps.

Deuxièmement, les adjuvants peuvent agir comme immunostimulateurs ou immunomodulateurs en favorisant le développement de l’immunité humorale et/ou cytotoxique (CTL). Certains ont de plus la capacité de modifier la balance entre les réponses immunes de type Th1 et Th2. Par exemple, l’alun favorise le développement d’une réponse de type Th2, alors que les lipides monophosphoryl A (une endotoxine bactérienne détoxifiée) favorisent plutôt la réponse de type Th1. Afin de favoriser le développement d’une réponse CTL, l’utilisation d’adjuvants formant des complexes immunostimulateurs (ISCOM), tels que la saponine, peut être considérée [401].

Récemment, il a été démontré que les séquences d’ADN contenant les motifs CpG retrouvés chez l’ADN bactérien étaient reconnues de façon spécifique par l’humain et augmentaient considérablement la réponse immune contre un antigène viral protecteur [73]. Suite à ces observations, divers oligonucléotides contenant des motifs CpG ont été incorporés à des préparations antigéniques expérimentales afin d’être utilisés comme adjuvants [255, 284, 396]. D’ailleurs, des essais chez l’humain ont démontré l’efficacité des séquences d’ADN contenant ces motifs à induire une réponse immune efficace et complète, indiquant le potentiel prometteur de ce nouvel adjuvant [209]. Ce puissant immunomodulateur favorise le développement d’une réponse immune de type Th1 et s’avère être d’autant plus un atout intéressant pour diminuer le développement d’inflammation au niveau des voies respiratoires et l’hyperréactivité bronchique dans l’asthme [3].

Une variété de cytokines et chimiokines peut aussi être utilisée comme adjuvants. Celles-ci sont particulièrement intéressantes, puisqu’elles peuvent diriger la réponse immune vers l’immunité humorale ou cellulaire selon le cas désiré [159, 249]. Finalement, différentes toxines bactériennes, telles que la toxine du choléra et la toxine labile d’Escherichia coli, sont d’autres adjuvants utilisés. Celles-ci sont les plus efficaces afin de stimuler l’immunité des muqueuses [249] et leur utilisation en vaccination s’avère prometteuse [313].

Troisièmement, certains adjuvants sont utilisés afin d’organiser les antigènes en une structure plus complexe. Par exemple, les liposomes miment les membranes et peuvent contenir des antigènes constitués de régions lipophiliques et hydrophiliques en assurant le repliement adéquat de ces derniers. Les ISCOMs font aussi partie de ce type d’adjuvants et correspondent à des complexes mimant la structure d’une cage composée d’un mélange de lipides et de saponine qui contient les antigènes viraux désirés. Bref, plusieurs adjuvants sont présentement utilisés expérimentalement. Le choix peut parfois être difficile à effectuer, car il faut tenir compte du pathogène, du type de réponse immune induite par celui-ci, de la voie d’administration du vaccin et de la stimulation du système immunitaire nécessaire afin de protéger les individus contre l’infection virale.

© Marie-Ève Hamelin, 2007