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| Chapitre 2: Revue de littérature | ||
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Table des matières
La chitine (Figure 2.1) a été découverte à la fin des années 1850. La chitine est un polysaccharide structural de couleur blanche, dur et non élastique (Hirano, 1996; Muzarelli, et al., 1994). Elle est présente dans la structure cellulaire de champignons, d’insectes et dans les exosquelettes des crustacés. La structure moléculaire de la chitine est identifiée comme étant un polymère linéaire de haut poids moléculaire constitué par des unités de N-acétyl-D-glucosamine (GlcNAc) liées par des liens β-1,4. La nature hydrophobe de la chitine la rend insoluble dans l'eau aussi bien que dans la plupart des solvants organiques. Généralement le degré d'acétylation de la chitine est d’environ 90% et plus.
Le chitosane (Figure 2.2), forme N-déacetylée de la chitine est facilement soluble dans des solvants organiques dilués à pH acides (Peniston & Johnson, 1980). La déacétylation de la chitine se fait en milieu alcalin en présence de NaOH en forte concentration. L’utilisation de hautes températures est souvent requise. Les paramètres les plus importants qui déterminent la solubilité du chitosane sont le degré de déacetylation et le poids moléculaire. La conversion de la chitine en chitosane entraîne une augmentation du degré de déacetylation et change de ce fait la distribution de charges sur les molécules de chitosane. Après une déacetylation partielle ou complète avec un traitement alcalin, la chitine est convertie en chitosane. En plus du degré de déacetylation, le degré de polymérisation du chitosane contribue également au changement de ses propriétés physico-chimiques. D'ailleurs, les oligomères de chitosane ainsi que les chitosanes de faibles poids moléculaires (LMWC) produits suite à l’hydrolyse du chitosane sont plus solubles que le chitosane. Le poids moléculaire est un paramètre important et a un effet direct sur la viscosité des solutions de chitosane ou de ces oligomères. Il est utilisé pour estimer le poids moléculaire moyen de l’hydrolysat de chitosane.
Le chitosane et ses dérivées sont positivement chargés en milieu acide et par conséquent peuvent facilement adhérer aux sites portant des charges négatives. En raison du caractère cationique du chitosane et de ses dérivées, ces molécules en été utilisées dans plusieurs applications telles que la nutrition (Shahidi et al., 1999; Shahidi & Synowiecki, 1991), dans les produits de beauté (Majeti & Kumar, 2000; Felt et al., 1998), en agriculture (Yamada et al., 1993), pour la protection de l'environnement (Peniche-covas et al., 1987) et le traitement des d'eaux usagées (Jeon et al., 2000b; Kurita, 1998; Macchi, 1996; Jeuniaux, 1986), pour l'abaissement de l'hypertension (Giustina & Ventura, 1995), le traitement et le soulagement de douleurs arthritiques (Lee et al., 2003), le traitement de tumeurs (Nishimura, et al., 1986; Nishimura et al., 1984) et pour leurs effets protecteurs contre des infections (Tokoro et al., 1989).
Les oligomères de chitosane sont produits suite à l’hydrolyse du polymère initial. Bien qu’il n’existe pas de définition exacte de ce terme, il est d’usage de considérer les oligomères de chitosane comme étant des molécules avec un degré de polymérisation qui varie entre 2 (dimère de D-glucosamine) jusqu’à 12 unités du monomère de D-glucosamine. L’intérêt de les produire est justifié par leurs nombreuses activités biologiques (Shirui et al., 2004 ; Chen & Chen, 2000 ; Samain et al., 1997.
Il existe plusieurs méthodes de production d’oligomères de chitosane, parmi lesquelles les plus importantes et les plus étudiées sont l’hydrolyse chimique et l’hydrolyse enzymatique.
Pour réaliser l’hydrolyse chimique, plusieurs acides ont été employés. Ainsi, des oligomères de chitosane avec un degré de polymérisation (DP) variant de 2 à 5 ont été préparés par l'hydrolyse du chitosane avec de l’acide chlorhydrique concentré (35% HCl). Cependant, les oligomères de chitosane obtenus par ce procédé ont été accompagnés d'une grande quantité de D-glucosamine à mesure que le temps de réaction augmentait. L'hydrolyse par l'acide chlorhydrique concentré a été substituée par une hydrolyse avec 35% d’ HCl pour diminuer le taux de production du monomère. Les fractions produites avec cette technique ont été caractérisées avec un degré de polymérisation (DP) variant entre 1 et 15 (Xing et al., 2005; Ilina & Varlamov, 2004; Uchida et al., 1989; Rogozhin et al, 1988). De l’acide nitrique concentré a été également utilisé pour hydrolyser le chitosane. Dans ce cas, un mélange d’oligomères avec une variété de degré de polymérisation a été obtenu. Le contrôle de la réaction est difficile et comme dans le cas où l’acide chlorhydrique fut utilisé, le produit final contenait également une quantité importante de monomère (Domard et Cartier, 1989). Une autre méthode employant de l'acide phosphorique chauffé a été rapportée. Des rendements de 10-20% d’oligomères avec un degré de polymérisation de 6 à 8 ont été obtenus (Hasegawa et al., 1993). Des opérations intermédiaires de neutralisation et de dessalement ont été recommandées pour optimiser le procédé. En outre, deux types d'oligomère de chitosane avec un degré de polymérisation variant entre 7 et 17 ont été préparés par une hydrolyse de chitosane par l’acide phosphorique d’une concentration de 85% à la température ambiante. Toutefois, de longs temps de réaction étaient requis (plus de quatre semaines). En raison des limitations de toutes ces méthodes chimiques, l’hydrolyse chimique a eu peu d’applications industrielles (Bosso et al., 1986).
Considérant les limites des méthodes chimiques, l’hydrolyse enzymatique du chitosane aux fins de productions d’oligomères est une alternative. L’hydrolyse enzymatique est spécifique et offre plus de possibilités comparée à l’hydrolyse chimique (Hai et al., 2003; Kuroiwa et al., 2002; Zhang et al., 1999; Kim et al., 1998; Kurita, 1998; Lee et al., 1996; Varum et al., 1996; Aiba, 1994a,b; Muzzarelli et al., 1994). Plusieurs méthodes permettent de réaliser l’hydrolyse enzymatique.
L'hydrolyse est effectuée dans des réacteurs en lots (batch), où la chitosanase est mélangée avec son substrat (chitosane). Ceci permet à la chitosanase de briser les liens glycosidiques du chitosane et de libérer des oligomères de différents poids moléculaires (Izume et Ohtakara, 1987). Les conditions optimales pour hydrolyser une solution de 1% de chitosane avec un degré de déacétylation de 89% en utilisant une chitosanase extraite de Bacillus pumilus sont 45 °C, pH 5.5 et 1 h de réaction (Jeon & Kim 2000a). Varum et al. (1996) ont hydrolysé du chitosane avec un degré de déacetylation de 65% pendant 5 h à un pH de 5.5 et sous une température de 37 °C en utilisant une chitosanase obtenue de source bactérienne (Bacillus spp). Cependant, l'inconvénient principal du système de réacteur en lots (batch) est le coût élevé des enzymes qui ne peuvent pas être réutilisées, étant donné la grande quantité nécessaire. En outre, dans ces systèmes, les rendements sont bas et cela est généralement dû à la capacité limitée de maîtriser le procédé. Par conséquent, le produit final obtenu est un mélange d’oligomères de chitosane avec une large distribution du poids moléculaire.
Généralement l'immobilisation des enzymes offre un certain nombre d'avantages technologiques comprenant la réutilisation des enzymes, la continuité de l'opération, l'arrêt rapide des réactions et la maîtrise du produit final. Ainsi, une nouvelle méthode pour produire des oligomères de chitosane avec un degré de polymérisation (DP) plus élevé a été présentée par Jeon et al. (1998) employant une chitosanase immobilisée. Dans ce système, l'immobilisation a été faite avec différentes matrices mais la chitosanase immobilisée sur la chitine a montré l'activité enzymatique la plus élevée. D’autres chercheurs ont étudié les effets de diverses conditions sur l'immobilisation des chitosanases et les rendements en oligomères de chitosane produits (Kuroiwa et al., 2002 ; Kuroiwa et al., 2003). Les conditions de réaction pour la production efficace des pentamères et des hexamères ont été étudiées (Kuroiwa et al., 2002). Les auteurs ont rapporté que cela dépendait considérablement de l'enzyme, de la dimension des particules de la matrice d’immobilisation, de la température et de la concentration initiale du substrat. Cependant, comme observé dans beaucoup d'études, l'immobilisation des enzymes n'a pu fournir des résultats prometteurs. La limite principale liée à cette méthode était la faible affinité de l'enzyme immobilisée au substrat comparée à celle de l'enzyme libre.
Après plusieurs tentatives, un système de réacteur à enzyme avec des membranes d'ultrafiltration a été développé pour produire des oligomères de chitosane ayant un degré de polymérisation (DP) plus élevé (Jeon & Kim, 2000a). Ce système pouvait hydrolyser le substrat (chitosane) et produire 11 fois le rendement du réacteur en lots (batch) avec la même quantité d'enzyme. La production des oligomères de chitosane a été efficace et à un coût relativement bas. Le facteur le plus important dans l'utilisation d'un système de réacteur avec des membranes d'ultrafiltration était la maîtrise du taux de perméation. Ce paramètre détermine la taille moléculaire des oligomères de chitosane récupérés comme produit final. Cette approche a été utilisée pour produire des oligomères de chitosane en continu (Kim &Rajapakse, 2005; Jeon & Kim, 2000b). La viscosité de la solution et l'encrassement de la membrane par le substrat (chitosane) accumulé ont été des facteurs limitants au succès de cette approche. Par conséquent, la réduction de viscosité du chitosane avant le traitement du système avec une membrane d’ultrafiltration était une condition requise pour un système de production continu et efficace.
La production continue des oligomères de chitosane a été démontrée faisable avec la combinaison d'un réacteur à colonne avec une enzyme immobilisée et le réacteur avec une membrane d’ultrafiltration (Jeon & Kim, 2000b). Dans la première étape, le chitosane est partiellement hydrolysé par l'enzyme immobilisée dans le réacteur à colonne et le produit est fourni au système avec une membrane d’ultrafiltration pour la séparation des oligomères. Le chitosane partiellement hydrolysé possède une faible viscosité et ne crée pas de problèmes de colmatage des membranes. Cette méthode assure une plus grande productivité par unité d'enzyme, une plus grande capacité à maîtriser la distribution du poids moléculaire du produit final et plus d’efficacité comparée à celles des méthodes décrites précédemment. Ces dernières années, plusieurs chercheurs ont essayé d'améliorer les méthodes enzymatiques pour une production efficace et économique des oligomères de chitosane. Toutefois, peu de méthodes sont actuellement employées pour produire en continu des oligomères avec des poids moléculaires désirés (Zhang et al., 1999; Kuroiwa et al., 2003).
Suite à la diminution de leur degré de polymérisation par hydrolyse, les oligomères de chitosane présentent diverses activités biologiques (Jeon & Kim, 2002; Jeon & Kim, 2001; Jeon et al., 2001; Jeon & Kim, 2000a; Jeon et al., 2000; Nam et al., 1999; Shahidi et al., 1999; Muzzarelli, 1996; Shahidi & Synowiecki, 1991; Hirano et Nagao, 1989) et sont utilisables dans de nombreux domaines tels que la biotechnologie, le bio-pharmaceutiques, le bio-alimentaire, ainsi que dans l’industrie émergente des nutraceutiques.
L'activité antimicrobienne des oligomères de chitosane contre plusieurs espèces bactériennes a été démontrée et est considérée en tant qu'une des propriétés les plus importantes liées directement à leurs applications biologiques possibles. L'activité antibactérienne de ces composés est influencée par un certain nombre de facteurs tels que le degré de polymérisation (Park et al., 2004a,b; Park et al., 2002; Yun et al., 1999), le degré de déacétylation (Chung et al., 2004; Tsai et al., 2002) et le type de micro-organisme (Gerasimenko et al., 2004; Park et al., 2004a,b; Uchida et al., 1989).
Le mécanisme antibactérien des oligomères de chitosane serait lié à leurs groupes aminés présents dans leurs structures. Le nombre de ces groupes aminés s'est avéré jouer un rôle important dans l'activité antibactérienne et plusieurs mécanismes ont été proposés pour décrire cette activité (Chen et al., 2002). Le mécanisme le plus admis explique que les oligomères de chitosane peuvent changer les caractéristiques de perméabilité de la membrane microbienne, empêcher l'entrée des nutriments dans la cellule bactérienne ou causer la fuite des constituants cellulaires et ainsi provoquer la mort des bactéries (Choi et al., 2001; Sudharshan et al., 1992). Un autre mécanisme suggéré pour l'activité antibactérienne des oligomères de chitosane serait le blocage de la transcription de l’ARN suite à l'adsorption des oligomères de chitosane sur l’ADN bactérien (Kim et al., 2003). Pour avoir cet effet, le poids moléculaire des oligomères de chitosane est un paramètre important pour permettre la pénétration de ces molécules dans les cellules bactériennes. En outre, une autre explication a été également proposée et consiste en une privation des métaux, des oligoéléments ou des aliments essentiels par action de chélation des oligomères de chitosane. Ceci a comme effet de limiter la croissance des bactéries et par la suite provoquer leur mort.
La nature poly-cationique des oligomères de chitosane leur permet de réagir avec les groupes négativement chargés de mycètes (champignons), montrant de ce fait une activité antifongique sur les moisissures. Le mécanisme d'inhibition des oligomères de chitosane contre les mycètes est également semblable à celui expliqué précédemment sur les bactéries. La formation des complexes de polyélectrolyte entre les oligomères de chitosane et les groupes négativement chargés sur la surface des cellules est directement responsable de l’activité antifongique de ces molécules. Une corrélation existerait entre le nombre de charges sur les oligomères de chitosane et leur distribution avec l’activité antifongique (Hirano & Nagao, 1989). En outre, l'activité antifongique des oligomères de chitosane est plus prononcée à pH acide et à basse température.
Des études ont rapporté que les oligomères de chitosane ont des effets antiviraux dans divers systèmes biologiques. Des activités antivirales et inhibitrices de virus affectant certaines plantes (Pospieszny et a., 1991; Pospreszny & Atabekov, 1989), certains animaux (Bacon et al., 2000; Gama-Sosa et al., 1991) ainsi qu’une activité inhibitrice sur des bactériophages (Kochkina & Chirkov, 2000a,b) ont été rapportées. Le mécanisme d'action antivirale n'est pas clairement identifié. Des observations contradictoires ont été rapportées. Cependant, une explication possible est celle, soutenant que les propriétés cationiques des groupes aminés du chitosane et de ses oligomères peuvent avoir des fonctions additionnelles qui aident à stimuler les systèmes immunitaires des organismes vivants étudiés.
Les oligomères de chitosane auraient aussi un effet anti-tumoral. L’activité biologique des oligomères de chitosane s’exprimerait par un empêchement de la croissance des cellules tumorales suite à des effets de renforcement immunitaire. Les résultats de quelques études relatives à cet aspect suggèrent que l’activité antitumorale observée suite à l’utilisation des oligomères de chitosane n'était pas due à une élimination directe des cellules tumorales. Cette activité anti-tumorale serait due à la plus grande production des lymphokines, menant à la manifestation de l'effet anti-tumoral par la prolifération des lymphocytes cytolytiques (Tokoro et al., 1998). L’activité anti-tumorale des oligomères de chitosane dépend de leurs caractéristiques structurales tels que le degré de déacétylation et le poids moléculaire (Jeon & Kim, 2002). Il a été observé que des oligomères de chitosane produits par un système de réacteur à membrane d'ultrafiltration et ayant un poids moléculaire moyen de 1.5 à 5.5 kDa pouvait empêcher efficacement la croissance de cellules tumorales. De plus, une inhibition allant de 55 à 100% des cellules tumorales a été observée chez des souris après une administration intraveineuse de chitohexaose (hexamère) (Suzuki et al., 1986). Plusieurs autres études suggèrent que les oligomères de chitosane exercent des effets stimulant sur le système immunitaire (Tokoro et al., 1998 ; Nishimura, et al.,1986). Les oligomères de chitosane pourraient aussi exercer leurs activités biologiques suite à leur administration par voie orale. Ainsi, il a été démontré qu’un mélange d’oligomères de chitosane composé de tétramère et de pentamère pourrait empêcher la croissance des cellules tumorales chez des souris après une administration orale (Qin et al., 2002).
L’activité anti-oxydante des oligomères de chitosane a fait l’objet de nombreuses études (Chiang et al, 2000; Park et al., 2003a,b; Yin et al., 2002; Xie et al., 2001; Huang et al., 2005; Guzman et al., 2003). Les degrés de polymérisation et de déacétylation sont les éléments clés de cette activité anti-oxydante. En fait, un poids moléculaire allant de 1 à 3 kDa et un degré de déacétylation de 90% ont été corrélés avec une haute capacité anti-oxydante (Kim & Rajapakse, 2005). La capacité anti-oxydante des oligomères de chitosane pourrait être également liée à leur capacité de chélation des ions Fe2+ (Huang et al., 2005).
Des recherches sur les oligomères de chitosane ont identifié leur potentiel en tant qu’inhibiteur de l'enzyme de converssion de l'angiotensine (ACE) qui joue un rôle important dans la régulation de la tension artérielle. Il a été rapporté que cette activité serait également dépendante du degré de déacétylation (Okamoto et al., 2003 ; Park et al., 2003a). Un effet anti-coagulant des oligomères de chitosane a été également décrit (Park et al., 2004c; Klokkevoid et al., 1999; Hong et al., 1998; Rao & Sharma, 1997). Des études ont souligné la capacité de ces oligomères à régulariser le taux de cholestérol sanguin, (Remunan-Lopez, 1998; Sugano et al., 1988; Muzzarelli, 1997; Tanaka et al., 1997; Kanauchi et al., 1995; Jameela et al., 1994; Maezake et al., 1993).
L’analyse de la littérature scientifique montre que dans toutes les études réalisées sur l’activité biologique des oligomères de chitosane, des mélanges d’oligomères ont été employés et qu’il n’est pas possible de savoir exactement qu’elle fraction a induit activité. Il est donc nécessaire de les séparer pour faire des études avec des fractions pures et non avec des mélanges. Plusieurs méthodes de séparation des oligomères de chitosane sont disponibles.
Plusieurs méthodes analytiques de séparation existent, parmi lesquelles la chromatographie et l’électrophorèse sont les plus performantes.
La chromatographie est une méthode de séparation analytique applicable à des mélanges moléculaires ou ioniques, basée sur des différences de distribution des solutés entre une phase stationnaire, généralement dispersée, et une phase mobile continue. Des solvants sont souvent requis pour avoir le résultat escompté. Ce sont des mélanges de type eau-méthanol, eau-éthanol, eau-acétonitrile). Pour des applications liées aux oligomères de chitosane, la compagnie Shodex ® a développé une colonne basée sur la chromatographie de partage et permet une séparation de mélanges composés de fractions ayant des degrés de polymérisation variant entre 2 et 6. Cette technique fonctionne avec de très petits volumes et nécessite un mélange d’eau et d’acétonitrile comme phase mobile.
L'électrophorèse est une technique analytique de séparation basée sur la mobilité des ions ou de molécules sous l’effet d’un champ électrique externe (O’Connor et al., 1996). Les molécules chargées migrent vers une électrode de signe opposée à leur charge nette. La vitesse de migration de chaque molécule dans un champ électrique est dépendante de sa mobilité électrophorétique. La mobilité électrophorétique est mesurable à l’aide d’appareil de type Zetasizer. Toutefois, la mobilité électrophorétique qui est une propriété intrinsèque de chaque molécule, dépend du poids moléculaire et de la charge nette de la molécule, ainsi que des conditions du milieu tels que le pH et la force ionique.
Le pH affecte la mobilité électrophorétique d’une molécule chargée par le phénomène de protonation et de déprotonation de ses groupes fonctionnels. En fait, quand le pH est égal au point isoélectrique de la molécule, la mobilité électrophorétique de celle-ci s’annule. Lors de l’éloignement du point isoélectrique par l’augmentation ou la diminution du pH, la mobilité de la molécule augmente et celle-ci se déplace alors vers l’anode ou la cathode, dépendamment de sa charge nette. Au pH supérieur au point isoélectrique, une molécule ayant des groupements cationiques et anioniques dans sa chaîne devient chargée négativement, alors qu’elle porte une charge nette positive quand le pH est inférieur au point isoélectrique.
La force ionique du milieu peut affecter la mobilité électrophorétique d’une molécule chargée (Sung et al., 2007). La mobilité électrophorétique diminue à mesure que la force ionique du milieu augmente. Ceci peut s’expliquer par une augmentation du nombre de contre-ions autour de la molécule. En présence d'un champ électrique externe, la molécule chargée se déplace vers l’électrode de signe opposé à sa charge alors que l'atmosphère ionique qui l’entoure et qui est principalement composé de contre-ions se déplace dans la direction opposée. Ces contre-ions peuvent être solvatés et par conséquent, la molécule chargée subit une retardation électrophorétique. Souvent, les valeurs les plus élevées de la mobilité électrophorétique sont obtenues dans l'eau ou dans des milieux aqueux avec une faible force ionique parce que l'effet écran exercé par les contre-ions est plus faible (Mechref et al., 1997; Mechref &El-Rassi, 1997).
Les propriétés électrocinétiques des molécules chargées ont été exploitées et plusieurs méthodes basées sur l’électrophorèse ont été développées.
Le principe de cette technique est relativement simple. Sous le nom électrophorèse de zone, sont regroupées les méthodes dont le principe de séparation est basé sur la différence de mobilité électrophorétique (Roux-de Balmann et al., 1998; Clifton et al., 1990; Clifton, 1993). Ainsi, deux particules de vitesses de migration différentes parcourent des distances différentes en un intervalle de temps donné; elles vont ainsi être localisées dans des zones différentes. Pour la description du principe de l’électrophorèse de zone, nous considérerons une chambre constituée d’un tube capillaire relié aux compartiments cathodique et anodique. Le système tout entier qui comprend les compartiments cathodique et anodique ainsi que la chambre de séparation est remplie avec une solution d’électrolyte, substance saline, acide ou alcaline, qui est utilisée pour conduire le courant électrique et ayant généralement un pouvoir tampon. Un mélange d'espèces anioniques et cationiques est introduit dans le système qui contient la solution d’électrolyte. En général, la concentration de l'électrolyte support est élevée par rapport à celle des espèces ioniques de l'échantillon et permet de maintenir un pH relativement constant et un gradient de potentiel uniforme dans le système. Les espèces ioniques de l'électrolyte ont une certaine mobilité électrophorétique et quand un courant électrique passe à travers le système, ces espèces ioniques migrent avec des vitesses qui dépendent de leurs mobilités électrophorétiques respectives et vers les électrodes de signes opposés à leurs charges. Les cations migrent vers la cathode et les anions vers l'anode. Ainsi, une séparation des molécules est réalisée.
Les substances amphotères (comme les protéines), qui contiennent des groupements fonctionnels basiques et acides dans leurs molécules, ont un point isoélectrique pI, défini comme la valeur du pH à laquelle ils ont une charge nette égale à zéro (Kohlheyer et al., 2006; Knisley & Rodkey, 2005; Biscans et al., 1988). Dans une solution de pH égal au pI, ces substances amphotères ne migrent pas quand elles sont soumises à un champ électrique. Dans une solution ayant une valeur de pH plus élevée, elles perdent des protons et deviennent chargées négativement: elles migreront alors vers l'anode. A pH inferieur au PI, leurs charges seront positives et elles migreront par conséquent vers la cathode. Le principe fondamental de cette technique de séparation est basé sur l’utilisation d’un ensemble de tampons, ce qui permet d’obtenir un gradient de pH dans la chambre de séparation, le plus bas pH étant obtenu à l'anode et le plus haut à la cathode. Quand un mélange de substances amphotères est introduit dans un tel système, toutes les substances acquièrent une charge nette différente selon leur pI et ont ainsi des mobilités électrophorétiques différentes (Curioni et al., 1990). Par exemple, si une substance amphotère est introduite à un pH supérieur à son pI, elle devient négative, et migre vers l'anode, où le pH diminue, et atteint enfin la position où le pH est égal à son pI. A cette position, sa charge nette est nulle et sa vitesse diminue ou devient théoriquement nulle. Par focalisation isoélectrique, toutes les substances dans l'échantillon seront concentrées en des zones étroites (Burgaud et al., 1992; Strickler & Sacks, 1973; Andrews & Fonta, 1985; Jonsson & Rilbe, 1980).
Parmi les différentes techniques électrophorétiques, l’électrophorèse capillaire est la plus élaborée et la plus utilisée dans tous les domaines d’analyse. Elle s’appuie sur les principes de l’électrophorèse de zone et de l’isoélectrofocalisation. L’opération d’électrophorèse est effectuée dans un tube capillaire isolant de très faible diamètre (25 à 100 μm) avec une utilisation de tensions de plusieurs dizaines de milliers de volts. La dispersion calorifique du capillaire est telle qu’il n’y a pas d’échauffement par le passage du courant qui risquerait de créer des perturbations. L’injection de l’échantillon, en très petite quantité, se fait le plus souvent par aspiration. Le capillaire doit être rigoureusement thermostaté, car la vitesse, comme la diffusivité, dépend fortement de la viscosité du milieu qui elle est dépendante de la température. En électrophorèse capillaire, le capillaire étant rempli d’un tampon de pH constant. Les molécules chargées positivement en milieu acide, vont vers la cathode, les anions restent bloqués dans le réservoir. Le phénomène inverse se produit avec des pH basiques, si la polarité des électrodes est inversée.
Bien que les différentes méthodes de séparation basées sur l’application de l’électrophorèse soient efficaces du point de vue analytique, il reste tout de même qu’elles présentent des inconvénients liés principalement à la séparation de très petits volumes et à l’utilisation de solutions tampon. Ceci rend leur application limitée pour une production à grande échelle et plus encore pour des applications bio-alimentaires, d’où la nécessité de développer d’autres outils de séparation.
Plusieurs procédés de séparation sont utilisés en biotechnologie et dans l’industrie alimentaire, parmi lesquels les procédés baro-membranaires, électro-baro-membranaires et électromembranaires.
Le principe de la filtration baro-membranaire consiste à faire circuler un liquide parallèlement à une membrane. Ceci est aussi appelé une séparation baro-membranaire de type tangentiel (Nawaz et al., 2006). Il existe également un autre type de filtration baro-membranaire. Il s’agit de la filtration frontale dans laquelle le liquide à traiter est pressé contre la membrane (Pignon et al., 2000). Dans les deux cas, sous l’effet de la pression, le liquide se sépare en deux phases: le perméat et le rétentat. La nature des éléments qui traversent la membrane dépend de leur poids moléculaire et du seuil de coupure de la membrane. Lors de l’ultrafiltration, seules les petites molécules passent à travers la membrane dont les diamètres des pores varient entre 0,l et 0,001 μ . De toute évidence, dans un procédé baro-membranaire, il est impossible de séparer des molécules dont les poids moléculaires ne sont pas très diffèrents. Ceci est avant tout lié au fait que le seuil de coupure d’une membrane n’est qu’une moyenne nominale et que la vraie distribution des tailles de pores peut être très variable (Lapointe et al., 2003; Oussedik & Mameri, 2001). Nawaz et al. (2006) avait étudié la séparation de polyphénols de raisins avec une membrane d’ultrafiltration dans un procédé baro-membranaire. Les poids moléculaires variaient entre 164.2 et 1160 Da. Les auteurs ont rapporté que toutes les fractions de polyphénols avaient traversé la membrane. Toutefois, il n’y a pas de données disponibles sur l’application de ce type de procédé de séparation sur les oligomères de chitosane.
Les procédés électro-baro-membranaires ont été développés pour résoudre les problèmes liés à la polarisation de la concentration et à l’encrassement des membranes (Lapointe et al., 2003). Bien que ces précédés aient contribué à améliorer les performances des systèmes de séparation membranaires, il reste tout de même que la séparation de molécules ayant des poids moléculaires proches les uns des autres est quasi impossible. En utilisant un procédé d’électro-nanofiltration, il a été possible de séparer des peptides selon leur caractères anionique, neutre ou cationique (Lapointe et al., 2005; Lapointe et al., 2003). Toutefois, les fractions séparées n’ont pas été distinguées par le poids moléculaire. La présence d’un gradient de pression ne permet pas de séparer des molécules ayant des tailles proches les unes des autres. De même que les procédés baro-membranaires, il n’y a pas d’information sur l’utilisation de procédés électro-baro-membranaires pour la séparation d’oligomères de chitosane.
Ce sont des procédés de séparation basés sur le couplage du principe de l’électrophorèse induit par l’effet d’un champ électrique externe et de barrières moléculaires (membranes poreuses). Les procédés électromembranaires sont basés sur plusieurs paramètres, qui déterminent leurs performances, productivités et sélectivités. Parmi ces paramètres, on retrouve la membrane, le champ électrique, le débit des solutions et la configuration cellulaire.
L’efficacité de tout procédé membranaire dépend en partie de la performance de la membrane utilisée (Zeng & Ruckenstein, 1997; Zeng & Ruckenstein, 1996). Des études portant sur les peptides ont démontré que le taux de transport pouvait être amélioré en augmentant le seuil de coupure de la membrane (Bargeman et al., 2002a,b). En effet, une membrane avec un seuil de coupure de 10 kDa offrait un taux de transport trois fois plus faible qu’une membrane de 25 kDa (Bargeman et al; 2002a). Ceci a été expliqué par une plus grande friction dans le cas de la membrane de 10 kDa. Ce seuil de coupure est approximativement trois fois plus grand que la taille des peptides utilisés dans l’étude en question. En utilisant des membranes avec un seuil de coupure supérieur à 25 kDa, la friction des peptides avec la membrane serait plus faible et le le taux de transport a été amélioré mais n’a pas été proportionnel à l’augmentation du seuil de coupure de la membrane (Bargeman et al; 2002a). D’un autre côté, il a été démontré que le materiau utilisé pour la fabrication de la membrane déterminait les interactions avec les protéines en solutions et par conséquent leur vitesse de migration (Liu et al., 1997). La surface effective de la membrane pourrait également permettre d’augmenter les rendements des procédés d’électroséparation (Galier & Roux-de Balmann, 2005; Galier & Roux-de Balmann, 2002). À l’heure actuelle, il n’y a pas de données disponibles concernant les oligomères de chitosane.
Le champ électrique est un paramètre clé d’un système électromembranaire (Kappler & Posten, 2007; Sadrzadeh et al., 2007). Appliqué aux acides aminés, peptides et protéines, le champ électrique, force motrice des procédés d’électroséparation, a eu un impact majeur sur leurs taux de migration. En électro-microfiltration, le transport de la lysine avait baissé de 2 fois en diminuant le voltage de 40 à 20 V, lors d’un procédé de séparation de la lysine et de la leucine (Bargeman et al, 2000). Dans une autre étude, une augmentation de la différence de potentiel entre les électrodes de 40 à 60 V, a permis une augmentation de la concentration de peptides issus d’un hydrolysat de caséine αs2 dans le perméat avec un facteur de 1.4 fois (Bargeman et al, 2002b). Des études ont démontré qu’une augmentation de la valeur de voltage avait entraîné une augmentation de la vitesse de migration de différentes molécules chargées (Galier & Roux-de Balmann, 2002, Galier & Roux-de Balmann, 2004; Van Nunen, 1997). Cependant, il existe une valeur de courant limite, qui, une fois dépassée, n’a plus d’influence positive sur le taux de migration des molécules (Van Nunen, 1997; Liu et al., 1996).
Plusieurs études ont porté sur l’effet du débit des solutions sur le taux d’électromigration de molécules (Sadrzadeh et al., 2007). Pour une électroséparation d’un mélange de protéines, cinq valeurs de débit variant entre 20 et 160 mL/h de la solution contenant le mélange à séparer ont été étudiées (Liu et al., 1996). L’analyse sur l’effet du débit n’avait montré aucune différence significative sur le taux d’électromigration des protéines vers le perméat. Van Nunen (1997) rapporte que les variations du débit influencent le procédé d’électrophorèse membranaire et que l’augmentation du débit de la solution à traiter a permis d’augmenter la valeur du courant limite et de retarder ainsi son atteinte. Par conséquent, le flux protéique a été amélioré (Van Nunen, 1997). Le débit influence également le temps de résidence dans la chambre de séparation et pourrait avoir pour l’effet d’augmenter le taux d’électromigration des molécules en permettant à la molécule d’atteindre la surface de la membrane et ainsi la penetrer (Galier & de Balmann, 2004).
Un système de séparation électromembranaire est un empilement en parallèle de plusieurs compartiments séparés par des membranes échangeuses d’ions et poreuses qui agissent comme barrières moléculaires (Poulin, 2007). L’empilement des compartiments définit la configuration de la cellule entière d’électroséparation. Le positionnement des membranes échangeuses d’ions par rapport aux électrodes détermine les zones de concentrations d’anions et de cations. La conductivité d’une solution dans un compartiment donné dépend du type de membranes qui le forment et de leurs positionnements par rapport aux électrodes. Un cas pourrait favoriser la concentration d’espèces ioniques dans un compartiment; ce qui fait augmenter la conductivité électrique de la solution qui s’y trouve. Un autre cas pourrait favoriser un dessalement; ce qui conduit à une baisse de la conductivité électrique du compartiment en question. Toutes ces modifications de la configuration modifient l’efficacité du procédé exprimé par la quantité d’électricité consommée par unité de temps. La configuration de la cellule d’électroséparation pourrait favoriser l’acidification ou la basification d’une solution dans un compartiment dépendament si les ions H+ et OH- sont retenus dans le compartiment ou non. Des études sur la séparation de peptides avec un procédé électro- baro-membranaire en utilisant différentes membranes avec des seuils de coupure allant de 104 à 105 Da ont montré que le type de configuration utilisée pour séparer ces molécules chargées avait eu un effet à la fois sur les taux de migration des molécules et la performance du procédé entier (Bargeman et al, 2002a; Van Nunen, 1997). Dans l’étude de Bargeman et al. (2002a), une configuration de type [Anode-Membrane cationique-MUF-Membrane anionique-Cathode] a été utilisée.
Plusieurs procédés électromembranaires ont été développés pour la séparation de mélanges de molécules organiques chargées pour différentes utilisations en biotechnologie, dans l’industrie bio-alimentaire et des nutraceutiques. Parmi les procédés électromembranaires, les contacteurs à membrane, la technologie Gradiflow et l’électrodialyse avec membrane d’ultrafiltration (EDUF) sont les plus prometteurs.
Les contacteurs à membrane sont une nouvelle technologie d’électroséparation. La cellule de séparation ou de purification est composée de quatre compartiments. Deux compartiments pour les solutions anodique et cathodique pour permettre le passage du courant électrique. Deux autres compartiments ont été conçus pour une re-circulation de la solution à traiter et de la solution de récupération. Ces deux compartiments sont délimités par une membrane poreuse. Cette membrane agit en tant que contacteur entre les deux solutions entre lesquels un transfert de matière a lieu. Dans le compartiment de récupération, une solution d'électrolyte est re-circulée à l'aide d'une pompe centrifuge. La force motrice de ce système de séparation est un champ électrique externe appliqué aux électrodes dans un sens perpendiculaire à l'écoulement des solutions. Les électrodes sont séparées des deux autres compartiments par des membranes échangeuses d’ions (anioniques ou cationiques). Une fois le champ électrique appliqué aux électrodes, les molécules chargées contenues dans la solution d'alimentation migrent vers le compartiment de récupération à travers la membrane poreuse. Le passage de molécules chargées à travers la membrane poreuse dépend alors de leurs mobilités électrophorétiques et de leurs poids moléculaires. Des solutés ayant des mobilités électrophorétiques distincts traversent alors la membrane à des vitesses différentes. Selon la configuration du système, celui-ci pourrait être utilisé pour favoriser la migration de molécules chargées positivement (Figure 2.3), de molécules chargées négativement (Figure 2.4). Un procédé de séparation et de purification de molécules biologiques à l’aide d’un contacteur à membrane a été rapporté et a été utilisée avec succès pour séparer et purifier des solutions mixtes d'acide Poly-L-Glutamique, α- lactalbumine et de l’albumine du sérum bovin (BSA) (Galier & Roux-de Balmann, 2004).
Les systèmes de séparation de type contacteurs à membrane ont une limite importante qui rend leur application à grande echelle difficile. Ceci est principalent lié aux faibles volumes traités et aux débits des solutions qui réduisent ainsi la productivité de cette technologie. Dans le contacteur à membrane utilisé par Galier et Roux-de Balmann. (2004), le système a été utilisé avec un débit des solutions de 1.66 mL/min (100 mL/h) Dans le travail rapporté par Liu et al., (1996), le débit utilisé variait entre 0.33 et 2.66 mL/min (20 à 160 mL/h).
GradiflowTM est une marque de commerce d’une technologie de séparation basée sur l’électrophorèse (Rothemund et al., 2002; Righetti et al., 1997). Ce système de purification et de séparation de protéines est basé sur la charge électrique et le poids moléculaire des molécules. Cette technique est conçue pour séparer des protéines ainsi que le dessalement du produit final. Dans la technologie de séparation électromembranaire, une solution tampon est généralement utilisée pour stabiliser le pH du milieu et de permette ainsi une meilleure efficacité du procédé. Des membranes poreuses de polyacrylamide sont utilisées dans ce système d'électroséparation. Des membrane avec des seuils de coupure allant de 5000 à 106 Da sont utilisées (Ogle et al., 2003). Des molecules comme l’albumin du serum bovine (BSA) (67 000 Da), l’ovalbumin (45 000 Da) et le lactalbumin (14 700 Da) ont été utilisées. Des anti-corps monoclonaux et polyclonaux ont été purifiés avec la technologie GradiflowTM (Cheung et al., 2003).
En analysant les détails des paramètres utilisés dans la technologie GradiflowTM, on s’aperçoit qu’un débit des solutions de 10 mL/min (600 mL/h) a été utilisé pour obtenir les performances rapportées par les auteurs mentionnés en haut (Rothemund et al., 2002; Righetti et al., 1997; Horvath et al, 1994). Un fonctionnement avec de tels débits ne permet pas de traiter des quantités importantes de solutions. Par conséquent, ces faibles volumes sont une limite sérieuse à une application de cette technologie à plus grande échelle.
Cette technologie d’électroséparation combine l'électrodialyse conventionnelle avec des membranes d'ultrafiltration de différents seuils de coupure. Une ou plusieurs membranes d'ultrafiltration sont empilées dans une cellule d'électrodialyse. La solution à traiter et la solution de récupération sont continuellement circulées dans leurs compartiments respectifs à l'aide de pompes centrifuges. Sous l'effet d'un champ électrique externe appliqué aux électrodes, les molécules chargées migrent à travers la membrane d'ultrafiltration vers l'électrode de signe opposé. Dépendamment de la configuration du système d’électrodialyse avec membrane d’ultrafiltration (EDUF), une séparation de molécules chargées positivement ou négativement pourrait être favorisée. Dans ce cas, une seule membrane d'ultrafiltration pourrait être empilée dans la cellule. Il est également possible de réaliser une séparation simultanée. Dans ce cas, deux membranes d'ultrafiltration sont empilées dans la cellule d'électrodialyse avec membrane d’ultrafiltration (EDUF) (Figure 2.5). Cette technologie a été utilisée pour la séparation de polyphénols de tabac (Bazinet et al., 2005b,c), de catéchines de thé vert (Labbé et al., 2005; Labbé & Bazinet, 2006). Elle a été également utilisée pour une séparation simultanée d’un hydrolysat trypsique de la β-lactoglobuline (Poulin, 2007 ; Poulin et al., 2006a,b).
La technologie de séparation basée sur l’électrodialyse avec membrane d’ultrafiltration permet l’utilisation d’un débit pouvant aller de quelques millilitres jusqu’à plusieurs litres/min. Elle permet également de traiter de gros volumes. Des cellules de différentes tailles sont disponibles commercialement et sont faciles à utiliser (Poulin, 2007; Poulin et al., 2006a; Labbé & Bazinet, 2006).
Figure 2.3: Représentation schématique d’un contacteur à membrane combiné avec une membrane poreuse pour la migration de molécules chargées positivement.
Figure 2.4: Représentation schématique d’un contacteur à membrane combiné avec une membrane poreuse pour la migration de molécules chargées négativement.
Figure 2.5: Représentation schématique d’une cellule d’électrodialyse combinée avec deux membranes poreuses pour une séparation simultanées de molécules neutres, de molécules chargées positivement et de molécules chargées négativement.
En se basant sur les inconvénients des technologies de type contactreurs à membrane et du GradiflowTM, et en considérant les avantages offerts par l’électrodialyse avec membrane d’ultrafiltration (EDUF), cette dernière a été choisie pour la réalisation du présent projet.
© Mohammed Aider, 2007
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| Chapitre 1: Introduction générale |  | Chapitre 3: Hypothèse et objectifs |
